實驗研究目的與實驗設計

(R1+PHF6*)、tau275-305 (PHF6*+R2) 和 tau281-311 (R2+PHF6) (圖 1.13)，我們用 PIMAX 系統表達 p-tau 並純化，將 p-tau 和 Thioflavin S (ThS) 共同培養，因 為 ThS 的特性和 Thioflavin T (ThT) 相似，會和澱粉樣纖維結合而發出螢光 (fluoresence) (Khurana, Coleman et al. 2005)，故藉由偵測螢光訊號來觀測澱粉樣纖 維的生成 (圖 1.14)，成功取得 p-tau 纖維之後，用超音波震動器 (sonicator) 將 p-tau 纖維打碎成許多小片段，這些小片段當成種晶 (seed)，看是否能加速以上這

些胜肽形成澱粉樣纖維，基於之前的纖維結構研究，我們預期 p-tau 纖維片段只 能 協 助 含 有 ³⁰⁶VQIVYK³¹¹ 的 胜 肽 形 成 澱 粉 樣 纖 維 ， 即 是 p-tau 只 對 含 有

306VQIVYK³¹¹ 序列之胜肽有種晶效應。

圖 1.12 種晶效應示意圖。

圖中藍線代表培養 protein 形成澱粉樣纖維時，隨著時間會有愈來愈多 protein 聚 集長成澱粉樣纖維，並達到最大值；紅線代表加入 seed 一起培養，則會加快澱粉 樣纖維生成的速度。

圖 1.13 實驗設計的五種胜肽。

實驗設計所合成的胜肽序列。

圖 1.14 ThS 實驗示意圖。

利用 ThS 會和澱粉樣纖維結合並發出螢光的特性來偵測澱粉樣纖維的生成。

p-tau 種晶 tau 種晶

275VQIINK²⁸⁰ - +

306VQIVYK³¹¹ + +

tau244-280 (R1+PHF6*) - +

tau275-305 (PHF6*+R2) - +

tau281-311 (R2+PHF6) + +

表 1.3 種晶實驗結果預測表。

表格中的 「+」 代表種晶可以促使胜肽形成纖維；「-」 代表種晶不能促使胜肽形 成纖維。我們的假說認為 p-tau 會利用 ³⁰⁶VQIVYK³¹¹ 堆疊形成神經纖維糾結，而 不是 ²⁷⁵VQIINK²⁸⁰，因此推測 p-tau 種晶只能促使含有 ³⁰⁶VQIVYK³¹¹ 片段的胜 肽形成纖維；tau 種晶則可以促使含有 ²⁷⁵VQIINK²⁸⁰ 和 ³⁰⁶VQIVYK³¹¹ 片段的胜 肽形成纖維。

(二)了解不同位點的轉譯後修飾是否對 tau 形成澱粉樣纖維有所影響，前人有 許多 tau 的轉譯後修飾對結構特性的研究都是把可能發生轉譯後修飾的胺基酸以 別 的 胺 基 酸 取 代 ， 例 如 K → Q, S (T) → A 或 E 等 (Rodríguez-Martín, Cuchillo-Ibáñez et al. 2013, Gorsky, Burnouf et al. 2016)。我們用固相合成的方式可以 直接合成帶有轉譯後修飾的胜肽，上述提到我們合成了五種胜肽，其中三種較長 序列的 tau244-280 (R1+PHF6*)、tau275-305 (PHF6*+R2) 和 tau281-311 (R2+PHF6) 之中，有些位點在神經細胞中可能會被修飾，像是 Ser262 和 Ser289 具有磷酸化，

(三)設計胜肽抑制物 (peptide inhibitor) 來干擾 p-tau 堆疊形成澱粉樣纖維，

之前我們實驗室對 Aβ 胜肽抑制物的研究，我們發現在 Aβ 胜肽的核心區域 Aβ(25-35) 的 N 端接上八個 Arg，得到的 R8-Aβ(25-35) 可以抑制 Aβ 堆疊形成 澱粉樣纖維 (Cheng, Chen et al. 2017)。仿照這個設計原理，再根據目前對 tau 纖 維結構的研究，我們初步以 PHF6 和 PHF6 兩個形成澱粉樣纖維的核心區域為基 礎來設計胜肽抑制物，我們將 ²⁷⁵VQIINK²⁸⁰ 及 ³⁰⁶VQIVYK³¹¹ 的 N 端接上八個 Arg，並再接上一個 Cys，供後續實驗可以進行螢光染劑的標記，這兩種胜肽抑制 物稱 為 R8-VQIINK 和 R8-VQIVYK (圖 1.17)，期 望得到的 R8-VQIINK 或 R8-VQIVYK 胜肽抑制物會利用 VQIINK 或 VQIVYK 片段和 tau 或 p-tau 中的

275VQIINK²⁸⁰ 或 ³⁰⁶VQIVYK³¹¹ 堆疊，並透過八個 Arg 帶有的高度正電荷來干預 其他 tau 或 p-tau 分子繼續堆疊上去，以達到干擾 tau 或 p-tau 堆疊的能力，期 望可以減緩 tau 或 p-tau 纖維對神經細胞造成的傷害 (圖 1.18)。

圖 1.17 胜肽抑制物的設計。

將 ²⁷⁵VQIINK²⁸⁰ 及 ³⁰⁶VQIVYK³¹¹ 的 N 端接上八個 Arg 作胜肽抑制物，希望有 抑制 tau 堆疊的效果。

圖 1.18 胜肽抑制物實驗設計示意圖。

胜肽抑制物會和 tau 或 p-tau 用來堆疊形成纖維的核心區域結合，並藉由正電荷 來干擾其他其他 tau 或 p-tau 分子繼續堆疊，藉此阻止、減緩 tau 或 p-tau 纖維 的生成。

R8-VQIINK R8-VQIVYK

275VQIINK²⁸⁰ + -

306VQIVYK³¹¹ - +

tau244-280 (R1+PHF6*) + -

tau275-305 (PHF6*+R2) + -

tau281-311 (R2+PHF6) - +

tau + +

p-tau - +

表 1.4 胜肽抑制物實驗結果預測表。

第二章 材料與方法 30% (v/v) Acrylamide / Bis-acrylamide (37.5:1) Sigma

Acetic acid Sigma

Acetic anhydride Honeywell

Acetonitrile (ACN) Fisher chemical

Agar AMRESCO

Agarose AMRESCO

Ammonium persulfate (APS) Sigma

Ampicillin Bioshop

Anti-Tau-1, clone PC1C6 antibody Merck Bovine serum albumin (BSA) Sigma

Bromophenol blue AMRESCO

Coomassie brilliant blue Sigma Dichloromethane (DCM) Honeywell Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma

Dithiothreitol (DTT) AMRESCO