本研究發現以40℃在TSB培養基進行仙人掌桿菌的培養,可達到菌株 生長的最大速率與最高菌體濃度。在免疫微脂體-螢光免疫吸附法的建立之 中,96孔平盤需以濃度為5 μg/mL (以0.1 M PBS,pH 9.6稀釋)的捕獲抗體 在4℃下作用12小時後,再以溶於0.01 M PBS (pH 7.2)的0.05% casein的阻礙 溶液作用2小時(37℃)。之後以含有0.05% Tween-20及0.01% casein的清洗溶 液 (溶於0.01 M PBS,pH 7.2)清洗微量孔兩次,接著再加入欲檢測的菌體。

在檢測試劑方面則是以粒徑287 nm的liposome與相對於總微脂體莫耳數 0.05 mol%的抗體進行表面修飾成的免疫微脂體做為檢測試劑。進行檢測時 的免疫微脂體濃度為250 nmole/mL,並在30℃下作用1小時後,最後以30 mM n-OG破裂微脂體而釋出染劑,進行螢光檢測 (ex: 540 nm,em: 590 nm),其靈敏度為105 CFU/mL。在專一性方面,除對B. subtilis DB430及E.

coli DH10β產生偽陽性,對S. aureus 10781、L. monocytogene 14845、E.

faecalcs 10789 、 V. parahaemolytic 10806 、 P. aeruginosa 10944 與 Y.

enterocolitica 13999具良好專一性。而當應用於對於菌體在培養基中的偵測 時,經隔夜培養後,其測極限可達0.083 CFU/mL。

未來展望方面,可再進行不同微量盤材質、不同抗體吸附作用力及外 加抗體鍵結分子以進行檢測優劣的評估。另外可購買商品化或是測試不同 配方的阻礙溶液 (blocking buffer),以期能夠更有效的降低背景值以提升檢 測效果。在免疫微脂體方面,可再探討更大粒徑的微脂體、更高專一性的 抗體、及增加連接子 (cross-linker)的方式,使抗體能夠接合於微脂體上且 避免檢測時的空間障礙,以增強檢測效果。最後希望將此檢測系統應用於 食品樣本的檢測上,以提升食品安全及降低食品中毒的風險。

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(a)

(c)

3-1、仙人掌桿菌 F4810 以不同培養條件培養的生長曲線。B. cereus F4810 分別以○30、■35、△40 及×45℃之下,培養在(a) NB、(b) PCB 及 (c) TSB 的生長曲線。

Figure 3-1 The growth curves of B. cereus F4810 were inoculated in (a) NB, (b) PCB and (c) TSB with ○30, ■35, △40and ×45℃, respectively.

(b)

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3-2、仙人掌桿菌 4552 以不同培養條件培養的生長曲線。B. cereus 4552 分別以○30、■35、△40 及×45℃之下,培養在(a)NB、(b)PCB 及(c)TSB 的生長曲線。

Figure 3-1 The growth curves of B. cereus 4552 were inoculated in (a)NB, (b)PCB and (c) TSB with ○30, ■35, △40and ×45℃, respectively.

(a)

(b)

(c)

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3-3、仙人掌桿菌 11778 以不同培養條件培養的生長曲線。B. cereus 11778 分別以○30、■35、△40 及×45℃之下,培養在(a)NB、(b)PCB 及 (c)TSB 的生長曲線。

Figure 3-1 The growth curves of B. cereus 11778 were inoculated in (a)NB, (b)PCB and (c) TSB with ○30, ■35, △40and ×45℃, respectively.

(a)

(b)

(c)

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表3-1、仙人掌桿菌對於不同培養條件下的生長結果之比較。

Table 1. The comparsion of growth results of B. cereus in different media and temperatures.

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表3-2、仙人掌桿菌對於不同培養條件下的繼代時間。

Table 3-2. The generation time of B. cereus in different growth conditions.

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圖3-4、抗仙人掌桿菌膜蛋白抗體之活性分析。(a) SDS-PAGE 與(b)Western blotting 分析。Lane1-3 分別為 B. cereus 4552, F4810 及 11778 的膜蛋白;

M 代表分子量標記。

Figure 3-4. The active assay of the antibody was against B. cereus membrane protein. (a) SDS electrophoresis and (b) Western blot. Lanes 1 to 3 were the membrane proteins of B. cereus 4552, F4810, and 11778 respectively. M is molecular weight marker.

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圖3-5、微脂體的粒徑分析。分別以孔徑 400、200、100 nm 的聚碳酸脂膜 擠壓後之微脂體的粒徑分析。

Figure 3-5 The sizes of analysis of lipsome that were extuded by

polycarbonate membrane on which pore sizes were 400, 200 and 100 nm.

(a)

(b)

(c)

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圖3-6、 SMCC 修飾後的抗體之管柱層析。以 Sephardex G-25 進行抗體的 管柱層析。前峰為修飾後之抗體(IgG);後峰為 SMCC 分子。

Figure 3-6. The chromatography of SMCC-moficied antibody. The modified antibodies were isolated by using a Sephardex G-25 column. Peak 1 is modified-antibody and Peak 2 is residues of unbound SMCC molecules.

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圖3-7、免疫微脂體-抗體混合物之管柱層析。以 Sepharose CL-4B 進行免疫 微脂體-抗體混合物之分離。第一段為免疫微脂體;第二段為未接合之抗 體;第三段為SRB 螢光染劑。

Figure 3-7. The chromatography of immunoliposomes. The unconjugated antibodies were removed by using a Sepharose CL-4B column. The first peak is immunoliposome, the second one is the unconjugated antibody and the third peak is SRB molecules.

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圖3-8、抗體與微脂體之接合率。

Figure 3-8. The efficiency of antibody conjugation in manufacturing immunoliposomes

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(a)

(b)

(c)

圖3-9、阻礙溶液對於檢測之影響。分別以 0.05、0.5%的 Casein 及分別為 2.5、5%的 BSA 及 NFDM 進行阻礙溶液能力的測試。

Figure 3-9. The effect of different blocking buffer on assay sensitivity. The well was blocked with (a) 2.5、5%的 NFDM , (b) 2.5 and 5% of BSA, and (c) 0.05 and 0.5% of casein.

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圖3-10、捕獲抗體在不同塗佈環境之下的的表現能力。(a)為螢光讀值及(b) 為signal/noise (S/N)值。

Figure 3-10 The effects of different blocking buffers on assay sensitivity. (a) fluorescence and (b) signal/noise value.

(a)

(b)

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圖3-11、不同濃度的捕獲抗體於檢測之影響。分別以 1、5 與 10 μg/mL 的抗體進行96 孔盤捕獲抗體的塗佈。

Figure 3-11. The effects of antibody coating sensity of the assay sensitivity.

Wells were coated with different concentrations of capture antibodies.

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圖3-12、不同粒徑的免疫微脂體對於於檢測之影響。

Figure 3-12. The effects of liposomal size on the assay sensitivity.

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圖3-13、不同修飾抗體比例的免疫微脂體對於檢測的影響。

Figure 3-13. The effects of Ab mol% of immunoliposome on the assay sensitivity.

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圖3-14、不同濃度的免疫微脂體對於檢測的影響。

Figure 3-14. The effects of liposomal concentrations on the assay sensitivity.

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圖3-15、最適化免疫微脂體檢測的靈敏度試驗

Figure 3-15. The sensitivity analysis of the optimized ILN/SF assay.

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圖3-16、最適化免疫微脂體檢測的專一性試驗

Figure 3-16. The specificity analysis of the optimized ILN/SF assay.

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圖3-17、仙人掌桿菌接種於 TSB 培養基中的檢測極限。

Figure 3-17. The limit of detection of B. cereus 11778 spiked in TSB.

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在文檔中 國立宜蘭大學生物技術研究所 碩士論文 Institute of Biotechnology National Ilan University Master Thesis (頁 53-73)