tau

有了 p-tau 的經驗，我們隨即將 tau 依照原始的純化方法來重新純化，即是 依序使用破菌、煮沸、TEV protease 處理、通過管柱的順序來進行純化，破菌完 後煮沸樣品，並加入 TEV protease 反應，再利用 HiLoad 16/60 Superdex 200 gel-filtration column 純化 (圖 3.37)，收集 45-66 ml，並由 SDS-PAGE 觀察哪些 收下來的收集管含有 tau (圖 3.38)，將 tau 收集起來並濃縮，最後加入 glycerol 即 完成純化，並再次進行 SDS-PAGE 確認純化的步驟是否正確並同時用 BSA 定量 (圖 3.39)，由結果來看經純化後的樣品確實含有 tau，而且降解的產物比之前來的 少，推測是純化的手法比較熟練且純化的時間較之前來的短。

圖 3.37 tau 經 HiLoad 16/60 Superdex 200 gel-filtration column 純化結果圖。

縱軸為吸光值，橫軸為毫升，藍線代表 UV280nm、紅線代表 UV254nm、 綠線代表

UV_215nm。以 FPLC buffer 沖提 120 ml，收集 45-66 ml 處的樣品。

圖 3.38 收集下來的樣品 SDS-PAGE 圖。

膠片上由左至右為 marker、(A)-(K) 分別為 fraction 45-65。可以看到 tau 位於 fraction 51-59 之中。

圖 3.39 純化 tau 的 SDS-PAGE 圖。

膠片上由左至右為 marker、(A) 誘導表現蛋白前、(B) 誘導表現蛋白後、(C) 破菌 完離心後的上清液、(D) 加熱完離心後的上清液、(E) TEV protease 處理後、(F) 純 化完成的 tau，綠色框線為濃度 0.2 / 0.4 / 0.6 / 0.8 mg/ml 的 BSA。經純化後可以 得到純的 tau，依 BSA 來為 tau 進行定量，以此次為例則得到 18.3 μM 而量為 778 μl 的 tau。

純化並定量好 tau 之後，將 aggregation buffer、ThS 和 tau 均勻混合，因為 樣品不夠的緣故而無法用 10 μM tau，故調配成濃度為 9 μM tau 和 20 μM ThS 的 組別，同時準備另一組樣品含有 9 μM tau、2.25 μM heparin 和 20 μM ThS，因為 tau 要形成澱粉樣纖維必須有 heparin 的幫助，在測量之前，我們同樣先使用只含 有 aggregation buffer、heparin 和 ThS 的控制組進行測試，結果螢光訊號沒有上 升 (圖 3.40)，接著比較 tau 兩組來觀察是否在 aggregation test 有不一樣的結果 (圖 3.41)，由結果來看沒有加 heparin 的組別增加的螢光訊號反而比有加 heparin 的組別高一點，但增加的幅度不大，很難判定有無形成纖維。

圖 3.40 利用微量盤螢光分光光譜儀測的只含有 buffer、heparin 和 ThS 而不 含蛋白質樣品的控制組。

縱軸為螢光訊號，橫軸為時間，藍線、紅線和綠線代表三重複，培養 24 小時。

經過 24 小時，螢光訊號沒有增加。

(A) tau w/ RNA

(B) tau w/ RNA + heparin

圖 3.41 利用微量盤螢光分光光譜儀測的有含 RNA 的 tau aggregation test。

縱軸為螢光訊號，橫軸為時間，藍線、紅線和綠線代表 9 μM tau w/ RNA 三重複，

培養 24 小時，(A) 9 μM tau w/ RNA；(B) 9 μM tau w/ RNA + heparin。

我們隨即用沒有 RNA 的 tau 樣品進行測試，使用的濃度為 10 μM tau，一樣 分成不含 heparin 的控制組及含 2.5 μM heparin 的實驗組進行測試 (圖 3.42)，結 果含 heparin 的組別螢光增加的幅度很大，推測有 tau 纖維的形成，因此我們懷 疑 heparin 是否和 RNA 有交互作用而影響纖維的形成。

(A) tau w/o RNA

(B) tau w/o RNA + heparin

圖 3.42 利用微量盤螢光分光光譜儀測的不含 RNA 的 tau aggregation test。

縱軸為螢光訊號，橫軸為時間，藍線、紅線和綠線代表 10 μM tau w/o RNA 三重

我們也有將 tau / p-tau 用西方墨點法分析，證實樣品中的蛋白質確實是 tau / p-tau 蛋白，結果樣品中確實含有 tau / p-tau (圖 3.43)，但會有許多的降解產物，

即使在 SDS-PAGE 圖上看不出來。

圖 3.43 tau / p-tau 的西方墨點法。

利用西方墨點法分析樣品中是否含有 tau / p-tau，紅色箭頭處即是 tau / p-tau。使 用的抗體為 Anti-Tau-1, clone PC1C6 antibody。

我 們 也 使 用 動 態 光 散 射 測 量 p-tau 的 粒 徑 大 小 ， 蒐 集 經 HiLoad 16/60 Superdex 200 gel-filtration column 純化後的樣品並進行量測，此時樣品還未加入甘 油也還未濃縮，樣品所處的溶液為 100 mM NaCl、20 mM Tris 且 pH 為 7.4，測 量後得到平均粒徑大小約為 7 nm，代表我們純化後的 p-tau 還沒有聚集形成較大 的聚分子 (圖 3.44)。

圖 3.44 以動態光散射測量 p-tau 粒徑大小。

用動態光散射測量 p-tau 的粒徑約為 7 nm。