第二章 材料與方法
2.1 材料
2.1.5 tau/p-tau 質體 (plasmid)
鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳 （sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE） 時使用，若沒有當日使用，則放在去離子蒸餾水中，保存在 4℃ 冰 箱。
2.1.7 實驗儀器
(1) 紫外光可見光分光光譜儀 Beckman Coulter DU-800 spectrophotometer 測量菌液及蛋白質濃度
(2) 螢光光譜儀 JASCO FP-750 spectrophotometer 測量樣品有無澱粉樣纖維生成
(3) 微量冷凍離心機 KUBOTA 3520 centrifuge 純化時用以沉澱不要的蛋白質及沉澱澱粉樣纖維
(4) 離心機 Beckman Coulter AllegraTM X-12R centrifuge 搭配濃縮離心管來濃縮蛋白質及置換緩衝溶液 (buffer)
(5) 高速離心機 Beckman Coulter Avanti J-20/Avanti J-25/Avanti J-26XP centrifuge 使菌液沉澱
(6) 超音波細胞打碎機 Hielscher UP200H ultrasonic homogenizer 打碎細菌使蛋白質釋出；製備種晶
(7) 超音波洗淨器 Branson 3510 製備種晶
(8) 加熱型單槽乾浴器 Major Science MD-01N Genius Dry Bath Incubator 用以加熱樣品
(9) 迴轉式振盪器 Orbital Shaker OS701 使樣品均勻混合
(10) 快速蛋白液相層析儀 Fast Performance Liquid Chromatography (FPLC)
使用的管柱為 HiLoad 16/60 Superdex 200 gel-filtration column，純化 tau 及 p-tau
(12) 微量盤螢光分光光譜儀 Gemini EM Microplate Spectorfluorometer 監測澱粉樣纖維的生成
(13) 胜肽合成儀 PS3TM peptide synthesizer (Protein Technologies, Inc.) 合成胜肽
(14) 冷凍乾燥機 Uniss FDM-20 Manifold Freeze Dryer 將急速冷凍的胜肽抽乾成粉末
(15) 基質輔助雷射脫附游離－時間式飛行質譜儀 Bruker AutoFlex III smartbeam TOF/TOF200 Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (中央研究院分子生物研究所質譜室設施)
(19) 安全電泳膠觀察箱 YOU-LUM SKY-A2BOX 觀察瓊脂膠體 (agarose gel)
(20) 圓二色光譜儀 JASCO J-815 Circular dichroism spectroscopy 測量胜肽二級結構
的 LB 培養基，在 37℃ 培養箱中以 230 rpm 轉速培養約 4-5 小時使其在 600 nm 的吸光值 (optical density, OD) 達到 0.3-0.4，此時加入異丙基-β-D-硫代半乳糖 苷 (Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside, IPTG) 使其濃度為 0.1 mM，用以誘導 細菌開始表現 tau / p-tau，並繼續培養 2 小時，培養結束後在 4℃ 下以轉速 6000 PMSF、1 mM EDTA、0.2 mM orthovanadate 和 1 錠 Roche protease inhibitor，混 合均勻後將菌液靜置在 30℃ 培養箱 45 分鐘，每 10 分鐘輕微搖晃試管，接著
mM NaCl 且 pH 值為 7.4 的 FPLC 溶液 (FPLC buffer)，再進行一次離心，並重 複此步驟兩次，使最後體積小於 2 ml，將此樣品打入 FPLC 儀器中，利用 HiLoad 16/60 Superdex 200 gel-filtration column 分離不同大小分子量的蛋白質以達到純化 目的，使用 FPLC buffer 沖提 (elute) 約 400 分鐘，流速設定為 0.3 ml/min，依
2.2.2 胜肽合成
實驗中用到的所有胜肽都是以 PS3 胜肽合成儀合成的，並且使用固相聚醯胺 合成法 (solid-support fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-polyamide) 進行合成，制備 的 原 料 包 含 N 端 帶 有 Fmoc 保 護 基 的 胺 基 酸 衍 生 物 、 當 作 載 體 的 Wang resin/Rink amide resin 和作為催化劑的 HCTU，三者之間的比例為 0.4 mmole：0.1 mmole：0.4 mmole。在合成過程中，前一個胺基酸 N 端上的 Fmoc 會先被移除， (activation reagent, ACT)：4.45% (v/v) NMM、25% (v/v) DMSO、70.55% DMF，依 照下列表格設計的反應步驟來進行胜肽的合成。
9 DEP 15 分鐘 2 去除胺基酸 N 端 Fmoc 制由酸催化的 methionine 氧化反應 (acid-catalyzed methionine oxidation)，並且除 去 cysteine 上的三苯甲基 (trityl group) 側鏈保護基，而 TIS 的功能為避免胺基 酸侧鏈上的保護基在進行切除反應時所產生的陽離子又接回去原來的位置，接著 用過濾的方式分離胜肽與 resin，並用冷卻的 MTBE 將胜肽析出，在 4℃ 下以轉 速 10000 g 離心 15 分鐘使胜肽沉澱，倒掉 MTBE 後重複同樣的步驟兩次，藉 此清洗掉殘留再樣品中的切除反應試劑，最後利用真空乾燥器將樣品抽乾去除 MTBE，即可得到粗製的胜肽粉末 (crude peptide powder)。
2.2.3 胜肽純化與鑑定
2.2.4 西方墨點法 (western blot)
止酵素反應，並用 Zip-tip 吸附經酵素剪切過後的胜肽片段，以 50% acetonitrile 沖 aggregation buffer，將要測試的樣品和不同量的 aggregation buffer 混合，配製不同 濃度的樣品，並加入螢光染劑 ThS 使其濃度為 20 μM，每一個樣品總體積為 30 μl，
2.2.9 種晶的製備
將含有 p-tau 纖維的樣品以轉速 20000 g 離心 60 分鐘使纖維沉澱，接著取 出上清液並加入 100 μl 的水，擾動使纖維懸浮以清洗，以同樣條件去離心並取出 上清液，加入 40 μl 的水並擾動使纖維懸浮，使用超音波細胞打碎機去打斷纖維，
用 1 mm 的微探針以 20% 強度且週期為 0.6 秒的條件進行去使其形成種晶，每 進行 5 秒即休息 5 秒以免樣品過熱，總共進行 100 秒，最後將第一次離心取出 的上清液拿去進行 SDS-PAGE 用以定量 seed 的濃度；tau 的種晶則是使用超音 波洗淨器製備，在冰浴中震 30 分鐘即完成。
2.2.10 以場發射槍穿透式電子顯微鏡觀察 fibril 的圖像
先將 10 μl 的樣品滴到 300 目數銅製網格片 (300-mesh copper grid) 的碳面 上並靜置 3 分鐘，利用濾紙吸去液體後，再把 10 μl 的 1% 醋酸鈾 (uranyl acetate, UA) 滴到網格片上靜置 15-60 秒，同樣使用濾紙吸去液體，最後將網格片放入防 潮箱靜置一晚，隔天即可上機觀察樣品。
第三章 結果
圖 3.1 純化 tau 的 SDS-PAGE 圖。
膠片上由左至右為 marker、(A) 誘導表現蛋白前、(B) 誘導表現蛋白後、(C) 破菌 完離心後的上清液、(D) 破菌完離心後的沉澱塊、(E) 加熱完離心後的上清液、(F) 加熱完離心後的沉澱塊。紅色箭頭指的即為 tau。
圖 3.2 加熱完的 tau 樣品稀釋 100 倍進行全波長的吸光值測量圖。
縱軸為吸光值，橫軸為波長。UV280nm 為 0.9742，但在 UV257nm 有一吸收峰，懷 疑樣品中含有核酸汙染。
圖 3.3 tau 和不同量 TEV protease 反應後的 SDS-PAGE 圖。
膠片上由左至右為 (A) 加熱完離心後的上清液、(B)-(G) 加熱完離心後的上清液 加入不同量的 TEV protease。紅色箭頭指出在組別 (G) 中還殘留一點 tau 沒有被 TEV protease 作用。
經過 TEV protease 反應後將樣品濃縮並置換 buffer，再把樣品注入 HiLoad 16/60 Superdex 200 gel-filtration column 中，利用 FPLC 進行純化 (圖 3.4)，收集 50-65 ml 處 (fraction 50-65)，並將收集下來的樣品進行 SDS-PAGE 分析哪些收集 管中含有 tau (圖 3.5)，結果 tau 在 fraction 50-61 之中，將這些 fraction 混合在 一起並濃縮至 1 ml，並再進行一次 SDS-PAGE 查看純化是否正確 (圖 3.6)，在 tau 的 band 下方還有一些雜 band，可能為 tau 的降解產物。
圖 3.4 tau 經 HiLoad 16/60 Superdex 200 gel-filtration column 純化結果圖。
縱軸為吸光值，橫軸為毫升，藍線代表 UV280nm、紅線代表 UV254nm、 綠線代表 UV215nm。以 FPLC buffer 沖提 120 ml，收集 50-65 ml 的樣品，但 UV254nm 的訊 號異常的高，推測樣品中有核酸汙染，和先前全光譜吸光值測量的結果相應。
圖 3.5 收集下來的樣品 SDS-PAGE 圖。
膠片上由左至右為 marker、(A)-(K) 分別為 fraction 50-62。可以看到 tau 位於 fraction 50-61 之中。
圖 3.6 將 FPLC fraction 集中並濃縮後的 tau SDS-PAGE 圖。
(A) 為濃縮後的 tau，含有一些雜 band，推測為 tau 的降解產物。
為了降低 tau 的降解，我們參考一篇論文採用直接煮沸法 (directly boil method)，省略破菌的步驟，將菌塊加入 lysis buffer 之後直接利用加熱 20 分鐘，
再放在冰上冷卻 10 分鐘，隨即在 4℃ 下以轉速 13000 g 離心並取上清液，用此 方法同時破菌和純化 (KrishnaKumar and Gupta 2017)，隨即利用 SDS-PAGE 確認 破菌效果及純化效率 (圖 3.7)，把結果和之前先利用 lysozyme 和超音波來破菌的 效果比較，確實減少了 tau 的降解，但這種直接煮沸法的破菌效果並沒有比較好。
圖 3.7 用直接煮沸法同時破菌並純化 tau 的 SDS-PAGE 圖。
為了改善直接煮沸法會導致破菌效果較低的情形，我們決定同時利用液態氮
RNA，而且在加了 RNase 處理過後，螢光訊號的條帶往低分子量的地方移動了，
而使用 DNase 處理的樣品卻沒有變化，代表樣品中含有的核酸汙染來源是 RNA。
圖 3.9 鑑定 tau 樣品中是否含有核酸汙染的 agarose gel 圖。
膠片上由右至左為 marker、tau、被 DNase 處理過後的 tau、被 RNase 處理過後 的 tau，且 marker 由上至下為分子量由大到小。由 tau 表現的螢光訊號代表樣品 含有核酸汙染，綜合 DNase / RNase 處理的結果，可推論樣品含有的是 RNA。
為了去除 RNA，我們嘗試使用 HiTrap CM Sepharose FF 陽離子交換樹脂管柱 來去除 RNA，tau 經冷凍破菌法和直接加熱法初步純化，並由 TEV protease 處理，
接著將樣品注入 HiTrap CM Sepharose FF 陽離子交換樹脂管柱，流速設定為 1 ml/min，一開始使用 FPLC buffer 沖提 25 分鐘，之後使用含 500 mM NaCl、20 mM Tris 且 pH 值為 7.4 的高鹽 buffer 沖提 75 分鐘，並調整梯度在前 40 分鐘 由 0 % 拉至 100 %，利用高濃度的 Na+ 和 tau 競爭使 tau 從帶有負離子的樹脂
成功被去除，接著測量其吸收光譜，發現在 UV257nm 的強訊號消失了，並在
UV275nm 處有些微訊號 (圖 3.13)，代表 RNA 確實被移除了。除去了 RNA 之後，
我們將樣品濃縮並再次利用 HiLoad 16/60 Superdex 200 gel-filtration column 進行 純化，而得到一個沒有 RNA 訊號的吸收峰 (圖 3.14)，將此吸收峰的樣品濃縮並 利用 SDS-PAGE 進行分析，證實了樣品中確實是沒有 RNA 的 tau (圖 3.15)，在 樣品中加入 glycerol 即可放在 -80℃ 中保存。確定了純化步驟後，我們在後續以 同樣的純化步驟來純化 p-tau。
圖 3.10 tau 經 HiTrap CM Sepharose FF 陽離子交換樹脂管柱純化結果圖。
縱軸為吸光值，橫軸為毫升，藍線代表 UV280nm、紅線代表 UV254nm、 綠線代表
UV215nm。以 FPLC buffer 和高鹽 buffer 沖提 100 ml，經過管柱純化後可以得到
兩個吸收峰，前者為吸收峰一；後者為吸收峰二，利用 SDS-PAGE 分析可以知道 哪一個為 tau。
圖 3.11 將 tau 經 HiTrap CM Sepharose FF 陽離子交換樹脂管柱純化後收集 的兩個吸收峰進行 SDS-PAGE 分析圖。
膠片上由左至右為吸收峰一、吸收峰二，可以看出吸收峰一中不具有蛋白質，推 測可能為 RNA，而吸收峰二則是 tau。
圖 3.12 將 tau 經 HiTrap CM Sepharose FF 陽離子交換樹脂管柱純化後收集 的兩個吸收峰進行 agarose gel electrophoresis 分析圖。
膠片上由右至左為 marker、吸收峰二、吸收峰一。吸收峰一帶有螢光訊號而吸收 峰二沒有，代表吸收峰一中含有 RNA，而吸收峰二中的 tau 已不帶有 RNA。
圖 3.13 HiTrap CM Sepharose FF 陽離子交換樹脂管柱純化後的 tau 進行全波 長的吸光值測量圖。
縱軸為吸光值，橫軸為波長。原本很高的 UV257nm 峰值消失了，只有 UV220nm 有 吸收峰，且 UV275nm 有一點點吸收，因為 tau 含有 Tyr，此圖證明了樣品中含有 沒受核酸汙染的蛋白質。
圖 3.14 去除 RNA 的 tau 經 HiLoad 16/60 Superdex 200 gel-filtration column 純化結果圖。
縱軸為吸光值，橫軸為毫升，藍線代表 UV280nm、紅線代表 UV254nm、 綠線代表
UV215nm。以 FPLC buffer 沖提 120 ml，主要的吸收峰為 tau。
圖 3.15 純化完成的 tau 的 SDS-PAGE 圖。
以改良後的方法來純化 tau，可以減少降解並去除 RNA。
3.2 p-tau 的製備
我們使用和純化 tau 一樣的方法來進行純化。在利用細菌表現 p-tau 之後，
依照冷凍破菌法、直接煮沸法、TEV protease 處理、通過兩種管柱的順序來進行 純化，純化後使用濃縮離心管濃縮並加入 glycerol 儲存在 -80℃ 環境中保存，並 在每一個純化步驟後保留約 20 μl 的樣品，用 SDS-PAGE 來檢驗每一個純化步驟 之後，樣品是否含有 p-tau，並在最後使用 BSA 來定量 tau 的濃度。
首先使用細菌表達 p-tau，接著將 pellet 溶在 lysis buffer 中並利用冷凍破菌
首先使用細菌表達 p-tau，接著將 pellet 溶在 lysis buffer 中並利用冷凍破菌