首先以不同溫度及培養基的環境下進行菌株生長速率的測定。將所欲 建立的「免疫微脂體-螢光免疫吸附法」最適化以進行菌體檢測極限的測 定。圖 2-1 為本論文的實驗流程圖。實驗將先探討仙人掌桿菌生長的最適 化條件,包含培養基種類 (TSB、NB 及 PCB)及溫度 (30、35、40 及 45℃),

以尋找出可以產生最短世代時間的培養條件。繼之將「免疫微脂體-螢光免 疫吸附法」最適化以達到最佳的偵測靈敏度,分別對 96 孔微量盤及免疫 微脂體做適當的參數調整。在對 96 孔微量盤做最適化的調整中,包含(1) 捕捉抗體的塗佈環境: 溶液的 pH 值與鹽濃度、(2)捕獲抗體的濃度及(3)阻 礙 (blocking)溶液的種類及濃度。在免疫微脂體的最適化的調整中,探討 其(1)抗體活性的篩選、(2)免疫微脂體的粒徑大小、(3)表面抗體佔總脂質 莫爾數的百分比及(4)免疫微脂體的濃度對靈敏度的影響;繼之,將最適化 後的免疫微脂體分析檢測技術平台進行仙人掌桿菌存在於緩衝溶液中的 專一性及靈敏度進行測試,另外以0.083 CFU/mL 的菌濃度進行 14 小時的 培養以分析其檢測極限。

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2-2、實驗流程圖

圖2-1、實驗流程圖

Figure 2-1 The schematic flowchart of experiment

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2-3、藥品與材料:

2-3-1、試驗菌株

B. cereus 11778/4552/F4810 由美國康乃爾大學食科系的 Dr. Randy Worobo 慷慨提供。 E. coli DH10β 由中興大學食生系黃文哲老師慷慨提供。B.

subti1is DB430、E. faecalcs 10789、Staphylococcus aureus 10781、Listeria monocytogenes 14845、Yersinia enterocolitica 13999、Vibro parahaemolyticus 10806 及 Pseudomonas aeruginosa 10944 由宜蘭大學食科系林世斌老師慷慨 提供。所有菌株皆於-20oC 下保存備用。

2-3-2、 抗體

Goat anti-Rabbit polyclonal antibody (AP132P) 購自 Chemicaon 公司,Rabbit anti-Bacillus cereus polyclonal antibody 由食品工業研究所陳紀樺研究員慷 慨提供。

2-3-3、 化學藥品

A. 以下藥品購自美國 Difco 公司

Nutrient Broth/Agar (BD 234000/ BD 213000)、Plate count Broth/Agar (BD 275120/ BD 247940) 及 Tryptic soy Broth/Agar (BD 211825/ BD 236950)。

B. 以下藥品購自美國 Sigma 公司

cholesterol (C8667)、sucrose (CALBIOCHEM 573113)、hydroxylamine-HCl (Aldrich 431362)、N-ethylamine (Aldrich E3876)、ammonium molybdate (Aldrich A1314)、sodium bisulfite (JT Baker 3556)、sodium sulfite (Aldrich S0505)、ammonium persulfate (A3678)、dimethyl sulfoxide (Aldrich 154938)、

Sephardex G-50 (G50150) 、Sephardex-G25 (G25150)、Sepharose CL-4B (CL4B200) 、 chloroform (C8667) 、 N,N,N,N-Tetramethyllethylenediamine (TEMED;T9281)、sulforhodamine B (SRB;S9012)、casein (C7078)、

N-succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA;A9043)、4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylic acid 3-N-hydroxysuccinimide ester (SMCC ;

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M5525)、Triton X-100 (T8787)、amino-2-naphthol-4-sulfonic acid hemihydrate (S440884)、octyl beta-D-glucopyranoside (n-OG;O8001)、sodium dodecyl sulfate (SDS;23771)及 30% hydrogen peroxide (Riedel-deHaen 31642)。

C. 以下藥品購自日本 NOF 公司

L-α-dipalmitoylphosphatidylethanolamine (DPPE;COATSOME® ME-6060)、

L-α-dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC ; COATSOME® MC-6060) 及 L-α-dipalmitoylphosphatidylglycerol , sodium salt (DPPG ; COATSOME®

MG-6060LS)。

D. 以下藥品購自德國 Merck 公司

Disodium hydrogen phosphate (106580)、acetic acid (1.00063.2500)、potassium dihydrogen phosphate (104873)、sodium chloride (106404)、sodium azide (NaN3;822335)、methanol (106009)、sulfuric acid (100731)、triethylamine (TEM808352) 、 Tween-20 (8.22184.0500) 、 ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA-2Na;108418)、Tris-HCl (CALBIOCHEM 648313) 、 Tris-base (CALBIOCHEM 648311) 及 N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid (HEPES;CALBIOCHEM 391340)。

E. 以下藥品購自美國 Bio-Rad 公司

Glycine (161-0718)及 30% Acrylamide/Bis solution (BIO-RAD 161-0156)。

F. 以下物品購自當地超商 脫脂奶粉 (安佳)。

29 PBS (pH 7.2),將培養基上仙人掌桿菌菌株 (B. cereus 11778、4552 及 F4810) 刮起,再加入 1 mL 的 0.01 M PBS 以懸浮培養基上的菌體。將懸浮液離 (3000 r.p.m,15 min)去除上清液後,再重複上述步驟以去除菌體外圍的雜 質 。 菌 體 加 入 1 mL 的 0.01 M PBS pH 6.8 ( 含 1% SDS 與 0.2%

2-mercaptoethanol)再以 70℃水浴槽作用 20 分鐘後離心 (10000 r.p.m,10 min)。將 500 μL 上清液移至微量超過濾離心管 (Millipore,Cal No : 42409) 中以11000 r.p.m 離心 10 分鐘,重複步驟兩次。接著以 500 μL 的 0.01 M PBS

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B. 十 二 烷 基 硫 酸 鈉 -聚丙烯醯胺膠體電泳法 (sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis: SDS-PAGE)

以3%上層膠及 12.5%下層膠的聚丙烯醯胺膠體進行仙人掌桿菌的膜蛋 白膠體電泳,將仙人掌桿菌的膜蛋白樣本以 1:1 的體積比例均勻混合於 sample buffer (含 10% SDS、20% glycerol、125 mM Tris-HCl、0.02%

bromophenol blue 與 2-mercaptoethanol)中,並在 95℃下加熱 1 分鐘。分別 在上層膠體中加入2 μL 蛋白質標準品與 15 μL 膜蛋白樣本溶液,以 Bio-Rad 迷你膠體電泳槽 (BIO-RAD 525BR 084091)進行電泳分析 (上層膠,100 mV;下層膠 150 mV,共 1.5 小時)。膠片取出後以染色液 (0.2% Commassie brilliant blue,45% methanol 及 10% acetic acid)作用 2 小時後,再以褪染劑 (25% methanol 及 10% acetic acid) 作用 3 小時以進行褪染。

C. 西方墨點法 Western Blot

將膠片移至經transfer buffer (25 mM Tris-Base,192 mM glycine 及 10%

methanol)浸泡兩分鐘的的 PVDF 膜 (Millipore IPVH 00010)上,分別在 PVDF 膜及膠片上覆蓋濾紙及泡棉後,形成轉印三明治,以 100 mA 進行轉 印作用,待 SDS-PAGE 上的膜蛋白轉印至 PVDF 膜上,再將膜取出以 5%

脫脂奶粉溶液 (溶於 0.01 M PBS, pH 7.2)在 4℃下作用 16 小時以將 PVDF 膜上的其他蛋白質結合位阻斷。移除奶粉液後以10 mL 的 0.01M TBST (含 0.15 M NaCl,0.5% Tween-20)清洗 PVDF 膜三次 (5 分鐘/次,100 r.p.m)。

清洗完成後,加入10 mL 的待測的抗體 (100 μg/mL),室溫下作用 1.5 小時。

再以30 mL 的 0.01M TBST 清洗 PVDF 膜(10 mL/次;15 分鐘/次,100 r.p.m)。

加入總體積10 mL,以 1:5000 稀釋的 goat anti-rabbit antibody conjugated alkaline phosphatase 在室溫下作用 1.5 小時,再以 TBST 清洗 PVDF 膜三次,

最後加入NBT 及 BCIP 反應,作用完成後將膜移至大量清水中以終止反應。

2-4-3、免疫微脂體之製備

秤取莫耳比例為1:2 的 DPPE 與 SATA 置入圓底燒瓶中,加入 2 mL 的氯仿(含有 0.7% triethylamine;v/v)溶解後,避光震盪 30 分鐘。以旋轉減 壓濃縮機 (rotary evaporator;Eyela N-1000)去除有機溶劑。再加入 2 mL 氯

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仿均勻溶解ATA-DPPE 並抽乾,重複上述步驟兩次。最後加入 1 mL 氯仿 回溶備用。依照莫耳比例為 10:1:10 秤取 DPPC、DPPG 及 cholesterol 後,置於50 mL 圓底燒瓶,再以體積比例為 10:2 的氯仿/甲醇溶解,加入 0.5 mL ATA-DPPE 溶液混合後,以減壓濃縮機作用 1 小時以去除有機溶劑,

使圓底燒瓶壁上產生脂質混合物的薄膜。再以氮氣吹拂薄膜20 分鐘以確保 有機溶劑完全去除。在圓底燒瓶內加入3 mL 0.15 M sulfordamine B (SRB;

溶於0.2 M HEPES,pH 7.5,osmotility (OSM):485 mmol/kg),在 50℃下 進行4 小時的水合作用。再以液態氮及 50℃水浴中反覆「冷凍-解凍作用」

五次,使瓶壁上的脂質完全剥落。再以擠壓器 (mini-extruder;Avanti 610000),分別經膜孔徑為 0.4、0.2 與 0.1 μm 的聚碳酸脂膜進行擠壓,以產 生不同粒徑之微脂體。未被包裹的SRB 以 Sephardex G-50 柱去除,管柱中 填充樣品體積15 倍量的膠體,並以含有蔗糖的 0.02 M Tris-Base 溶液(TBS;

0.2 M NaCl,0.01% NaN3,pH 7.4,OSM:530 mmol/kg)作為移動相,以純 化出微脂體。

在製作免疫微脂體之機制為將抗體以共價鍵接合於微脂體表面,抗體 先進行衍生化反應以產生 maleimide 官能基。以莫耳比例為 SMCC:抗體

=20:1 的反應物混合後,利用翻轉振盪器 (intelli mixer;ELMI RM-2L)在室 溫下反應1 小時,再以 Sephardex G-25 膠體進行抗體的純化。以 0.01 M 的 磷 酸 緩 衝 溶 液 ( 含 0.14 M NaCl , pH 7.2) 進 行 管 柱 的 平 衡 及 流 洗 (1 mL/min),以分光光度計 (Chrom Tech UV-3100) 檢測在波長 280 nm 之吸光 值,並將含有抗體的部分收集備用。第二階段為將衍生化反應後的抗體與 微脂體共價結合,先將衍生化抗體分別以相對於總脂質莫耳數的0.05、0.1、

0.2 及 0.4%與微脂體混合,再加入相對於微脂體上 SATA 莫耳數 30 倍的 0.5 M hydroxylamine- HCl (溶於 25 mM EDTA,100 mM HEPES,pH 7.0)以去 除SATA 上的保護基,在室溫下反應 60 分鐘後,移至 4℃下反應 12 小時。

之後,再加入相對於外層膜SATA 莫耳數 50 倍之 0.1 M N-ethylmaleimide (NEM;溶於 0.01 M PBS),以將微脂體表面硫氫基進行閉鎖 (quenching) 反應。最後以Sepharose CL-4B 管柱 (流速為 1 mL/min)進行免疫微脂體的

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純化,分別蒐集免疫微脂體及未結合之抗體片段。將未結合之抗體溶液以 超過濾離心裝置進行濃縮定量後,回推免疫微脂體上抗體比例。

2-4-4、微脂體濃度測定-磷酸含量測定法

利用硫酸水解磷脂質,將有機磷變成無機磷後,加入鉬酸銨溶液 (ammonium molybdate),經化學反應後生成磷鉬酸 (phosphor-molybdic acid),再形成藍色的 amino-naphthyl-sulfonic acid 化合物,並以吸光值 825 nm 的強弱進行磷的定量。磷濃度的標準曲線是先在玻璃試管中分別加入 Fiske-SubbaRow 試劑。其配置方法為在 40 mL 的 15% (w/v) sodium bisulfite,添加 1 mg 1-amino-2-naphthol-4-sulfonic acid,最後再添加 200 mg 的sodium sulfite,避光攪拌 30 分鐘後,以 Whatman 濾紙#1 過濾待用。各 光散射實驗決定粒子的擴散係數。布朗運動 (Brownian motion)的現象是因 為溶液中小分子碰撞粒子,使得粒子在溶液中懸浮移動。以微脂體在溶液 中的布朗運動現象搭配都卜勒變寬效應中粒子與光束頻率的變化,進一步 由 Stokes-Einstein 方程式推算粒子的粒徑。其操作方法參照操作手冊。開 啟動態雷射奈米粒徑分析儀 (Malvern Zetasizer Nano Series)暖機 30 分鐘,

33 3915)材質是以 polystyrene 所構成,具有極佳的疏水特性,故利用其疏水性 質與抗體結合,再利用阻礙溶液 (blocking buffer)填補其餘的部分以防止免 疫微脂體與96 孔盤的非專一性鍵結所造成檢測的誤差。為使抗體能以疏水 性作用力結合於96 孔平盤,先研究抗體在以不同離子強度(0.1 與 0.01 M) 及酸鹼程度 (pH 5.2、7.4、8.0 及 9.6) 的 PBS 稀釋成 5 μg/mL 時與 96 孔盤 的結合效果。在抗體稀釋液的環境確定後,抗體分別稀釋為1、5 及 10 μg/mL (150 μL/well)三種濃度,在 4℃環境中作用 12 小時後,以尋找出抗體作用 的最適濃度。最後再進行 blocking buffer 最適化,分別選用小牛血清白蛋 白 (2.5 及 5%,bovine serum albumin;BSA)、脫脂奶粉 (2.5 及 5%,non-fat dry milk;NFDM)以及酪蛋白 (0.05 及 0.5%,casein)做研究。96 孔盤製備 方法為將抗體以適當溶液稀釋後,在4℃下作用 12 小時後,以 0.01 M PBS (pH 7.2)清洗微量孔三次,接著再加入 blocking buffer (200 μL/well),在 37℃

下震盪作用 2 小時,再以 0.01 M PBST (pH 7.2)清洗溶液(含有 0.05%的 nmole/mL)的免疫微脂體 (100 μL/well),在 30℃下與仙人掌桿菌菌體進行 30 分鐘的反應時 (100 r.p.m),作用完畢後即以 0.02 mM TBS (pH 7.4,OSM:

530 mmol/kg)清洗 (200 μL/well)五次,最後加入 30 mM 的 n-OG (100 μL/well),置於微量盤震盪機 (Sientific industries;SI 0400)上震盪促使免疫 微脂體破裂,釋放的SRB 螢光染劑再以螢光檢測器 (BioTek FLx800)進行

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檢測 (激發波長 540 nm,散射波長 590 nm)。

2-4-7、靈敏度分析

取出製備好的96 孔微量盤,加入以 PB (pH 6.8) 序列稀釋成 104、105、 106及107 CFU/mL 的 B.cereus 11778 菌液 (100 μL/well) 後,在 30℃下,以 100 r.p.m 震盪作用 1.5 小時。 再以 0.01 M PBS (pH 7.2) 清洗五次後,加入 最適化免疫微脂體 (100 μL/well),以 100 r.p.m、30℃下反應 30 分鐘。再以 0.02 mM TBS (OSM:530 mmol/kg)清洗微量孔 (200 μL/well) 五次。最後 加入30 mM 的 n-OG (100 μL/well) 作用五分鐘,再以激發波長 540 nm,散 射波長590 nm 檢測其螢光訊號。

2-4-8、專一性分析

取出製備好的 96 孔微量盤,加入不同菌種(B. cereus 11778、E. coli DH10β 、 B. subti1is DB430 、 E. faecalcs 10789 、 S. aureus 10781 、 L.

monocytogenes 14845、Y. enterocolitica 13999、V. parahaemolyticus 10806 及 P. aeruginosa 10944),而菌體濃度皆為 106 CFU/mL 的菌液 (100 μL/well) 後,作用1.5 小時 (30℃、100 r.p.m)。再以 0.01M PBS (pH 7.2)清洗微量盤 五次 (200 μL/well ),再加入 100 μL 的免疫微脂體作用 30 分鐘 (30℃,100 r.p.m)之後,以 0.02mM TBS (OSM:530 mmol/kg)清洗微量孔五次 (200 μL/well)。最後加入 30 mM 的 n-OG (100 μL/well)作用五分鐘,再以激發波 長540 nm,散射波長 590 nm 檢測其螢光訊號。

2-4-9、仙人掌桿菌在培養基中的檢測極限

在100 mL的TSB培養基中加入仙人掌桿菌 (B. cereus 11778)預估菌數 為10 CFU的菌數,使培養基終濃度達0.1 CFU/mL,進行14小時的培養 (40℃,150 rpm)後,以本研究所建立的檢測系統進行螢光檢測,並且也同 時進行菌體的稀釋與平盤塗抹以推算檢測之菌體之正確濃度。

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在文檔中 國立宜蘭大學生物技術研究所 碩士論文 Institute of Biotechnology National Ilan University Master Thesis (頁 35-45)