3-1、仙人掌桿菌之最適化培養
為尋找B. cereus最佳的生長狀態以縮短檢驗時間，分別以不同培養基 (NB、PCB及TSB)及溫度 (30、35、40及45℃)下進行B. cereus F4810/4552/
11778的生長曲線分析，如圖3-1、3-2及3-3。並分別計算各品系在生長對 數期的線性公式，並觀察菌體達飽和濃度的結果如表3-1，觀察後得到F4810 在30℃的NB培養之下，lag phase的時間為2小時之外，其餘的品系及培養 環境所得的lag phase皆≦1小時。計算各生長曲線在生長對數期 (log phase) 的線性公式，得知菌種即使在不同培養基中，但在30-40℃之間隨溫度上升 而斜率上升；而溫度提升至45℃時，則斜率與40℃時的斜率比較，出現明 顯下降，亦表示生長隨之減慢。此三個品系的最高菌體濃度皆在TSB中出 現，B. cereus F4810、B. cereus 4552與B. cereus 11778分別為9.07、9.15與8.85 log CFU/mL。而比較三種培養基對三個品系菌種的飽和濃度皆為TSB>
PCB> NB。而依菌體隨時間生長而計算得到的生長速率結果如表3-2。
在培養B. cereus F4810方面，發現以TSB搭配35或40℃的環境下有最快 的生長速率分別為18.0±0.4及18.1±0.2分鐘/代。而在此兩種培養溫度下，比 較三種培養基的培養結果發現以PCB培養所得到的生長速率分別都位居第 二；分別為19.2±1.9及19.4±0.7分鐘/代。而以NB培養所得到的生長速率最 慢；分別為21.8±1.3及20.6±0.3分鐘/代。在培養B. cereus 4552方面，得知此 菌體在各個培養基且維持在40℃時會有最快的生長速率，而比較NB、PCB 及TSB三中培養基各自所得的生長速率分別為16.8±1.2 (最慢)、15.5±1.0 (居 次)及14.2±0.3分鐘/代 (最快)。而B. cereus 11778以NB培養時，其生長速率 可在40及45℃達到最快；分別為19.1±3.2及19.5±1.1分鐘/代，在PCB中，以 45℃有最快的生長速率 (17.5±0.5分鐘/代)，而以TSB培養時則以40℃可得 到14.5±0.4分鐘/代的生長速率。
綜觀實驗結果，發現此三種品系的菌株不論在何種培養基之中，在 30-40℃的溫度範圍內皆是隨溫度上升而生長速率加快。當溫度達到45℃
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時，除了B. cereus 11778能在NB及PCB中維持快速的生長速率 (分別為19.5
±1.1及17.5±0.5分鐘/代)之外，其餘的菌株 (包含B. cereus 11778)即使以不同 培養基培養皆會導致生長速率減慢。故欲大量增值菌體以達偵測目的的培 分別為B. cereus 4552、F4810與11778的膜蛋白萃取經SDS-PAGE分析後結 果，可在28.5 kDa的位置得到其膜蛋白質。經西方墨漬法處理後，結果如 167 nm。根據此結果，推測微脂體在膜過濾之前的粒徑應小於400 nm，而 微脂體經過200 nm的濾膜過濾後，粒徑有明顯下降至預設的濾膜孔徑。經 過膜孔徑為100 nm的微脂體，其粒徑經過測量後得到為167 nm，其原因可 能為小顆粒的微脂體曲面過大而容易在微脂體間彼此碰撞而融合成較大
37 體、peak 2為未接上微脂體之抗體及peak 3是未清除乾淨之SRB螢光染劑。
另外，在分析抗體接合率時發現，接合率隨抗體所使用比例的提升而下降 (immunoliposomal sorbent assay；ILSA)進行仙人掌桿菌的檢測，故此實驗 技術的首要目標就是將捕獲抗體 (capture antibody)塗佈在微量孔底部，並 且以阻礙溶液 (blocking solution)將微量孔底部填滿，避免檢測時造成免疫 微脂體與盤底部有非專一性的結合，而產生偽陽性的檢測結果。
3-4-1、阻礙溶液的種類與濃度最適化
測試微量孔阻礙溶液環境時分別是以5 μg/mL捕獲抗體 (溶於0.1 M PBS pH 8.0)進行盤底的塗佈 (4℃、12 hr)，所使用的免疫微脂體條件為粒 徑287 nm、抗體表面修飾度0.05 mol%，濃度為250 nmole/mL。而在阻礙溶 液的探討則分別採用0.05與0.5%的casein、BSA與NFDM濃度則為2.5及 5%，而作用環境皆為37℃、150 r.p.m，2 hr。在評估檢測的優劣時，可以
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訊號值/背景值(signal/noise；S/N)的數值作為參考依據，訊號值為樣品中含 有菌體之吸光值；而背景值為樣品中不含菌體之吸光值，即所謂的對照組 (blank)。如圖3-9 (a)，當以NFDM進行blocking時，與不含菌體的對照組 (blank)做比較，即使菌體濃度達到107或108 CFU/mL也無法得到檢測結果，
顯示NFDM會與免疫微脂體產生非專一性的結合。而如圖3-9 (b)所示，在 2.5% BSA方面可以在菌體濃度為107 CFU/mL得到較佳的檢測結果。其吸 光值約為14000 AU，S/N等於2.51±0.55。如圖3-9 (c)所示，0.05% casein亦 具有阻礙能力，其趨勢與2.5% BSA相似，可在107 CFU/mL時，吸光值約 為16000 AU，所得S/N等於2.10±0.32。但2.5% BSA及0.05% casein在檢測後 的coefficient of variation (CV%)分別為22.1%及15.3%，為提高實驗之穩定 性，故以0.05% casein作為阻礙溶液。
3-4-2、捕獲抗體的塗佈環境最適化
利用5 μg/mL的抗體濃度，探討抗體分別在鹼性 (pH 9.6及8.0)、中性 (pH 7.4)酸性 (pH 5.2)及不同鹽濃度下 (0.1 M與0.01 M PBS)對於抗體附著 於 微 量 盤 底 部 的 影 響 。 而 其 他 的 檢 測 條 件 為0.05% casein 為 blocking buffer、106及107 CFU/mL的菌體 (B. cereus 11778)濃度與250 nmole/mL的免 疫微脂體 (287 nm，0.05 mol%)進行檢測。根據實驗結果(圖3-10 (a) )得到，
不論緩衝溶液的pH值偏向酸性 (pH 5.2)或中性 (pH 7.4)時，皆無法提供有 效或優良的檢測結果。而在鹼性 (pH 8.0與9.6)的緩衝溶液環境下，皆可在 0.01 M及0.1 M的鹽濃度下，得到檢測訊號隨菌體濃度上升而上升的趨勢。
在pH 8.0的鹼性環境下，不論在0.01 M或0.1 M的PBS中其對於菌濃度達107 CFU/mL的，其吸光值分別為12625 AU及9171 AU，而S/N分別為1.82±
0.32、2.1± 0.32，如圖3-10 (b)。在pH 9.6且鹽濃度為0.01 M的PBS環境下，
菌體在106 CFU/mL的S/N為1.79± 0.75；相較於0.1 M的的S/N為3.00± 0.80 較差。在鹽濃度皆為0.1 M PBS，其酸鹼值分別為pH 8.0與pH 9.6時，發現 在pH 9.6時，可以提前至106 CFU/mL得到檢測值 (S/N = 3.00± 0.80)，pH 8.0 卻需要菌濃度達107 CFU/mL才能得到檢測訊號 (S/N = 2.1± 0.32)。因捕獲 抗體與微量盤是以疏水性作用力接合，所以抗體與微量盤的接合是取決於
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抗體疏水性作用力的程度，在捕獲抗體塗佈緩衝溶液試驗當中即是以不同 的pH值與鹽濃度(離子強度)稀釋抗體，使抗體產生部分變性而露出抗體的 疏水性區域並接合於微量盤底部。根據上述的實驗結果，目前使用的rabbit anti-B. cereus antibody其等電點可能偏向鹼性，所以才能使得抗體稀釋於 0.1 M PBS (pH 9.6)時有較佳的檢測表現。所以接下來實驗將採用0.1 M的 PBS (pH 9.6)為捕獲抗體的稀釋液。
3-4-3、捕獲抗體濃度的最適化
分別以1、5及10 μg/mL的抗體進行盤底的塗佈作用，B. cereus 11778 的菌量分別為103及106 CFU/mL，免疫微脂體則以250 nmole/mL進行檢測。
根據實驗結果得到(圖3-11)，當抗體濃度達10 μg/mL時，無法明顯提升檢
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的影響。微量盤底部皆以濃度5 μg/mL (溶於0.1 M PBS，pH 9.6)的抗體進 行塗佈作用 (4℃，12 h)，以0.05% casein (溶於0.01 M PBS，pH7.2)作為阻 礙溶液，而菌體皆採用仙人掌桿菌 (B. cereus 11778)。
3-5-1、免疫微脂體的尺寸對於檢測的影響
如圖3-12，根據先前的分析結果，得到的微脂體粒徑分別為287、203 與167 nm。分別在不同粒徑的微脂體上，皆以微脂體總莫耳數0.05 mol%
的抗體進行修飾度，以250 nmole/mL的免疫微脂體分別對於106及107 CFU/mL的菌體濃度進行檢測。實驗結果得到，當菌量達到106 CFU/mL時，
以粒徑287 nm所得到的檢測S/N值達3.56± 0.80，而粒徑為203與167nm時，
S/N分別為1.49± 0.90與0.71± 0.00。所以粒徑在287 nm時，可得到最佳的檢 測結果。其原因可能在於，當微脂體粒徑越大，所包裹的SRB螢光染劑數 時，S/N值分別為1.36及1.28，故選擇修飾比例為0.05 mol%的免疫微脂體進 行 微脂體的濃度最適化。
3-5-3、免疫微脂體濃度對檢測的影響
根據實驗結果如圖3-14得到，當免疫微脂體使用的檢測濃度提高，其 螢光訊號亦隨之提高，而以濃度為50 nmole/mL進行菌體的檢測時，不論菌 體濃度為103或106 CFU/mL，與blank組相對照，皆無法獲得訊號的提升。
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而在150與250 nmole/mL時，皆可在106 CFU/mL時檢測出菌體的存在，其 S/N值分別為1.19與1.53，故選擇以濃度為250 nmole/mL的免疫微脂體 (0.05 mol%)進行靈敏度及專一性的檢測。
3-6、靈敏度分析
96孔平盤先以5 μg/mL的捕獲抗體進行12小時 (4℃)的塗佈後，再以 0.05% casein作為阻礙溶液作用且清洗之後，加入104-107 CFU/mL的菌體，
經過1.5小時 (30℃)的作用，再以粒徑為287 nm、抗體修飾比例為0.05 mol%，濃度為250 nmole/mL的免疫微脂體進行靈敏度測試，其結果如圖 3-15。可觀察螢光訊號隨菌體濃度升高而升高，並根據偵測極限(Limit of Detection；LOD)的定義:背景值加上三倍標準差(signalBlank+ 3x standard deviation (SD))的結果與檢測訊號減去標準差(signal(Bacteria)-SD)的值比較 後，所相對應的最低菌數量。故在此檢測系統對於仙人掌桿菌的偵測極限 為105 CFU/mL，且在106及107 CFU/mL的S/N值分別為1.52及1.85。
3-7、專一性分析
在此次的專一性分析中，每個檢測孔中加入濃度為250 nmole/mL的微 脂體 (100 μL/well，323 nm，0.05 mol%抗體修飾)。其螢光值相較於先前 的檢測結果而言，有較高的訊號呈現，其原因在於原來使用的粒徑為287 nm而在此部分分析時所使用的微脂體粒徑為323 nm，為確認粒徑對於螢光 訊號表現的影響，故先進行微脂體粒徑之間在同濃度與體積之下所得到的 螢光差異，其結果得到，當微脂體粒徑323 nm大於原本的287 nm粒徑時，
其螢光訊號隨著粒徑變大而提高，故造成此次檢測的訊號偏高。以革蘭氏 陽性及陰性菌進行專一性分析當中，菌體濃度皆保持在106 CFU/mL。革蘭 氏陽性菌種共有五株分別有枯草桿菌 (B. subtilis DB430)、金黃色葡萄球菌 (S. aureus 10781)、李斯特氏菌 (L. monocytogene 14845)、E. faecalics 10789 與欲檢測的仙人掌桿菌(B. cereus 11778)。在陰性菌方面，分別有腸炎弧菌 (V. parahaemolytic 10806)、綠膿桿菌(P. aeruginosa 10944)、大腸桿菌(E. coli DH10β)與Y. enterocolitica 13999等四株菌。實驗結果如圖3-16，對於目標
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菌種B. cereus 11778的檢測結果其S/N值可達到約2.84。除了在同屬的枯草 桿菌(B. subtilis DB430)與大腸桿菌(E. coli DH10β)的檢測S/N值分別為1.25 與1.23之外，其餘的菌株經過檢測後，S/N值分布於1.00-1.10之間。可得到 此檢測平台對於大部分菌株具有專一性，但對於同屬的枯草桿菌而言，其 專一性則下降。此次所使用的抗體為多株抗體(polyclonal antibody)，也有 可能與同屬的枯草桿菌的膜蛋白產生交互作用，進而造成檢測誤差。
3-8、仙人掌桿菌在培養基中的檢測極限
在含有濃度為0.083 CFU/mL 的 TSB 培養基中，經過 14 小時的培養之 後，以本研究所建立的檢測系統進行檢測的結果如圖3-17，其螢光數值在 菌濃度達107 CFU/mL 時有明顯的螢光訊號反應，其螢光訊號為 15457 AU 而S/N 值為 2.31。在菌體濃度達 108 CFU/mL 時，螢光訊號則下降為 5390 AU，而 S/N 值則降為 0.807，推測為因菌數過多而造成微脂體分子之間的 碰撞而導致hook effect，所以造成檢測值低下。而在此實驗中得知此檢測 系統對於菌體於培養基中的檢測極限達到0.083 CFU/mL。
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