物種的遺傳變異樣式影響其演化潛力，同時亦顯示其適應不同環境的 能力（Hamrick et al., 1992），而決定物種或族群適應力的因素，除了遺傳變 異程度外，還包括這些變異在不同族群間的分布模式（Soltis & Soltis, 1987）。因此要較精準的了解一物種的演化過程，與未來演化潛力，需要充 分掌握其種內之遺傳變異模式。同型孢子蕨類植物擁有的生物學獨特性使 得不易全盤瞭解其遺傳系統與演化潛力（Haufler, 2002）。
蕨類植物的生活史包含孢子體階段與可獨立生活的配子體階段，同型 孢子蕨類植物與其他維管束植物最大的差異在於其可以形成兩性配子體，
因此在一個世代時間即可產生完全同質結合的孢子體。如此的生殖機制使 得單一散播的孢子即潛在可形成一新的族群（Klekowski, 1979），相對地，
其遺傳多樣性卻因此顯著下降，因應環境變動的適應力與演化潛力亦大大 地下降。電泳分析同功異構? 的變異性可以檢驗族群或種內的遺傳組成，
其表現方式為每基因座上平均對偶基因數，其數值越高，表示族群多型性 越高，擁有越高遺傳變異。此外，藉由評估個體或整個族群平均異質結合 基因座比例，可以推論族群盛行的配育系統模式。
台灣位於亞洲大陸邊緣，是太平洋島弧中間位置的一個重要島嶼，在 5 百多萬年前凸出海面後逐漸隆起，地質上經歷多次冰河事件。冰河期間，
海平面下降，台灣與亞洲大陸相連（Sam Boggs et al., 1979），植物便可在台 灣與臨近地區間遷移、擴散；間冰期，海平面上升，台灣便與亞洲大陸隔 離，其間的族群基因交流中斷，進而分別演化、分化。由於如此特殊的地 質歷史，台灣成為探討植物親緣地理學絕佳的地點。近幾年，研究台灣島 和臨近地理區植物族群遺傳變異及親緣關係的報告數量快 速增長， 如
（Kandelia obovata）的親緣關係，Wu 等（2001）研究分布於台灣及日本昆 欄樹（Trochodendron aralioides）的族群遺傳結構，Lin （2001）及 Lu 等
（2002）研究同樣分布於台灣及日本地區烏心石（Michelia formosana）之 遺傳變異，Huang 等（ 2002）研究分布於台灣、大陸及日本地區青剛櫟
（Cyclobalanopsis glauca）之空間模式。先前的研究多著重於木本種子植 物，有關蕨類植物相關的研究則付之闕如。
哈氏狗脊蕨（Woodwardia harlandii）與細葉狗脊蕨（W. kempii）為烏毛 蕨科（Blechnaceae）狗脊蕨屬（Woodwardia）之物種，是分類上關係極為 相近的分類群，具有類似的地理分布，在許多地區更是共域生長在一起。
大陸學者秦仁昌將此二物種自狗脊蕨屬獨立出來（Ching, 1964），成立新 屬 — 崇澍蕨屬 （ Chieniopteris）， 然分子生物學證據並不支持此一處理
（Cranfill & Kato, 2003），多數蕨類植物分類學者仍將其置至於狗幾蕨屬中
（Kramer, 1990; Chiou et al.,1994; Iwatsuki, 1995）。目前已知哈氏狗脊蕨包 含 二 倍 體 與 四 倍 體 類 群 ， 而 細 葉 狗 脊 蕨 目 前 所 檢 測 結 果 皆 為 四 倍 體
（Takamiya et al., 1992; Cranfill, 2001; 第二章結果），分子生物學證據顯示 兩者為一複合種群（詳見第二及五章）。此複合種群分布範圍自日本南部，
經琉球群島、台灣、中國大陸東南沿海省分至越南北部、泰國東北（Chiou et al., 1994; Iwatsuki, 1995; Boonkerd & Rossarin, 2004），為東北西南方向的 帶狀分布，以大陸東南省分與台灣的族群數量較多。本研究利用同功異構
? 電泳分析法，分析哈氏哈氏狗脊蕨複合種群的族群遺傳多樣性，以及族 群間遺傳變異分布模式與結構，並探討其配育系統，藉此評估族群遺傳多 樣性與地理分布的關係。
貳、研究材料及方法
表 4-1、Analyzed populations of W. harlandii and W. kempii
Woodwardia harlandii Woodwardia kempii Population site
二、研究方法：
1. 酵素萃取：取植物體幼嫩新葉，經液態氮研磨後加入萃取液萃取
（Feret, 1973）以 3*12 mm²濾紙片吸附萃取液，移入超低溫冷凍櫃 中保存備用。
2. 電泳：以水平式澱粉電泳分析法（Soltis et al., 1983），依不同緩衝液 系統檢測（系統 H、Bnd 及 8*），進行電泳分析。
3. 酵素條帶讀取：以拍照方式立即記錄酵素條帶圖譜，判讀酵素條帶 為單聚體、二聚體或多聚體，並判別同質或異質結合，記錄後進行 統計分析。
4. 資料分析：將每個個體在檢測基因座上的基因型輸入電腦，以套裝 軟體 BIOSYS-II （Swofford & Selander, 1989）及 TETRAPLOIDE 計 算遺傳變異度、分析遺傳結構及遺傳距離。
(1)遺傳歧異度：
a. 多型性基因座百分比（P）
b. 基因座平均對偶基因數（A）
c. 異合度觀測值（HO） d. 異合度期望值（HE）
(2)遺傳結構：F-統計分析（F-statistic）
(3)遺傳距離：群叢分析（cluster analysis）
UPGMA, unweighted pair group method analysis
參、結果與討論
萃取液以 12﹪之水平澱粉膠於 4℃下電泳，依 Wendel & Weeden（1989）
所述之染色法染色，哈氏狗脊蕨複合種群共測得可分析基因座 11 個，位點 如 下 ：哈 氏狗脊蕨 於系統 H （ Cheliak & Pitel, 1984） 中 得 到 DIA-3
（ Diaphorase ）（ E.C.1.6.99.1 ）、 G3PD （ Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ）（ E.C.1.2.1.12 ）、 MDH-1 （ Malate dehydrogenase ）
（E.C.1.1.1.37）、6PGD-1（Phospho-gluconate dehydrogenase）（E.C.1.1.1.44）、 PGM-1（ Phosphoglucomutase）（ E.C.5.4.2.2）、PGM-2 等位點；系統 Bnd
（ Cheliak & Pitel, 1984 ） 可 得 AAT-2 （ Aspartate aminotransferase ）
（ E.C.2.6.1.1 ） 、 HK （ Hexokinase ） （ E.C.2.7.1.1 ） 、 PGI-3
（Phosphoglucoisomerase）（E.C.5.3.1.9）；系統 8*（Soltis et al., 1983）得 AAT-2、LAP（Leucine aminopeptidase）（E.C.3.4.11.1）等，共計 10 個。細 葉狗脊蕨則較前者多一位點 EST-2（Esterase）（E.C.3.1.1.-）（系統 8*），
計 11 個。各位點之對偶基因比例，如表 4-2，其中 G3PD 及 HK 在哈氏狗 脊蕨複合種群所有個體均只顯示單一條帶；EST-2 在細葉狗脊蕨所有個體亦 均只顯示單一條帶，但在哈氏狗脊蕨則未偵測出現條帶；LAP 除了在日本 九州屋久島族群具有異質合子（heterozygote）外，其餘所有哈氏狗脊蕨複 合種群所有個體均只顯示單一條帶；MDH-1 及 6PGD-1 除了在大陸廣東五 指山與大圓嶺族群具有異質合子外，其餘所有哈氏狗脊蕨複合種群所有個 體均只顯示單一條帶。其餘 5 個基因座（AAT-2、DIA-3、PGI-3、PGM-1 及 PGM-2）多數族群個體都具有兩個以上對偶基因，呈多型性表現。
表 4-2、Allele frequencies for populations of W. harlandii and W. kempii
Woodwardia harlandii Woodwardia kempii
TWL-H TSS-H TDP-H TFS-H TTP-H TDT-H TSM-H TDL-H CDY-H CWJ-H TWL-K TDP-K TSS-K TDT-K TTP-K TDL-K CCG-K JOJ-K
Pop*: Populations of W. harlandii and W. kempii. Population codes are identical to table 4-1.
Pop*
Loci
經由 Biosys-II 套裝軟體分析，哈氏狗脊蕨基因座平均對偶基因數（A）
為 1.68，多型性位點百分比（P）為 48.55；細葉狗脊蕨之基因座平均對偶 基因數（A）、多型性基因座百分比（P）分別為 1.56 及 40.07。表 4-3 顯示 大陸哈氏狗脊蕨及細葉狗脊蕨之平均 A 值及 P 值均較台灣者高；表 4-2 亦 顯示大陸哈氏狗脊蕨族群擁有 6 個兩地不相重疊的特有對偶基因的其中 5 個，大陸細葉狗脊蕨族群則擁有 5 個特有的對偶基因其中的 4 個。此外，
日本屋久島細葉狗脊蕨族群各基因座對偶基因頻率與台灣族群相近，兩地 理區 A、P 值相近，但在 AAT-2 基因座屋久島族群具有一與大陸廣東地區 細葉狗脊蕨共有的獨特對偶基因，此對偶基因不見於台灣地區族群，亦未 在哈氏狗脊蕨族群中發現。若以日本屋久島細葉狗脊蕨與大陸地區族群比 較，則前者不具任何特有對偶基因。
哈氏狗脊蕨台灣族群之平均異合度觀測值（Ho）為 0.454，平均異合度 期望值（HE）為 0.393；大陸族群雖有較高之 A、P 值，但因部份對偶基因 的頻率甚低（如 AAT-2 之 C 與 PGM-1 之 A 及 C 等對偶基因），Ho 反而較 低（表 4-3）；所有哈氏狗脊蕨族群之平均異合度觀測值（Ho）為 0.390，平 均異合度期望值（He）為 0.370。台灣、大陸及日本三地細葉狗脊蕨族群之 異合度觀測值（Ho）均相近，平均為 0.387，平均異合度期望值（HE）則為 0.357。與前人研究台灣及其他地區同型孢子蕨類植物的遺傳歧異度比較（表 4-4），本研究中二物種之遺傳歧異度顯然偏高，其中兩分類群多型性位點百 分比（P）及哈氏狗脊蕨平均對偶基因數（A）高於同型孢子蕨類植物之平 均值（表 4-4），而不論哈氏狗脊蕨族群或細葉狗脊蕨，其異合度觀測值（Ho）
更是表中所列物種最高者。若與台灣產木本植物種類之遺傳歧異度比較
（Cheng et al., 2008; Table 5），Ho 值亦明顯偏高。
若將哈氏狗脊蕨複合種群二倍體類群（哈氏狗脊蕨中國大陸族群）與
表 4-3、Genetic diversity for the populations of W. harlandii and W. kempii
* Unbiased estimate (see Nei, 1978)
** Diploid taxa; others were tetraploid N: Mean sample size per locus
A: Mean no. of alleles per locus
P: Percentage of loci polymorphic. A locus is considered polymorphic if the frequency of the most common allele does not exceed 0.95
Mt: mean of populations in Taiwan
Mc: mean of populations in main land China M: mean of all populations
可發現二倍體類群之異合度觀測值明顯低於四倍體類群， 但其觀測值
（Ho=0.225）仍高於表 4-4 統計之平均值與中間值，而與一些台灣產木本植 物種類之遺傳歧異度相當；相對地，二倍體類群之基因座平均對偶基因數
（ A）則明顯高於四倍體類群（大陸廣東地區產細葉狗脊蕨族群除外）。
Haufler（1985）針對 Bommeria 屬進行之族群遺傳研究，發現四倍體 B. pedata
的遺傳歧異度較其二倍體親本 B. ehrenbergiana 要高（表 4-4）；Hauk &
Haufler（1999）研究陰地蕨屬（Botrychium）之亞屬 Botrychium 時，亦發現 多倍體物種之遺傳歧異度多高於二倍體物種；Allard 等（1993）在研究四倍 體禾草 Avena barbata 時，也發現其對偶基因歧異度高於其親本二倍體 Avena
hirtula。Soltis & Soltis（2000）在文獻回顧研究亦歸納指出，植物多倍體遺
傳歧異度較其親本二倍體為高。本研究同時取樣二倍體與四倍體哈氏狗脊 蕨複合群之族群，分析結果亦證實多倍體具較高之異合度觀測值，而此觀 測值明顯高於過去針對二倍體與多倍體同型孢子蕨類植物的觀測結果，推 測應與四倍體哈氏狗脊蕨複合群為異源四倍體有關；相對地，二倍體類群 則具有較高的平均對偶基因數（A），推測與其減數分裂時較高的基因重組 有關；另一可能原因為大陸廣東新會一帶為廣大族群退縮之避難所，因此 匯集了較多的遺傳多樣性，而此長期且穩定的族群並保存了不見於其他地 區的稀有對偶基因（林, 2000）。觀察哈氏狗脊蕨複合種群對偶基因頻率（表 4-2）可以發現，除了二倍 體哈氏狗脊蕨族群（CDY-H 及 CWJ-H）外，其餘族群之基因型多形成固定 模式。可能的形成原因有三：一是所取樣本為營養繁殖形成，然而如研究 方法所述，取樣時已避免之，另一方面從表 4-2 結果可以發現四倍體類群內 基因型仍有變異，故排除此因素。二為取樣樣本為無配生殖形成。然而根
觀察哈氏狗脊蕨複合種群對偶基因頻率（表 4-2）可以發現，除了二倍 體哈氏狗脊蕨族群（CDY-H 及 CWJ-H）外，其餘族群之基因型多形成固定 模式。可能的形成原因有三：一是所取樣本為營養繁殖形成，然而如研究 方法所述，取樣時已避免之，另一方面從表 4-2 結果可以發現四倍體類群內 基因型仍有變異，故排除此因素。二為取樣樣本為無配生殖形成。然而根