第三章 結果
3.4 聚集測試
3.4.3 tau 胜肽
在 tau 胜肽的部分，我們使用秤重的方法來配製五種 tau 胜肽的樣品使其濃 度為 200 μM，並和 aggregation buffer 及 ThT 均勻混合，調配濃度為 50 μM tau 胜肽和 20 μM ThT 的樣品，同時準備另一組含有 50 μM tau 胜肽、12.5 μM heparin 和 20 μM ThT 的樣品，並進行 aggregation test，在測試之前，先測量只含有 aggregation buffer 和 ThT 以及多了 heparin 的控制組，結果螢光訊號皆沒增加 (圖 3.45)，接著對胜肽進行測試，由結果來看這五種 tau 胜肽在不加 heparin 的 條件下都不能自發性地形成纖維，而加了 heparin 的情況下則全部都有螢光訊號 的上升 (圖 3.46)，隨即我們將含有 heparin 的樣品點在 grid 上並進行負染色，
再利用 TEM 取像，可以看到許多絲線狀的澱粉樣纖維 (圖 3.47)。
圖 3.45 利用螢光光譜儀測的只含 aggregation buffer 和 heparin 的控制組。
縱軸為螢光訊號，橫軸為時間，藍線代表培養前的螢光訊號，紅線代表培養 24 小 時後的螢光訊號，24 小時後螢光訊號沒有增加。左圖為含有 aggregation buffer 和 ThT 的樣品。右圖為含有 aggregation buffer、heparin 和 ThT 的樣品。
(A) Ac-275VQIINK280-NH2
(B) Ac-306VQIVYK311-NH2
(C) tau244-280 (R1+PHF6*)
(D) tau275-305 (PHF6*+R2)
(E) tau281-311 (R2+PHF6)
圖 3.46 使用螢光光譜儀測的 tau 胜肽 aggregation test。
縱軸為螢光訊號，橫軸為波長，每一項的左圖為沒有 heparin 的組別，右圖則為 含有 heparin 的組別，藍線代表培養前的螢光訊號，紅線、綠線、橘線和紫線分 別代表培養 2、4、6、21 小時後的螢光訊號。(A) 50 μM Ac-275VQIINK280-NH2。 (B) 50 μM Ac-306VQIVYK311-NH2。(C) 50 μM tau244-280 (R1+PHF6*)。(D) 50 μM tau275-305 (PHF6*+R2)。(E) 50 μM tau281-311 (R2+PHF6)。
(A) Ac-275VQIINK280-NH2 (B) Ac-306VQIVYK311-NH2
(C) tau244-280 (R1+PHF6*) (D) tau275-305 (PHF6*+R2)
(E) tau281-311 (R2+PHF6)
圖 3.47 tau 胜肽纖維的 TEM 照片。
使 用 TEM 觀察到的 tau 胜肽纖維。 (A) Ac-275VQIINK280-NH2， 放大倍率為 19500X 。 (B) Ac-306VQIVYK311-NH2， 放 大 倍 率 為 19500X 。 (C) tau244-280 (R1+PHF6*)，放大倍率為 15000X。(D) tau275-305 (PHF6*+R2)，放大倍率為 19500X。(E) tau281-311 (R2+PHF6)，放大倍率為 19500X。比例尺皆為 100 nm。
接著我們使用帶有一個磷酸根的 tau244-280 w/ pSer262 進行測試，和相同序 列但不帶有磷酸根的 tau244-280 (R2+PHF6*) 一起做測試，從質譜圖來看，
tau244-280 w/ pSer262 的純度並不高，有一些磷酸根從胜肽上掉下來，比例約為 3:1，因此我們使用三種濃度來進行三重複測試，分別為 50 μM、100 μM 及 150 μM，
觀察多一個磷酸根修飾是否會改變該段胜肽形成纖維的能力 (圖 3.48)，由結果來 看並沒有差別，都不會自發性地形成纖維。
(A) 50 μM tau244-280 (R2+PHF6*)
(B) 100 μM tau244-280 (R2+PHF6*)
(C) 150 μM tau244-280 (R2+PHF6*)
(D) 50 μM tau244-280 w/ pSer262
(E) 100 μM tau244-280 w/ pSer262
(F) 150 μM tau244-280 w/ pSer262
圖 3.48 使用螢光光譜儀測的帶有修飾的 tau 胜肽 aggregation test。
縱軸為螢光訊號，橫軸為波長，在三種濃度下進行三重複測試，藍線代表培養前 的螢光訊號，紅線、綠線、橘線代表培養 24、43、46 小時之後的螢光訊號。(A) 50 μM tau244-280 (R2+PHF6*)。(B) 100 μM tau244-280 (R2+PHF6*)。(C) 150 μM tau244-280 (R2+PHF6*)。(D) 50 μM tau244-280 w/ pSer262。(E) 100 μM tau244-280 w/ pSer262。(F) 150 μM tau244-280 w/ pSer262。
3.4.4 種晶效應
由先前的實驗結果，我們可以知道在 50 μM 的濃度下，五種 tau peptide 都 不會自發性地形成纖維，因此我們使用這個濃度來進行種晶效應的測試。我們將
上清液及種晶分別用水稀釋 100 倍並測量其吸收光譜，用以確認種晶已不含 RNA，由結果來看只有上清液在 254 nm 有吸光值 (圖 3.49)，代表種晶不含 RNA。
(A) (B)
圖 3.49 p-tau 種晶製備過程中的上清液及種晶進行全波長的吸光值測量圖。
縱軸為吸光值，橫軸為波長。(A) 第一次離心後的上清液。在 UV257nm 有訊號，
代表此樣品中含有 RNA。(B) 種晶。沒有訊號，代表不含 RNA。
接著我們將上清液使用 SDS-PAGE 進行分析，計算上清液中還存在多少的 p-tau / tau，即可用初始濃度減去上清液 p-tau / tau 濃度得到種晶濃度 (圖 3.50)，
因此就知道要加入多少量的種晶。我們使用 50 μM 的五種胜肽進行測試，和種晶 混合使其最後樣品含有 50 pmole 的種晶，樣品中含有 20 μM 的 ThT 且最終體 積為 100 μl，使用螢光光譜儀進行測量，由結果來看 p-tau 種晶可以使這五種胜 肽都形成纖維 (圖 3.51) 而 tau 種晶則不行 (圖 3.52)，結果和我們原先預想的不 同。
圖 3.50 製備種晶時的上清液的 SDS-PAGE 圖。
膠片上由左至右為 marker、(A) tau 離心後的上清液、(B) p-tau 離心後的上清液，
綠色框線為濃度 0.2 / 0.4 / 0.6 / 0.8 mg/ml 的 BSA。依照 BSA 的濃度來為上清液 中殘留的 tau / p-tau 進行定量。
(A) Ac-275VQIINK280-NH2 (B) Ac-306VQIVYK311-NH2
(C) tau244-280 (R1+PHF6*) (D) tau275-305 (PHF6*+R2)
(E) tau281-311 (R2+PHF6)
圖 3.51 使用螢光光譜儀測的 p-tau 種晶效應。
縱軸為螢光訊號，橫軸為波長，藍線代表培養前的螢光訊號，紅線、綠線、橘線 和紫線代表培養 3、18、25、42 小時候的螢光訊號。(A) 50 μM Ac-275VQIINK280-NH2
+ p-tau seed。(B) 50 μM Ac-306VQIVYK311-NH2 + p-tau seed。(C) 50 μM tau244-280 (R1+PHF6*) + p-tau seed。(D) 50 μM tau275-305 (PHF6*+R2) + p-tau seed。(E) 50 μM tau281-311 (R2+PHF6) + p-tau seed。
(A) Ac-275VQIINK280-NH2 (B) Ac-306VQIVYK311-NH2
圖 3.52 使用螢光光譜儀測的 tau 種晶效應。
縱軸為螢光訊號，橫軸為波長，藍線代表培養前的螢光訊號，紅線和綠線代表培 養 4 小時和 23 小時後的螢光訊號。(A) 50 μM Ac-275VQIINK280-NH2 + tau seed。
(B) 50 μM Ac-306VQIVYK311-NH2 + tau seed。
3.4.5 胜肽抑制物
首先我們使用了兩種不同的濃度測試設計的兩種胜肽抑制物是否會自己形成 澱粉樣纖維，使用 50 μM 的濃度進行測試，而且同時做了另外一組含有 heparin 的 組別，同樣使用 20 μM ThS 當作螢光染劑，在 37℃ 環境下進行培養，由結果來 看不管有沒有加入 heparin，這兩種胜肽抑制物都不會形成纖維 (圖 3.53)。
(A) R8-VQIINK
(B) R8-VQIVYK
接著我們另外培養了一組濃度為 100 μM 且沒有加 heparin 的組別，並在培 養 24 小時前後以圓二色光譜儀測量，觀察在培養前後的二級結構有無變化，從 圖形來看兩者之間並沒有差別 (圖 3.54)，主要的結構皆為無規則線圈 (random coil)，代表培養前後的主要二級結構並沒有改變，和先前的螢光結果相應，設計的 兩種胜肽抑制物皆不會形成纖維。
(A) R8-VQIINK
(B) R8-VQIVYK
圖 3.54 使用圓二色光譜儀測量胜肽抑制物的二級結構。
縱軸為橢圓率，橫軸為波長，各組左圖為培養前的圖譜；右圖則為培養後的圖譜。
(A) R8-VQIINK。(B) R8-VQIVYK。
確認了胜肽抑制物不會自己形成纖維後，隨即先將合成的五種胜肽進行測試，
五種胜肽樣品的濃度為 50 μM，其中含有 12.5 μM heparin 以及 20 μM ThT，再 加入 50 μM 的胜肽抑制物，使用螢光光譜儀觀察是否有抑制效果，原本有含 heparin 會促使纖維的形成，加了胜肽抑制物後就沒有螢光訊號的增加，因此不論 是哪一種胜肽抑制物皆對這五種胜肽有抑制效果 (圖 3.55)。
(A) Ac-275VQIINK280-NH2
(B) Ac-306VQIVYK311-NH2
(C) tau244-280 (R1+PHF6*)
(D) tau275-305 (PHF6*+R2)
(E) tau281-311 (R2+PHF6)
圖 3.55 使用螢光光譜儀測量胜肽抑制物對五種胜肽的抑制效果。
縱軸為螢光訊號，橫軸為波長，各組左圖為加入 R8-VQIINK 共同培養的組別，
右圖則為加入 R8-VQIVYK 的組別，藍線代表培養前的螢光訊號，紅線、綠線和 橘線代表培養 3、16、27 小時後的螢光訊號。(A) Ac-275VQIINK280-NH2。(B) Ac-306VQIVYK311-NH2。(C) tau244-280 (R1+PHF6*)。(D) tau275-305 (PHF6*+R2)。
(E) tau281-311 (R2+PHF6)。
最後，我們使用微量盤螢光分光光譜儀測試含有 RNA 的 p-tau 及含有 heparin 但不含 RNA 的 tau 是否也能被胜肽抑制物抑制，使用的 p-tau / tau 濃度 皆為 10 μM，tau 的組別加入 2.5 μM heparin，兩組皆含有 20 μM ThS，和 20 μM 兩種胜肽抑制物共同培養 24 小時，三重複實驗的結果顯示該兩種胜肽抑制物對 p-tau 沒有抑制效果，但對 tau 有抑制效果 (圖 3.56)。
(A) p-tau w/ RNA + R8-VQIINK
(B) p-tau w/ RNA + R8-VQIVYK
(C) tau w/o RNA + heparin + R8-VQIINK
(D) tau w/o RNA + heparin + R8-VQIVYK
圖 3.56 利用微量盤螢光分光光譜儀測量胜肽抑制物對含有 RNA 的 p-tau 及 含有 heparin 但不含 RNA 的 tau 的抑制效果。
縱軸為螢光訊號，橫軸為時間，藍線、紅線、綠線代表三重複。(A) 10 μM p-tau w/
RNA + 20 μM R8-VQIINK。(B) 10 μM p-tau w/ RNA + 20 μM R8-VQIVYK。(C) 10 μM tau w/o RNA + 2.5 μM heparin + 20 μM R8-VQIINK。(D) 10 μM tau w/o RNA + 2.5 μM heparin + 20 μM R8-VQIVYK。
第四章 討論
並可能導致樣品品質較差而影響後續培養成纖維的表現，因此後來我們就沒有繼
也有可能是因為處理種晶樣品的差異導致種晶的品質不好，才造成實驗的結果有 誤。
圖 4.1 種晶實驗統整圖。
我們合成了一條帶有磷酸化修飾的胜肽，雖然純度並不高，但因為時間上還
p-tau 種晶 tau 種晶
第五章 未來展望
避免這些修飾的基團從胜肽上掉下來導致純度降低。最後在胜肽抑制物的方面，
從結果來看有可能只是抑制了 heparin 的作用，之後可以再合成其他種胜肽抑制 物進行測試，像是先前提到可以改變 8 個 Arg 的位置，可能對 p-tau 就有抑制 效果。建立 p-tau 的系統就可以進行不同抑制物的測試，若在 in vitro 實驗中有 抑制效果，隨即就可以進行細胞實驗，測試抑制物是否在細胞中依然有抑制效果 而且不會對細胞產生毒性，期望未來能找到可以當作治療阿茲海默症或是減緩病 情的藥物以協助眾多的病患並減輕社會負擔。
參考文獻
Alonso, A., T. Zaidi, M. Novak, I. Grundke-Iqbal and K. Iqbal (2001).
"Hyperphosphorylation induces self-assembly of tau into tangles of paired helical filaments/straight filaments." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98(12): 6923-6928.
Ballard, C., S. Gauthier, A. Corbett, C. Brayne, D. Aarsland and E. Jones (2011).
"Alzheimer's disease." The Lancet 377(9770): 1019-1031.
Belostozky, A., M. Richman, E. Lisniansky, A. Tovchygrechko, J. H. Chill and S.
Rahimipour (2018). "Inhibition of tau-derived hexapeptide aggregation and toxicity by a self-assembled cyclic d, l-alpha-peptide conformational inhibitor." Chemical Communications 54(47): 5980-5983.
Berchtold, N. C. and C. W. Cotman (1998). "Evolution in the conceptualization of dementia and Alzheimer's disease: Greco-Roman period to the 1960s." Neurobiology of Aging 19(3): 173-189.
Biernat, J., N. Gustke, G. Drewes, E. M. Mandelkow and E. Mandelkow (1993).
"Phosphorylation of Ser262 strongly reduces binding of tau to microtubules: distinction between PHF-like immunoreactivity and microtubule binding." Neuron 11(1): 153-163.
Biernat, J., Y.-Z. Wu, T. Timm, Q. Zheng-Fischhöfer, E. Mandelkow, L. Meijer and E.-M.
Mandelkow (2002). "Protein kinase MARK/PAR-1 is required for neurite outgrowth and establishment of neuronal polarity." Molecular Biology of the Cell 13(11): 4013-4028.
Bourré, G., F.-X. Cantrelle, A. Kamah, B. Chambraud, I. Landrieu and C. Smet-Nocca (2018). "Direct crosstalk between O-GlcNAcylation and phosphorylation of tau protein investigated by NMR spectroscopy." Frontiers in Endocrinology 9: 595-595.
Bulic, B., M. Pickhardt, E. M. Mandelkow and E. Mandelkow (2010). "Tau protein and tau aggregation inhibitors." Neuropharmacology 59(4-5): 276-289.
Burns, A. and S. Iliffe (2009). "Alzheimer's disease." British Medical Journal 338: b158.
Carlomagno, Y., D.-E. C. Chung, M. Yue, M. Castanedes-Casey, B. J. Madden, J. Dunmore, J. Tong, M. DeTure, D. W. Dickson, L. Petrucelli and C. Cook (2017). "An acetylation-phosphorylation switch that regulates tau aggregation propensity and function." The Journal of Biological Chemistry 292(37): 15277-15286.
Cheng, Y. S., Z. T. Chen, T. Y. Liao, C. Lin, H. C. Shen, Y. H. Wang, C. W. Chang, R. S. Liu, R.
P. Chen and P. H. Tu (2017). "An intranasally delivered peptide drug ameliorates cognitive decline in Alzheimer transgenic mice." EMBO Molecular Medicine 9(5):
703-715.
Cho, J.-H. and G. V. Johnson (2003). "Glycogen synthase kinase 3β phosphorylates tau at both primed and unprimed sites differential impact on microtubule binding." Journal of Biological Chemistry 278(1): 187-193.
Chun, W. and G. V. Johnson (2007). "The role of tau phosphorylation and cleavage in neuronal cell death." Frontiers in Bioscience 12: 733-756.
Cohen, T. J., J. L. Guo, D. E. Hurtado, L. K. Kwong, I. P. Mills, J. Q. Trojanowski and V. M.
Lee (2011). "The acetylation of tau inhibits its function and promotes pathological tau aggregation." Nature Communications 2: 252.
Cook, C., Y. Carlomagno, T. F. Gendron, J. Dunmore, K. Scheffel, C. Stetler, M. Davis, D.
Dickson, M. Jarpe, M. DeTure and L. Petrucelli (2014). "Acetylation of the KXGS motifs in tau is a critical determinant in modulation of tau aggregation and clearance." Human Molecular Genetics 23(1): 104-116.
Daebel, V., S. Chinnathambi, J. Biernat, M. Schwalbe, B. Habenstein, A. Loquet, E.
Akoury, K. Tepper, H. Müller, M. Baldus, C. Griesinger, M. Zweckstetter, E. Mandelkow, V.
Vijayan and A. Lange (2012). "β-Sheet core of tau paired helical filaments revealed by solid-state NMR." Journal of the American Chemical Society 134(34): 13982-13989.
Ferrer, I., G. Santpere and F. W. van Leeuwen (2008). "Argyrophilic grain disease." Brain
Fichou, Y., M. Vigers, A. K. Goring, N. A. Eschmann and S. Han (2018). "Heparin-induced tau filaments are structurally heterogeneous and differ from Alzheimer's disease filaments." Chemical Communications 54(36): 4573-4576.
Fitzpatrick, A. W. P., B. Falcon, S. He, A. G. Murzin, G. Murshudov, H. J. Garringer, R. A.
Crowther, B. Ghetti, M. Goedert and S. H. W. Scheres (2017). "Cryo-EM structures of tau filaments from Alzheimer's disease." Nature 547(7662): 185-190.
Funk, K. E., S. N. Thomas, K. N. Schafer, G. L. Cooper, Z. Liao, D. J. Clark, A. J. Yang and J.
Kuret (2014). "Lysine methylation is an endogenous post-translational modification of tau protein in human brain and a modulator of aggregation propensity." The Biochemical Journal 462(1): 77-88.
Goedert, M. and R. Jakes (1990). "Expression of separate isoforms of human tau protein: correlation with the tau pattern in brain and effects on tubulin polymerization." EMBO Journal 9(13): 4225-4230.
Goedert, M., R. Jakes, Z. Qi, J. H. Wang and P. Cohen (1995). "Protein phosphatase 2A is the major enzyme in brain that dephosphorylates tau protein phosphorylated by proline-directed protein kinases or cyclic AMP-dependent protein kinase." Journal of Neurochemistry 65(6): 2804-2807.
Goedert, M., M. Spillantini and R. Crowther (1991). "Tau proteins and neurofibrillary degeneration." Brain Pathology 1(4): 279-286.
Gong, C. X., S. Shaikh, J. Z. Wang, T. Zaidi, I. Grundke-Iqbal and K. Iqbal (1995).
"Phosphatase activity toward abnormally phosphorylated tau: decrease in Alzheimer disease brain." Journal of Neurochemistry 65(2): 732-738.
Gorsky, M. K., S. Burnouf, J. Dols, E. Mandelkow and L. Partridge (2016). "Acetylation mimic of lysine 280 exacerbates human tau neurotoxicity in vivo." Scientific Reports 6:
Inouye, H., D. Sharma, W. J. Goux and D. A. Kirschner (2006). "Structure of core domain of fibril-forming PHF/tau fragments." Biophysical Journal 90(5): 1774-1789.
Johnson, G. V. and W. H. Stoothoff (2004). "Tau phosphorylation in neuronal cell function and dysfunction." Journal of Cell Science 117(Pt 24): 5721-5729.
Kampers, T., P. Friedhoff, J. Biernat, E. M. Mandelkow and E. Mandelkow (1996). "RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments." FEBS Letters 399(3): 344-349.
Khurana, R., C. Coleman, C. Ionescu-Zanetti, S. A. Carter, V. Krishna, R. K. Grover, R. Roy and S. Singh (2005). "Mechanism of thioflavin T binding to amyloid fibrils." Journal of Structural Biology 151(3): 229-238.
Kolarova, M., F. Garcia-Sierra, A. Bartos, J. Ricny and D. Ripova (2012). "Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease." International Journal of Alzheimer's Disease 2012: 731526.
KrishnaKumar, V. G. and S. Gupta (2017). "Simplified method to obtain enhanced expression of tau protein from E. coli and one-step purification by direct boiling."
Preparative Biochemistry and Biotechnology 47(5): 530-538.
Ksiezak-Reding, H., W.-K. Liu and S.-H. Yen (1992). "Phosphate analysis and dephosphorylation of modified tau associated with paired helical filaments." Brain
Ksiezak-Reding, H., W.-K. Liu and S.-H. Yen (1992). "Phosphate analysis and dephosphorylation of modified tau associated with paired helical filaments." Brain