2

生長溫度為l0-45℃,可耐熱 (於100℃下經1-7.5分鐘僅可殺滅90%)。廣泛 分布於自然界,可由細菌本身或其產生之毒素致病。中毒症狀可分為由兩 種,一為具熱穩定性的小分子胜肽所造成的嘔吐症狀,潛伏期約1-6小時,

及另一種為大分子蛋白質毒素所造成的下痢症狀,潛伏期約8-16小時5。而 高澱粉食物易導致嘔吐症狀的發生,如米飯、馬鈴薯及義大利麵等。腹瀉 型症狀主要由高蛋白含量的食物所導致,例如肉類製品與乳類製品等5。 病原性大腸桿菌 (Enteropathogenic Escherichia coli),革蘭氏陰性菌,

兼性厭氧菌,其最適生長的pH值為6-72。感染後的潛伏期平均為5-48小時。

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中毒症狀主要為菌體侵入人體之腸管而引起類似志賀氏桿菌毒素 (例如:

verotoxin) 的中毒症狀造成水樣便、血便及脫水等症狀5。若症狀持續發生 有可能導致電解質不平衡而死亡。生的牛肉或雞肉為感染的食品,常針對 嬰兒、衛生環境不良的地區或是第三世界國家造成流行性的感染61-1-2、台灣區歷年食物中毒案件

根據衛生署統計3,台灣人民受到細菌汙染而造成食品中毒的人數在 2003~2007年平均每年約達1730人,其中致病率達首位的為腸炎弧菌 (V.

parahaemolyticus),平均每年可導致八百多人感染。由圖1-1顯示在此5年間 仙人掌桿菌 (B. cereus) 所造成的食品中毒人數平均為280多人,僅次於腸 炎弧菌,故仙人掌桿菌在台灣所造成的食品中毒具有相當的嚴重性。

1-2、仙人掌桿菌

1-2-1、特性

仙人掌桿菌 (B. cereus) 為食品病原菌,其菌體的長寬分別為5-10 μm 與1 μm,革蘭氏陽性,具有好氧或是兼性厭氧的能量代謝模式,並且能在 有氧環境下產生內孢子。也因為其生長環境無特別的營養需求,使得此菌 圖1-1、2003~2006年細菌性食物中毒統計圖。

Figure 1-1. The statictics of bacterial food poinsoning in 2003-2006.

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株能夠廣泛存在於自然界中的土壤與植被中7-12。營養態的菌株經過穿透式 電子顯微鏡的圖1-2顯示,其細胞壁表面被大量S-層蛋白所覆蓋,此蛋白用 以穩定其他細胞壁結構13。最適合的生長溫度範圍從攝氏25度到37度,其 分裂的時間為20-30分鐘,是生長相當快速的菌種。仙人掌桿菌的孢子態並 沒有代謝的活性,但可承受極端的外在環境,例如:耐低溫、耐熱、耐乾 旱與輻射傷害等13。此孢子和其他仙人掌桿菌屬的孢子相似,並不會膨脹 其 孢 子 囊 , 而 從 孢 子 的 核 心 (core) 向外層層依序圍繞著內膜 (inner membrane)、皮質 (cortex)、內夾膜 (inner coat) 與外夾膜 (outer membrane) (圖1-3) 13

其相關的菌株有B. mycoidesB. anthracis及B. thuringiensis,而上述三 株菌與B. cereus共稱為Bacillus cereus group。在分類學上,分為基因型態與 表現型態上的區別。在基因型態方面,此Bacillus cereus group在16S rRNA 初級結構的序列上有大於99%的相似性14。在表現型態方面,B. anthracis 具有兩個毒性質體分別為pOX1與pOX2。B. thuringiensis會產生結晶狀的物 質與Delta毒素,而B. cereus var. mycoides會在血球培養基上生長出假根 (rhzoid)15-17

圖1-2、仙人掌桿菌孢子囊的外層結構圖。CM;細胞膜,CW;細胞壁,S;

表面層 13

Figure 1-2. Ultrastructure of B. cereus sporangium. CM: cytoplasmic membrane;

CW: cell wall; and S: surface layer 13.

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1-2-2、感染源與汙染途徑

有許多種食物可以被仙人掌桿菌或其孢子所汙染,如:義大利麵、通心 麵、米飯、鮮奶或乳製品、香料與乾燥的肉類、雞肉、海鮮、穀類、蔬菜

水果等10, 12-23。造成腹瀉症狀的食物大致可歸類為蛋白質含量較高的食

物,例如奶類製品等。而造成嘔吐症狀的食物則為澱粉含量較多的食物,

例如米飯、麵食等24。在過去1991-1994年間,全球飛機上3%的肉類餐點遭 受仙人掌桿菌的汙染25。另外在醫院供應的膳食與嬰兒食品若遭受到汙 染,也會對於免疫功能低下的病人或是新生兒造成感染26, 27

因為仙人掌桿菌廣泛存在於自然界當中,不論是空氣、水中、土壤等 環境皆能發現其蹤跡而且具有容易從孢子體轉換成營養態的特性。就食品 的汙染而言,從食物的原產地、運輸、加工過程或是最後的食用與保存等 皆有可能發生汙染的情形,最後引發腸胃道感染。以牛乳為例,仙人掌桿 菌容易存在於乳牛的乳腺內而造成牛乳受到汙染27。另外,Ro¨nner的研究 團隊也發現此株菌容易與疏水性的牛乳加工設備產生黏附作用28。另外,

已知某些菌株的孢子會黏附於人類的上皮細胞,故孢子也是仙人掌桿菌傳 播的重要的媒介29

圖1-3、仙人掌桿菌的薄切片孢子,IM;內膜,C;皮質,IC;內夾膜,OC;

外夾膜13

Figure 1-3. A thin sectioned spore of B. cereus. IM: immer memebrane; C:

cortex; IC: immer coat, and OC: outer coat 13.

6 一種為嘔吐型 (emetic syndrome),另一種為腹瀉型 (diarrheal syndrome)。

嘔吐症狀的發生主要起因於攝取到嘔吐毒素 (emetic toxin-cereulide),其結 構為類似纈氨黴素 (valinomysin) 的dodecadepsipeptide30, 31。具有耐高溫 (121℃)及耐酸鹼 (pH 2-11) 的特性,並且不受pepsin及trypsin的影響31。其 致病機制尚未被完全瞭解,根據過去的報告知道其作用機制是在細胞膜上 形成離子通透的孔洞,進而使得粒線體的氧化磷酸化失去功能,造成脹大 的粒線體,導致細胞死亡32。Hughes等研究者發現HEp-2細胞培養在含有嘔 吐型毒素的培養液會誘導HEp-2細胞的液胞形成33。另外,此毒素會經由細 胞膜上的5-HT3 受器而刺激迷走神經的傳導31,也會對於肝臟細胞中粒線 體 的 脂 肪 酸 氧 化 作 用 抑 制 進 而 導 致 肝 功 能 喪 失22。 腹 瀉 型(diarrheal enterotoxin) 的 致 病 毒 素 主 要 分 為 非 溶 血 型 毒 素 (non-hemolytic enterotoxin;NHE) 與溶血型毒素 (hemolysin BL;HBL)。NHE分別由三個 分子量為39、45與105 kDa的次單元蛋白所組成34,其基因分別為nheA、nheB 與nheC。在NHE的各個次單位的研究如下。在動物實驗中,Shinagawa等

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孔洞內擴散出去而形成很清楚的溶血環39。但在1997年,Beecher與Wong 的研究中發現HBL的機制是三種次單位會各自與紅血球的膜結合,之後再 桿菌素 (mannitol-egg yolk-polymyxin B;MYP) 培養基中選出可疑菌落 後,再搭配此株菌體不具有假根生長及蛋白質毒素晶體,但具有泳動性的 菌落外觀形態來大致區別。而在生化試驗當中,會在觸酶試驗(catalase test) 中會產生氣泡、能分解酪胺酸、能在無氧環境中利用葡萄糖產生酸、使硝 酸鹽 (nitrate) 的還原、在歐普氏 (VP test) 試驗中能產生粉紅色、具有β-溶血作用 (β-hemolysis)、能耐受溶菌酶(lysozyme)等反應51。以MYP培 養基為例,因為仙人掌桿菌無法利用甘露糖作為醣類的來源,故無法產酸

8 extract,0.5% peptone) 中24小時 (35℃),之後分別加入0.25 mL的A及B試 劑 (A:0.8% sulfanilic acid的5 N醋酸溶液。B:0.5% α-naphthol的5N醋酸溶 液),反應在10分鐘之內完成,硝酸鹽會被仙人掌桿菌還原成橘紅色的亞硝 酸鹽51。但是因為仙人掌桿菌存在著非典型菌株,造成傳統及後續的生化 檢測方式無法提供絕對的專一性,故對於食品中毒的機會相對的提供了不 確定性。

Shelef的研究團隊在2001年發展出一種利用顏色來區分仙人掌桿菌屬 的選擇性培養基,其原理為在培養基中加入5-bromo-4-chloro-3-indoxyl- myo-inositol-1-phosphate (X-IP),此物質會經由仙人掌桿菌屬的菌體所產生 的phosphatidylinositol phospholipase C (PI-PLC)分解而在菌落四周產生藍 色區域,但此種培養基不能分辨同屬的B. cereus與B. thuriugiesis菌株,且 須 耗 時39 小 時 才 能 觀 察 結 果50。 繼 之 ,Moravek 等 人 發 展 出 colony immunoassay (CIA)檢測法,將仙人掌桿菌的毒素蛋白質吸附在硝化纖維膜 上,再利用兩種單株抗體分別針對HBL的B次單元及NHE的nhe A次單元進 行偵測,共需花費22.5小時52。另外,Bruno等人利用免疫螢光能量轉移分 析法 (immunofluorescence resonance energry transfer;immuno-FRET) 檢測 仙人掌桿菌孢子。利用Oregon Green-514 (OG-514)標定在抗仙人掌桿菌孢 子的抗體被激發,以進行同質競爭性 (homogeneous competitive assay)螢光 檢測。在加入孢子檢測物之前,OG-514是被原存在的孢子上另一個QSY-7 螢光分子消光 (qenuch) 而無法被激發,當分析物存在之後會與QSY-7孢子 競爭抗體而遠離QSY-7產生螢光。其檢測時間需要15分鐘,而其檢測極限 達 到1.0 x 105- 2.5 x 105 spore/mL53。 另 外 在 搭 配 電 化 學 檢 測 法 的 direct-charge transfer (DCT)分析中,Sudeshna等人將抗仙人掌桿菌抗體鍵結

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上polyaniline,再與仙人掌桿菌樣本混合後,利用固定有抗仙人掌桿菌抗 體的硝化纖維膜與抗體-菌混合液進行側流分析,而使polyaniline-antibody-仙人掌桿菌留存於膜上,再利用因polyaniline而形成的電流通路而進行檢 測54, 其 檢 測 時 間 只 需6分鐘,在緩衝溶液中的檢測極限可達101-102 CFU/mL。在生物分析模式上,當仙人掌桿菌嘔吐型毒素的含量達到1.5 ng/mL以上時,也可利用牛精蟲 (含2.7 x 107 cells) 的泳動性下降進行半定 量評估55。另外,也發展出利用Ped-2E9細胞對於仙人掌桿菌胃腸道毒素進 行檢測,對於毒素的靈敏度可達0.3-0.4 μg/mL,但其所有的檢測需費時19 個小時以上56

在DNA檢測法中則是應用蝦子中分離出來仙人掌桿菌BIS59的質體,

以限制脢Bgl II切割而得到的3kb片段並以α-32P-dCTP放射性標定後可作為 偵測仙人掌桿菌的DNA探針,所檢測時間為124小時57。聚合脢鏈鎖反應 (polymerase chain reaction;PCR)是目前廣泛被應用於分子檢測的工具,利 用能合成毒性基因的引子 (表1-1) 與待測菌體的DNA混合後進行毒基因 的合成與分析,其所耗費時間約3-4小時52,對於被仙人掌桿菌所汙染的脫 脂奶粉試驗中,靈敏度可達到25-46 CFU/g58。但是PCR技術反應的是基因 體的資訊,並不代表菌體在真實情況的表現。過去文獻也指出,即使以PCR 方式檢測出仙人掌桿菌的毒素基因片段,但是利用其他的溶血性試驗或是 傳統的卵磷脂脢檢測皆無法提供相同的印證59。以上所介紹的仙人掌桿菌 檢測法整理於表1-2。

表1-1、仙人掌桿菌聚合酶鏈鎖反應所使用之引子及其對應之毒素基因與片段 大小52, 58

Table 1-1. Primers used to detect the toxic genes of B. cereus 52, 58.

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表1-2、仙人掌桿菌在不同檢測法之比較。

Table 1-2. Comparison of different methods for the detection of B. cereus.

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目前有三組商業化的仙人掌桿菌腸胃道毒素檢測套件 (表1-3),其中 一 種 為 仙 人 掌 桿 菌 腸 胃 道 毒 素 逆 向 式 被 動 膠 體 凝 集 試 劑 (B. cereus enterotoxin reversed passive latex agglutination kit;BCET-RPLA kit)是用來檢 測HBL毒素中的L2次單元。其原理是將抗體與聚苯乙烯乳膠顆粒結合再加 入至96孔盤中。若樣品含有L2次單元,則會導致接合抗體的聚苯乙烯乳膠

目前有三組商業化的仙人掌桿菌腸胃道毒素檢測套件 (表1-3),其中 一 種 為 仙 人 掌 桿 菌 腸 胃 道 毒 素 逆 向 式 被 動 膠 體 凝 集 試 劑 (B. cereus enterotoxin reversed passive latex agglutination kit;BCET-RPLA kit)是用來檢 測HBL毒素中的L2次單元。其原理是將抗體與聚苯乙烯乳膠顆粒結合再加 入至96孔盤中。若樣品含有L2次單元,則會導致接合抗體的聚苯乙烯乳膠

在文檔中 國立宜蘭大學生物技術研究所 碩士論文 Institute of Biotechnology National Ilan University Master Thesis (頁 11-35)