抑制 tau 形成澱粉樣纖維的方法

TLKIVW 的抑制物，經實驗後發現該抑制物無法有效抑制 tau 形成澱粉樣纖維；

針對 ²⁷⁵VQIINK²⁸⁰ 則是設計了序列為 DVQMINKKRK (MINK)、DVWMINKKRK (W-MINK)、DVQWINKKRK (WINK) 等抑制物，其中發現 W-MINK 可以有效抑 制 tau 形成澱粉樣纖維，因此提出 ²⁷⁵VQIINK²⁸⁰ 對於 tau 纖維的形成有較大的影 響 (Seidler, Boyer et al. 2018)。有研究則是選用 D – 式 (D-form) 的胜肽抑制物來 進行測試 (Sievers, Karanicolas et al. 2011)，或是合成出環狀的胜肽抑制物用以抑制 胜肽纖維的形成 (Zheng, Liu et al. 2011)；也有其他研究設計了同時含有 D – 式和

胜肽抑制物名稱 抑制目標序列 結果 參考文獻

1.8 神經纖維糾結的結構對於阿茲海默症之關聯性 Northfield et al. 2016, Seidler, Boyer et al. 2018)，期盼可以阻止神經纖維糾結的生成，

以減緩神經細胞受到的危害。

306VQIVYK³¹¹ 片段去堆疊形成澱粉樣纖維 (Fitzpatrick, Falcon et al. 2017)，因此現 今對於 tau 究竟是用哪個片段去堆疊還需要透過更多實驗去驗證，除了能幫助我 們更加了解 tau 的結構之外，也協助研發針對結構去干擾 tau 堆疊的藥物。

1.9 實驗研究目的與實驗設計 (R1+PHF6*)、tau275-305 (PHF6*+R2) 和 tau281-311 (R2+PHF6) (圖 1.13)，我們用 PIMAX 系統表達 p-tau 並純化，將 p-tau 和 Thioflavin S (ThS) 共同培養，因 為 ThS 的特性和 Thioflavin T (ThT) 相似，會和澱粉樣纖維結合而發出螢光 (fluoresence) (Khurana, Coleman et al. 2005)，故藉由偵測螢光訊號來觀測澱粉樣纖 維的生成 (圖 1.14)，成功取得 p-tau 纖維之後，用超音波震動器 (sonicator) 將 p-tau 纖維打碎成許多小片段，這些小片段當成種晶 (seed)，看是否能加速以上這

些胜肽形成澱粉樣纖維，基於之前的纖維結構研究，我們預期 p-tau 纖維片段只 能 協 助 含 有 ³⁰⁶VQIVYK³¹¹ 的 胜 肽 形 成 澱 粉 樣 纖 維 ， 即 是 p-tau 只 對 含 有

306VQIVYK³¹¹ 序列之胜肽有種晶效應。

圖 1.12 種晶效應示意圖。

圖中藍線代表培養 protein 形成澱粉樣纖維時，隨著時間會有愈來愈多 protein 聚 集長成澱粉樣纖維，並達到最大值；紅線代表加入 seed 一起培養，則會加快澱粉 樣纖維生成的速度。

圖 1.13 實驗設計的五種胜肽。

實驗設計所合成的胜肽序列。

圖 1.14 ThS 實驗示意圖。

利用 ThS 會和澱粉樣纖維結合並發出螢光的特性來偵測澱粉樣纖維的生成。

p-tau 種晶 tau 種晶

275VQIINK²⁸⁰ - +

306VQIVYK³¹¹ + +

tau244-280 (R1+PHF6*) - +

tau275-305 (PHF6*+R2) - +

tau281-311 (R2+PHF6) + +

表 1.3 種晶實驗結果預測表。

表格中的 「+」 代表種晶可以促使胜肽形成纖維；「-」 代表種晶不能促使胜肽形 成纖維。我們的假說認為 p-tau 會利用 ³⁰⁶VQIVYK³¹¹ 堆疊形成神經纖維糾結，而 不是 ²⁷⁵VQIINK²⁸⁰，因此推測 p-tau 種晶只能促使含有 ³⁰⁶VQIVYK³¹¹ 片段的胜 肽形成纖維；tau 種晶則可以促使含有 ²⁷⁵VQIINK²⁸⁰ 和 ³⁰⁶VQIVYK³¹¹ 片段的胜 肽形成纖維。

(二)了解不同位點的轉譯後修飾是否對 tau 形成澱粉樣纖維有所影響，前人有 許多 tau 的轉譯後修飾對結構特性的研究都是把可能發生轉譯後修飾的胺基酸以 別 的 胺 基 酸 取 代 ， 例 如 K → Q, S (T) → A 或 E 等 (Rodríguez-Martín, Cuchillo-Ibáñez et al. 2013, Gorsky, Burnouf et al. 2016)。我們用固相合成的方式可以 直接合成帶有轉譯後修飾的胜肽，上述提到我們合成了五種胜肽，其中三種較長 序列的 tau244-280 (R1+PHF6*)、tau275-305 (PHF6*+R2) 和 tau281-311 (R2+PHF6) 之中，有些位點在神經細胞中可能會被修飾，像是 Ser262 和 Ser289 具有磷酸化，

(三)設計胜肽抑制物 (peptide inhibitor) 來干擾 p-tau 堆疊形成澱粉樣纖維，

之前我們實驗室對 Aβ 胜肽抑制物的研究，我們發現在 Aβ 胜肽的核心區域 Aβ(25-35) 的 N 端接上八個 Arg，得到的 R8-Aβ(25-35) 可以抑制 Aβ 堆疊形成 澱粉樣纖維 (Cheng, Chen et al. 2017)。仿照這個設計原理，再根據目前對 tau 纖 維結構的研究，我們初步以 PHF6 和 PHF6 兩個形成澱粉樣纖維的核心區域為基 礎來設計胜肽抑制物，我們將 ²⁷⁵VQIINK²⁸⁰ 及 ³⁰⁶VQIVYK³¹¹ 的 N 端接上八個 Arg，並再接上一個 Cys，供後續實驗可以進行螢光染劑的標記，這兩種胜肽抑制 物稱 為 R8-VQIINK 和 R8-VQIVYK (圖 1.17)，期 望得到的 R8-VQIINK 或 R8-VQIVYK 胜肽抑制物會利用 VQIINK 或 VQIVYK 片段和 tau 或 p-tau 中的

275VQIINK²⁸⁰ 或 ³⁰⁶VQIVYK³¹¹ 堆疊，並透過八個 Arg 帶有的高度正電荷來干預 其他 tau 或 p-tau 分子繼續堆疊上去，以達到干擾 tau 或 p-tau 堆疊的能力，期 望可以減緩 tau 或 p-tau 纖維對神經細胞造成的傷害 (圖 1.18)。

圖 1.17 胜肽抑制物的設計。

將 ²⁷⁵VQIINK²⁸⁰ 及 ³⁰⁶VQIVYK³¹¹ 的 N 端接上八個 Arg 作胜肽抑制物，希望有 抑制 tau 堆疊的效果。

圖 1.18 胜肽抑制物實驗設計示意圖。

胜肽抑制物會和 tau 或 p-tau 用來堆疊形成纖維的核心區域結合，並藉由正電荷 來干擾其他其他 tau 或 p-tau 分子繼續堆疊，藉此阻止、減緩 tau 或 p-tau 纖維 的生成。

R8-VQIINK R8-VQIVYK

275VQIINK²⁸⁰ + -

306VQIVYK³¹¹ - +

tau244-280 (R1+PHF6*) + -

tau275-305 (PHF6*+R2) + -

tau281-311 (R2+PHF6) - +

tau + +

p-tau - +

表 1.4 胜肽抑制物實驗結果預測表。

第二章 材料與方法 30% (v/v) Acrylamide / Bis-acrylamide (37.5:1) Sigma

Acetic acid Sigma

Acetic anhydride Honeywell

Acetonitrile (ACN) Fisher chemical

Agar AMRESCO

Agarose AMRESCO

Ammonium persulfate (APS) Sigma

Ampicillin Bioshop

Anti-Tau-1, clone PC1C6 antibody Merck Bovine serum albumin (BSA) Sigma

Bromophenol blue AMRESCO

Coomassie brilliant blue Sigma Dichloromethane (DCM) Honeywell Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma

Dithiothreitol (DTT) AMRESCO

Ethanol (EtOH) J. T. Baker Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) MACRON

Fmoc-Ala-OH AnaSpec Inc.

Fmoc-Lys preloaded Wang resin (K-Wang resin) Merck

Fmoc-Lys(Boc)-OH AnaSpec Inc.

Fmoc-Met-OH AnaSpec Inc.

Fmoc-Pro-OH AnaSpec Inc.

Fmoc-Ser preloaded Wang resin (S-Wang resin) Merck Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-OH AgeneMax

Fmoc-Ser(tBu)-OH AnaSpec Inc.

Heparin sodium salt Sigma

Isopropanol J. T. Baker

Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) VWR Life Science

lysozyme AMRESCO

Magnesium sulfate J. T. Baker

Methanol MARCON

Methyl tert-butyl ether (MTBE) MARCON Mini protease inhibitor cocktail tablet Roche N,N-Dimethylformamide (DMF) MARCON N-methylmorpholine (NMM) Alfa Aesar O-(1H-6-Chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-

Protein ladder Thermo Scientific

Rink amide resin Novabiochem

Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma

Sodium orthovanadate Sigma

Sodiun chloride (NaCl) VWR Life Science

SYBR Safe Intitrogen

Tetramethylethylenediamine (TEMED) AMRESCO

Thioflavin S (ThS) Sigma

Thioflavin T (ThT) Sigma

Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar Triisopropylsilane (TIS) Sigma

Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) VWE Life Science

Tryptone Bertec BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL 以希望能增加蛋白質產量，因為 BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL 帶有較多的稀少 tRNA 基因，可以增加其他物種的蛋白質表現量。

2.1.5 tau / p-tau 質體 (plasmid) 鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳 （sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE） 時使用，若沒有當日使用，則放在去離子蒸餾水中，保存在 4℃ 冰 箱。

2.1.7 實驗儀器

(1) 紫外光可見光分光光譜儀 Beckman Coulter DU-800 spectrophotometer 測量菌液及蛋白質濃度

(2) 螢光光譜儀 JASCO FP-750 spectrophotometer 測量樣品有無澱粉樣纖維生成

(3) 微量冷凍離心機 KUBOTA 3520 centrifuge 純化時用以沉澱不要的蛋白質及沉澱澱粉樣纖維

(4) 離心機 Beckman Coulter Allegra^TM X-12R centrifuge 搭配濃縮離心管來濃縮蛋白質及置換緩衝溶液 (buffer)

(5) 高速離心機 Beckman Coulter Avanti J-20/Avanti J-25/Avanti J-26XP centrifuge 使菌液沉澱

(6) 超音波細胞打碎機 Hielscher UP200H ultrasonic homogenizer 打碎細菌使蛋白質釋出；製備種晶

(7) 超音波洗淨器 Branson 3510 製備種晶

(8) 加熱型單槽乾浴器 Major Science MD-01N Genius Dry Bath Incubator 用以加熱樣品

(9) 迴轉式振盪器 Orbital Shaker OS701 使樣品均勻混合

(10) 快速蛋白液相層析儀 Fast Performance Liquid Chromatography (FPLC)

使用的管柱為 HiLoad 16/60 Superdex 200 gel-filtration column，純化 tau 及 p-tau

(12) 微量盤螢光分光光譜儀 Gemini EM Microplate Spectorfluorometer 監測澱粉樣纖維的生成

(13) 胜肽合成儀 PS3^TM peptide synthesizer (Protein Technologies, Inc.) 合成胜肽

(14) 冷凍乾燥機 Uniss FDM-20 Manifold Freeze Dryer 將急速冷凍的胜肽抽乾成粉末

(15) 基質輔助雷射脫附游離－時間式飛行質譜儀 Bruker AutoFlex III smartbeam TOF/TOF200 Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (中央研究院分子生物研究所質譜室設施)

(19) 安全電泳膠觀察箱 YOU-LUM SKY-A2BOX 觀察瓊脂膠體 (agarose gel)

(20) 圓二色光譜儀 JASCO J-815 Circular dichroism spectroscopy 測量胜肽二級結構

的 LB 培養基，在 37℃ 培養箱中以 230 rpm 轉速培養約 4-5 小時使其在 600 nm 的吸光值 (optical density, OD) 達到 0.3-0.4，此時加入異丙基-β-D-硫代半乳糖 苷 (Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside, IPTG) 使其濃度為 0.1 mM，用以誘導 細菌開始表現 tau / p-tau，並繼續培養 2 小時，培養結束後在 4℃ 下以轉速 6000 PMSF、1 mM EDTA、0.2 mM orthovanadate 和 1 錠 Roche protease inhibitor，混 合均勻後將菌液靜置在 30℃ 培養箱 45 分鐘，每 10 分鐘輕微搖晃試管，接著

mM NaCl 且 pH 值為 7.4 的 FPLC 溶液 (FPLC buffer)，再進行一次離心，並重 複此步驟兩次，使最後體積小於 2 ml，將此樣品打入 FPLC 儀器中，利用 HiLoad 16/60 Superdex 200 gel-filtration column 分離不同大小分子量的蛋白質以達到純化 目的，使用 FPLC buffer 沖提 (elute) 約 400 分鐘，流速設定為 0.3 ml/min，依

2.2.2 胜肽合成

實驗中用到的所有胜肽都是以 PS3 胜肽合成儀合成的，並且使用固相聚醯胺 合成法 (solid-support fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-polyamide) 進行合成，制備 的 原 料 包 含 N 端 帶 有 Fmoc 保 護 基 的 胺 基 酸 衍 生 物 、 當 作 載 體 的 Wang resin/Rink amide resin 和作為催化劑的 HCTU，三者之間的比例為 0.4 mmole：0.1 mmole：0.4 mmole。在合成過程中，前一個胺基酸 N 端上的 Fmoc 會先被移除， (activation reagent, ACT)：4.45% (v/v) NMM、25% (v/v) DMSO、70.55% DMF，依 照下列表格設計的反應步驟來進行胜肽的合成。

9 DEP 15 分鐘 2 去除胺基酸 N 端 Fmoc 制由酸催化的 methionine 氧化反應 (acid-catalyzed methionine oxidation)，並且除 去 cysteine 上的三苯甲基 (trityl group) 側鏈保護基，而 TIS 的功能為避免胺基 酸侧鏈上的保護基在進行切除反應時所產生的陽離子又接回去原來的位置，接著 用過濾的方式分離胜肽與 resin，並用冷卻的 MTBE 將胜肽析出，在 4℃ 下以轉 速 10000 g 離心 15 分鐘使胜肽沉澱，倒掉 MTBE 後重複同樣的步驟兩次，藉 此清洗掉殘留再樣品中的切除反應試劑，最後利用真空乾燥器將樣品抽乾去除 MTBE，即可得到粗製的胜肽粉末 (crude peptide powder)。

2.2.3 胜肽純化與鑑定

2.2.4 西方墨點法 (western blot)

止酵素反應，並用 Zip-tip 吸附經酵素剪切過後的胜肽片段，以 50% acetonitrile 沖 aggregation buffer，將要測試的樣品和不同量的 aggregation buffer 混合，配製不同 濃度的樣品，並加入螢光染劑 ThS 使其濃度為 20 μM，每一個樣品總體積為 30 μl，

2.2.9 種晶的製備

將含有 p-tau 纖維的樣品以轉速 20000 g 離心 60 分鐘使纖維沉澱，接著取 出上清液並加入 100 μl 的水，擾動使纖維懸浮以清洗，以同樣條件去離心並取出 上清液，加入 40 μl 的水並擾動使纖維懸浮，使用超音波細胞打碎機去打斷纖維，

用 1 mm 的微探針以 20% 強度且週期為 0.6 秒的條件進行去使其形成種晶，每 進行 5 秒即休息 5 秒以免樣品過熱，總共進行 100 秒，最後將第一次離心取出 的上清液拿去進行 SDS-PAGE 用以定量 seed 的濃度；tau 的種晶則是使用超音 波洗淨器製備，在冰浴中震 30 分鐘即完成。

2.2.10 以場發射槍穿透式電子顯微鏡觀察 fibril 的圖像

先將 10 μl 的樣品滴到 300 目數銅製網格片 (300-mesh copper grid) 的碳面 上並靜置 3 分鐘，利用濾紙吸去液體後，再把 10 μl 的 1% 醋酸鈾 (uranyl acetate, UA) 滴到網格片上靜置 15-60 秒，同樣使用濾紙吸去液體，最後將網格片放入防 潮箱靜置一晚，隔天即可上機觀察樣品。

第三章 結果

圖 3.1 純化 tau 的 SDS-PAGE 圖。

膠片上由左至右為 marker、(A) 誘導表現蛋白前、(B) 誘導表現蛋白後、(C) 破菌 完離心後的上清液、(D) 破菌完離心後的沉澱塊、(E) 加熱完離心後的上清液、(F) 加熱完離心後的沉澱塊。紅色箭頭指的即為 tau。

圖 3.2 加熱完的 tau 樣品稀釋 100 倍進行全波長的吸光值測量圖。

縱軸為吸光值，橫軸為波長。UV_280nm 為 0.9742，但在 UV_257nm 有一吸收峰，懷 疑樣品中含有核酸汙染。

圖 3.3 tau 和不同量 TEV protease 反應後的 SDS-PAGE 圖。

膠片上由左至右為 (A) 加熱完離心後的上清液、(B)-(G) 加熱完離心後的上清液 加入不同量的 TEV protease。紅色箭頭指出在組別 (G) 中還殘留一點 tau 沒有被 TEV protease 作用。

經過 TEV protease 反應後將樣品濃縮並置換 buffer，再把樣品注入 HiLoad 16/60 Superdex 200 gel-filtration column 中，利用 FPLC 進行純化 (圖 3.4)，收集 50-65 ml 處 (fraction 50-65)，並將收集下來的樣品進行 SDS-PAGE 分析哪些收集 管中含有 tau (圖 3.5)，結果 tau 在 fraction 50-61 之中，將這些 fraction 混合在

經過 TEV protease 反應後將樣品濃縮並置換 buffer，再把樣品注入 HiLoad 16/60 Superdex 200 gel-filtration column 中，利用 FPLC 進行純化 (圖 3.4)，收集 50-65 ml 處 (fraction 50-65)，並將收集下來的樣品進行 SDS-PAGE 分析哪些收集 管中含有 tau (圖 3.5)，結果 tau 在 fraction 50-61 之中，將這些 fraction 混合在