哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨之親緣地理及生殖生物學研究

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(1)國立台灣師範大學生命科學系博士論文. 哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨之親緣地理及生殖生物學研究 The study of phytogeography and reproductive biology of Woodwardia harlandii Hook. and W. kempii Copel.. 研究生：張和明 Ho-Ming Chang 指導教授：王震哲博士 Jenn-Che Wang 邱文良博士 Wen-Liang Chiou 中華民國九十八年七月.

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(7) 目. 次. 中文摘要………………………………………………………………………i 英文摘要………………………………………………………………………iv 第一章緒言……………………………………………………………………1 第二章哈氏狗脊蕨複合種群之系統分類學研究…………………………13 壹、前言……………………………………………………………………13 貳、研究材料及方法………………………………………………………15 參、結果與討論……………………………………………………………23 肆、結論……………………………………………………………………41 伍、參考文獻………………………………………………………………42 第三章哈氏狗脊蕨複合種群之生殖生物學研究…………………………45 壹、前言……………………………………………………………………45 貳、研究材料及方法………………………………………………………48 參、結果與討論……………………………………………………………50 肆、結論……………………………………………………………………55 伍、參考文獻………………………………………………………………56 第四章以同功異構? 探討哈氏狗脊蕨複合種群族群遺傳變異…………60 壹、前言……………………………………………………………………60 貳、研究材料及方法………………………………………………………62 參、結果與討論……………………………………………………………64 肆、結論……………………………………………………………………76 伍、參考文獻…………………………………………….…………………77 第五章以葉綠體 DNA 片段序列進行哈氏狗脊蕨複合種群親緣地理學研究……………………………………………………………………81 壹、前言……………………………………………………………………81.

(8) 貳、研究材料及方法………………………………………………………83 參、結果與討論……………………………………………………………90 肆、結論……………………………………………………………………103 伍、參考文獻………………………………………………………………105 第六章總結…………………………………………………………………110 第七章未來展望……………………………………………………………113 謝誌…………………………………………………………………………114 附錄一、葉綠體 atpB-rbcL IGS 單套基因型序列原始資料矩陣…………115 附錄二、葉綠體 trnS-rps4 IGS 單套基因型序列原始資料矩陣…………124 附錄三、細胞核 pgiC intron 14-15 單套基因型序列原始資料矩陣………129.

(9) 中文摘要哈氏狗脊蕨（Woodwardia harlandii Hook.）及細葉狗脊蕨（W. kempii Copel.）為烏毛蕨科（Blechnaceae）狗脊蕨屬（Woodwardia）植物，兩者除葉片形態特徵不同外，無其他顯著差異，而其生態習性雷同及地育地重疊性高等現象，使得此二物種的分類關係一直具有爭議。因此本研究首先針對地理分布、物候現象、細胞學資料與分子遺傳證據進行系統分類學研究，以釐清其系統演化關係。生物的配育系統會影響物種族群內與族群間的遺傳組成，甚至整個物種的演化，因此在進行族群遺傳多樣性與親緣地理學研究之前，先針對台灣產哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨材料進行生殖生物學觀察與試驗，以明瞭其生殖行為與配育系統。最後以同功異構? 電泳分析法與植物葉綠體 DNA 進行族群遺傳多樣性與族群間遺傳變異分布結構之分析，重建種內族群間地理親緣關係與評估族群在地質歷史過程的遷移路線，並檢測不同的地理遷移模式假說。細胞學證據顯示，除了中國大陸廣東省新會地區之哈氏狗脊蕨族群為二倍體外，其餘檢測的哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨族群皆為四倍體，而根據其核基因片段組成基因型的差異性，推測這些四倍體族群皆為異源四倍體（allotetraploid）。除了地理分布或生育環境都高度重疊，共域分布的四倍體哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨更具有一致的物候現象。細葉狗脊蕨在葉綠體與細胞核基因片段均與共域分布的哈氏狗脊蕨有一致的單套基因型，顯示此二種外型不同的類群在遺傳組成上並無差異，而兩者除了葉片分裂型式差異外，其他證據都顯示其並非獨立的分類群。相對地，二倍體的哈氏狗脊蕨與其他四倍體哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨之間在地理分布、染色體倍體性與分子證據都具有明顯區隔，顯示二倍體哈氏狗脊蕨是可與四倍體的哈氏狗脊蕨及細葉狗脊蕨區分的不同生物種。因此哈氏狗脊蕨複合種群實包括二倍體的哈氏狗脊蕨與四倍體的哈氏狗脊蕨及細葉狗脊蕨。台灣產四倍體哈氏狗脊蕨複合種群配子體發育類型 i.

(10) 屬於「三叉蕨型」，成熟配子體以單性配子體為主，雌配子體先熟，雌雄配子體發育成熟時間差距達 3 週，推測四倍體哈氏狗脊蕨複合種群之配子囊個體發生行為有利於異配子體交配，而雌配子體附近小型配子體短時間發育成雄配子體並具有大量藏精器，推測此複合種群具有促精素系統，藉此促進異配子體交配。同功異構? 電泳分析結果顯示二倍體哈氏狗脊蕨族群的基因座平均對偶基因數明顯高於四倍體類群，推測可能原因為大陸廣東新會一帶為上次冰期極盛時祺廣大族群退縮之避難所，因此保留較多的遺傳多樣性。此外，二倍體類群同質合子比例偏高，推測應是華倫得效應（the Wahlund effect）所造成。四倍體哈氏狗脊蕨複合種群對偶基因頻率多形成固定模式，推測應是此多倍體類群是異源四倍體，而多數基因座上固定之異質配對對偶基因則使得四倍體族群內異質合子比例偏高。利用族群間遺傳相似度進行群叢分析，四倍體之哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨族群間 I 值高達 0.919 以上，遠高於蕨類植物種內族群間之最小 I 值，因此推論四倍體之哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨應為同種，而同地區四倍體哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨族群總是擁有近似的對偶基因頻率，亦支持此推論。哈氏狗脊蕨複合群中二倍體類群的葉綠體 DNA 核? 酸歧異度（p=0.00108）高於整體四倍體類群（p=0.00072），而二倍體類群單套型歧異度（h=0.797）亦顯著高於四倍體類群（h=0.294）。二倍體類群之 9 種基因型呈現星狀之譜系關係，且具有較高的單套基因型歧異度與較低的核? 酸歧異度，顯示大陸廣東省新會一帶之二倍體族群有近期族群快速成長與分布範圍擴張現象。以 GST 及 NST 檢測族群間遺傳分化，結果顯示哈氏狗脊蕨複合群、四倍體哈氏狗脊蕨複合群、四倍體哈氏狗脊蕨與二倍體哈氏狗脊蕨等四群之群內族群間都具有明顯的遺傳分化，且其 Nst 與 Gst 值都具有顯著差異，顯示各群內族群間都具有明顯的親緣地理結構。15 種葉綠體單套基因型中大陸廣東新會一帶之二倍體族群具有 9 種單套基因型，其中 8 種更是侷限分布於此，推測此地. ii.

(11) 區是二倍體類群長期之避難所。大陸南嶺及海南島地區族群同時都具有兩群序列差異頗大的基因型，其可能為最後一次冰期以來其他地區族群擴散之溶匯點（melting point），因此都具有較高之核? 酸歧異度。台灣烏來地區為另一可能之避難所，根據所擁有之 2 單套基因型與葉綠體非編碼區突變率推算，此地區族群可能在最近一次冰期開始前即已存在。本研究所使用之 DNA 序列證據並不支持 Cranfill 之異地種化再共域分布之族群遷徙假說，而核 DNA 單套基因型部分地區的地理變異則對本研究所主張之由北向南多路線族群遷徙假說提供部分的支持。. iii.

(12) 英文摘要 Woodwardia harlandii Hook. and W. kempii Copel. are two Woodwardia species of Blechnaceae. They have no distinct difference in morphology excepting the division of fronds. The systematic relationship between them is a controversial issue until now because of their similar ecology and sympatric distribution. We first implement the systematic study, by distribution pattern, phonological observation, cytological data and molecular evidences, to find their phylogenetic relationship. Mating systems would determine the infraspecial genetic contents and evolutionary process of a species. Therefore, the reproduction study of these two species was conducted, before the population genetic and phylogeographic studies proceeding, to have insight into the reproductive mode and mating system. Finally, genetic diversity and genetic structure of populations are studied by allozyme analysis and chloroplast DNA sequence to find the genetic relationship among populations, to infer the migration route in the geological history, and to test the different hypotheses of geographic distribution and transition of population. Cytological results show that all populations detected are tetraploid but the two ones, which are diploid, at Hsinhui in Guangtung Province of China. According to the distinction between the nuclear haplotypes, these polyploidy taxa are determined as allotetraploid. Addition to sympatric distribution and similar habitants, the phenology is identical for the tetraploidy W. harlandii and W. kempii living in the same habitat. Although having different division of fronds, these two species living sympatrically show the same genetic contents in both nuclear and chloroplast genes. All characters excepting morphology indicate that, without essential difference, they are not ‘good’ species. On the other hand, the results of distribution information, cytological data and molecular evidences indicate that diploidy W. harlandii and tetraploidy W. harlandii and W. kempii belong to two different biological species. Therefore, the W. harlandii species complex iv.

(13) comprises diploidy W. harlandii and tetraploidy W. harlandii and W. kempii. The prothallial development is Aspidium type. Almost all the gametophytes are unisexual, in which the female ones reach mature 3-week earlier than the males. The sexual progression of the gametophytes promotes the intergametophytic mating in tetraploidy W. harlandii complex. The observation that lots of small-size gametophytes nearby the female one become male and bear numerous antheridia in a short period indicates this complex producing antherridiogen to favor cross-fertilization. The results of allozyme analysis show that the diploidy W. harlandii complex has much higher mean number of alleles per locus than the tetraploids. The interpretation for this high value is that the population maintains significantly high genetic diversity because it was a refugium at Hsinhui in the last glacial period. The population there, however, has relatively high proportion of homozygotes. It might be the outcome of the Wahlund effect. Allele frequencies for the populations of tetraploid W. harlandii complex usually become fixed pattern. These taxa should be allotetraploids and have high proportion of heterozygotes within the populations because high percentage of fixed- and heterozygous-allele loci. The genetic identity of I is less than 0.919 between the populations of the tetraploidy W. harlandii and W. kempii, which is much higher than the mean genetic identity among the populations of the same species. The result of this UPGMA analysis consists with the argument that the tetraploidy W. harlandii and W. kempii should be the same species. Additionally, the fact that sympatric populations of these two tetraploids always have similar allele frequencies at most loci also supports the above argument. In W. harlandii species complex, diploidy taxon have higher nucleotide and haplotype diversities (p=0.00108, h=0.979) of chloroplast DNA than those of tetraploidy taxa (p=0.00072, h=0.294). In the diploidy taxon, the lineage relationship of its nine haplotypes shows a star-like pattern. In addition, this taxon has high haplotype diversity but low nucleotide diversity. These results indicate the populations at Hsinhui grow rapidly and experience a recent range expansion. v.

(14) The GST and NST indices of genetic differentiation indicate the populations of four groups of diploiy W. harlandii, tetraploidy W. harlandii, tetraploidy W. harlandii complex, and W. harlandii complex all show significantly genetic differentiation. The GST significantly higher than NST in all four groups indicates the populations of these four groups all show obviously phylogeographic structure. The diploidy populations at Hsinhui have nine ones, in which eight are endemic, of total 15 cpDNA haplotypes. Therefore, it is proposed that Hsinhui is a long-term refugium for diploidy taxon. The cpDNA haplotypes of the populations in Nanling Mountain Ridge and Hainan Island both include two groups of highly variant sequences. It may be the effect of melting point after the last maximum glacial period that there are high nucleotide diversities in both areas. According to the mutation rate at the noncoding region of cpDNA, Urai in Taiwan might be another candidate for refugium. The Urai populations having two haplotypes might exist before the last maximum glacial period. The hypothesis of Cranfill about migration pattern of historical populations is rejected by the molecular evidences in this study. However, the hypothesis of multiple migration routes directly from the north to the south proposed in this study is partially supported by nuclear DNA.. vi.

(15) 第一章緒言台灣島垂直海拔落差大，地形地貌複雜，加以位處熱帶與溫帶交會的亞熱帶，因而孕育了多樣的生物種類。台灣島因菲律賓海板塊碰撞歐亞大陸板塊而產生，至今仍持續隆起長高。目前台灣與亞洲大陸間雖有台灣海峽阻隔，然而在第四紀以來重複發生的冰期— 間冰期循環中，台灣島時而與大陸相連結（冰期），時而因海平面上升而與亞洲大陸分隔（間冰期）。冰期時，台灣島西部常是全面地與大陸相連接，甚至以陸橋方式串連至琉球群島，因此冰期時生物可以自由地遷徙於此擴張的亞洲大陸地區。最後一次冰期冰河開始撤退後（大約距今二萬年前），全球氣溫逐漸回升，海平面上升造成這些與大陸相連接的島嶼再次各自獨立，而成為今日所見的地理樣式，生物族群亦因為海洋水位上升而隔離。台灣屬於大陸性島嶼，島內多數生物與亞洲大陸都具有密切的關係，或為同種，或為關係極為密切的近緣種，因此探討台灣與亞洲大陸生物的關係，特別是同時分布於台灣、大陸及其他鄰近亞洲地區的物種或近緣種的族群關係，有助於釐清過往地質歷史對於物種演化與地理族群播遷過程的影響。生物的地理分布模式是由許多因子相互作用所建立的，這些因子一般可歸類為生態與歷史兩大部分(Barrington, 1993)，其中歷史因素包括兩種不同的作用機制：散播(dispersal)與片段化(vicariance)（Kato, 1993; Avise, 2000），這兩者在物種演化歷史上具有不同權重的影響。植物生育地範圍的拓殖需靠種子或孢子的散播，而隔離機制(isolating mechanism)的形成則阻隔基因流傳，並產生遺傳分化，進一步可能發生種化作用(Avise, 2000; Coyne & Orr, 2004)。因此欲測試某一特定分布模式究為上述二機制中何者所造成，或其發生先後順序，可藉由分析近緣種或同種不同地理族群的遺傳變異、基因型差異與族群分化程度推估（Crawford et al., 1992; Cain et al., 2000），而根據溯祖理論（coalescent theory）仔細探究基因型在譜系關係樹 1.

(16) 的分布，即可推估形成族群現今結構或分布模式可能的過往演化事件或過程（Page and Holmes, 1998）。親緣地理學為 Avise 等（1987）所提出有關歷史性生物地理學（historical biogeography）的觀念，主要在探討物種的演化與地質歷史之間的關係。親緣地理學與傳統地理學的差異在於後者通常重視較高分類群的地理分布，但親緣地理學的研究雖不排除高階分類群的探討，但主要的研究對象則是來自共同歷史起源的近緣物種及種內族群間的關係，並藉由不同族群間的遺傳變異，分析探討現今物種分布模式的形成機制。因此親緣地理學的研究被視為族群遺傳（或稱微演化（microevolution））與種化（或稱巨演化（macroevolution））之間的橋樑（Bermingham and Martin, 1998; Avise, 2000）。近年累積的研究結果顯示，分子生物學技術提供了研究物種親緣關係與生物地理分布的定量分析方法（Lee et al., 1996; Huang and Chen, 2000; Chiang et al., 2001; Huang et al., 2001; Lin et al., 2002; Liu et al., 2002），其中具有保守特性的同功異構? 雖然會造成所獲得遺傳變異偏低（Bossart and Prowell, 1998），但其電泳分析結果可以提供基因體規模的遺傳資訊，以了解植物遺傳結構與配育系統（Paris and Windham, 1988; Soltis and Soltis, 1990），並可探究多倍體物種的起源過程（Hauk and Haufler, 1999）。越來越多基因體 DNA 的非轉錄區（noncoding region）序列在近幾年被廣泛應用在獲得族群遺傳變異及系統發育訊息（Clegg et al., 1994; Demesure et al., 1996; Huang et al., 2001），一般認為此類 DNA 區域因無功能限制，具有自由變異與快速演化特性，可提供足夠演化訊息，因而適合於評估物種傳播能力，及在地質歷史過程的遷移路線（Ferris et al., 1995; Small et al., 2005）。蕨類植物藉由孢子進行長距離的傳播，由於其孢子體與配子體彼此皆可獨立存活，所以生活史中此兩種不同階段的生物學性質與蕨類植物的地理分布都有關連（Kato, 1993）。蕨類植物擁有不同於裸子植物與被子植物. 2.

(17) 獨特的散播與配育系統（mating systems），使其遺傳系統與演化潛力不易全面地瞭解，造成在物種遺傳與演化理論基礎的發展遭遇較多的困境（Haufler, 2002），但如此獨特的生物學特性卻也使得蕨類植物成為親緣地理學研究上極佳之題材。蕨類植物配子體階段不同的配育系統除了影響族群遺傳組成的變異度外，對於物種族群的分布與擴散更扮演關鍵性角色，因此有關蕨類植物的生殖生物學（reproductive biology）研究，是探討不同蕨類植物族群遺傳組成模式差異的重要基礎資料。此外，蕨類植物的配育系統亦與染色體倍體性（ploidy）有關，近年來的研究結果顯示，二倍體物種傾向於異配子體交配，且具有較高的遺傳負荷，多倍體物種則傾向於同配子體自交，並具有較低的遺傳負荷（Masuyama, 1979; Hedrick, 1987; Masuyama et al., 1987; Masuyama and Watano, 1990; Chiou et al, 2000），因此傾向於同配子體自交的多倍體孢子似乎遠比二倍體孢子有利於長距離散播並建立新族群（Ranker et al., 1994; Haufler, 2002），這也為海洋性島嶼具有較高比例蕨類植物（Smith, 1972）提供一合理解釋。台灣位於亞洲大陸東緣的樞紐位置，常為植物播遷的中途站，因此匯集了不同地理區的植物種類，此為台灣島內蕨類植物物種密度與種歧異度均甚高的因素之一（郭城孟, 1998）。烏毛蕨科（Blechnaceae）分布在台灣的種類數雖然僅 11 種，然卻包含了 5 個屬（Chiou et al., 1994），其中以狗脊蕨屬（Woodwardia）物種數最多（5 種）。化石記錄顯示烏毛蕨科狗脊蕨屬植物具有典型的第三紀泛北極區系分布模式（Arcto-Tertiary pattern; Cranfill, 2001; Collinson, 2001），最早的狗脊蕨屬化石記錄可回推至第三紀之古新世（Paleocene; Collinson, 1996; 2001）（圖 1-1），甚至中生代白堊紀（Cretaceous）晚期（陶君容﹐1992），分布地點皆於環北極地區（circum-Arctic paleolatitudes），當時之氣候狀態為平穩的溫暖潮溼氣候，而自第四紀漸新世（Oligocene）及中新世（Miocene）後之氣候變動（Comes. 3.

(18) 圖 1-1、狗脊蕨屬植物第三紀化石分布（改自 Collinson, 2001）。圖中包括紫萁屬 Osmunda(Osm) 、冷蕨屬 Coniopteris(Con) 、球子蕨屬 Onoclea(Ono) 及狗脊蕨屬 Woodwardia(Woo)等四屬，其中狗脊蕨屬分布地點以星號標明。. & Kadereit, 1998），與中新世晚期之氣候逐漸變冷涼，環北極地區逐漸轉變成乾冷氣候而不再適合狗脊蕨屬植物的生存，促使其逐漸向南遷徙，加上期間所可能發生的物種滅絕事件，而使原有或多或少的連續性分布模式變成片段化。許多東亞-北美間斷分布（disjunctive distribution）的屬或種 4.

(19) 對都具有類似的形成過程（Guo, 1999; Liu et al., 2002），如蕨類植物中的球子蕨屬（Onoclea）、紫萁屬(Osmunda)，裸子植物中的銀杏屬(Ginkgo)、落葉松屬(Taxodium)、長葉世界爺屬(Sequoia)、水杉屬(Metasequoia)，以及被子植物中的木蘭屬(Magnolia)、鵝掌楸屬(Liriodendron)及木察樹屬 (Sassafras)等都具有此類型分布模式(陶君容﹐1992; Collinson, 2001)。現存狗脊蕨屬植物的分布式樣基本上符合東亞-北美間斷分布模式（Cranfill & Kato, 2003），其中除了二種（W. auriculata 及 W. unigemata）向南分布至南半球舊熱帶地區（paleotropical regions）外，其餘均以北半球溫帶及亞熱帶地區為其主要分布範圍，其中歐洲有 1 種，北美洲產 4 種，而東亞及東南亞一帶則有 7 種（Cranfill & Kato, 2003）。東亞及東南亞一帶為現存狗脊蕨屬植物物種密度最高、分布最集中的地區，故大陸學者裘佩熹（1974）曾主張中國為本屬的分布中心，Cranfill（2001）則認為東亞及北美同為多樣性中心，而造成此種不同地理區域種數的差異應是第四紀以來冰河循環作用，與板塊上不同山脈走向所造成（Guo, 1999）。哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨是台灣產 5 種狗幾屬蕨類植物之其二，一度因形態上與北美產的 Lorinseria areolata (L.) Presl 相似而置於 Lorinseria 屬中（Smith, 1875），或一起組成狗脊蕨屬內 Lorinseria 亞屬（Cranfill, 2001），然而綜合形態特徵與葉綠體 DNA 證據深入分析後（Cranfill & Kato, 2003），結果證實哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨仍是關係最親近的姊妹群，而與 Lorinseria areolata 系統演化關係則甚遠。哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨分布範圍自日本南部，經琉球群島、台灣、中國大陸東南沿海省分至越南北部、泰國東北（Chiou et al., 1994; Iwatsuki, 1995; Boonkerd & Rossarin, 2004），為東北西南方向的帶狀分布，兩者的地理分布範圍基本上重疊，而雖然細葉狗脊蕨分布地點較少，但其多數生育地都與哈氏狗脊蕨共域分布。Cranfill （2001）曾針對具有相同生態需求與近似地理分布模式的哈氏狗脊蕨及細. 5.

(20) 葉狗脊蕨此一種對，提出了「異地種化再共域分布」的假說，即來自共同祖先種的不同族群分別在大陸地區（W. harlandii）與島嶼地區（W. kempii）種化，爾後再散佈至彼此生育地，形成今日之分布模式（圖 1-2）。Cranfill 的假說顯與一般所認知大陸性島嶼的生物種類來自鄰近大陸的觀念不同，而若此假說成立，則哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨分別擁有方向相反的族群地理親緣關係。. 圖 1-2、Cranfill(2001)異地種化再共域分布假說示意圖。實線表示細葉狗脊蕨分布範圍，虛線表示哈氏狗脊蕨分布範圍，實線箭頭表示哈氏狗脊蕨族群的擴散方向，虛線箭頭則表示細葉狗脊蕨族群的擴散方向。. 狗脊蕨屬植物第三紀的化石紀錄分布於環北極區，根據此歷史分布模式與現今地理分布範圍，本研究認為不管哈氏狗脊蕨或細葉狗脊蕨都是在今日更北的地理區域種化形成後，再隨著氣候的改變而多路線地逐漸向南遷移至接近現在的分布範圍（圖 1-3），第四紀以來的冰期循環雖然會造成其分布範圍之波動，然推測其皆屬較短距離之族群擴展與退縮，不致於對此二物種整體分布模式有顯著改變。此假說若成立，則哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨不同地理區族群之遺傳距離遠大於同一地理區內族群之遺傳距離。 6.

(21) 圖 1-3、本研究針對哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨分布所提出由北向南遷移假說示意圖。實線表示細葉狗脊蕨分布範圍，虛線表示哈氏狗脊蕨分布範圍，實線箭頭表示哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨族群的擴散方向。. 根據野外的觀察結果顯示，哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨在台灣僅分布於北部低海拔山區 500 至 700 公尺海拔範圍，其均喜好生長於小稜脊或近稜脊邊坡的林緣地帶，通常出現於山徑兩旁，陰暗的林下地被層偶見其蹤跡，惟生長情形較不佳，生育地林分大多為長尾栲、紅楠及山紅柿等優勢的暖溫帶常綠闊葉林。哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨形態特徵除了葉片羽裂方式不同外，並無其他差異，加以其生態習性雷同及地育地重疊性高等現象，此二物種的分類關係一直具有爭議，因此本研究首先針對其形態學以外特徵，即地理分布、物候現象、細胞學資料與分子遺傳證據進行系統分類學研究，希望能釐清此二狗脊蕨之系統演化關係。許多生物學的特徵會影響物種族群內與族群間的遺傳組成，甚至整個物種的演化，其中生物的配育系統（mating system）扮演關鍵性的角色（Lowe et al., 2004），其決定族群內與族群間基因交流的幅度。因此欲探討特定物 7.

(22) 種現今的族群分布模式與遺傳組成關係，必須先清楚其生殖行為，也就是必須明瞭配育系統後方能對物種的分布與遺傳組成提出合理之解釋。所以本研究針對台灣產哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨材料進行生殖生物學觀察與試驗，希望能明瞭其生殖行為與配育系統。同功異構? 電泳分析法可以研究種內族群的遺傳多樣性與族群遺傳結構，評估物種的配育系統，也可以探討種間的親緣關係與種的界定。此外這種分析方法可以快速地檢測多倍體複合群的遺傳多樣性，有效地推斷雜交種或多倍體類群的親本。本研究利用同功異構? 電泳分析法，分析哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨各地區族群的遺傳多樣性，以及族群間遺傳變異分布模式與結構，並探討其配育系統，藉此評估族群遺傳多樣性與地理分布的關係。植物的胞器 DNA 具有單系遺傳與不具遺傳重組等特性，其中葉綠體的非編碼區（noncoding region）因不具功能限制而有高度的遺傳變異，可提供足夠系統發育與演化訊息，因此適合於建構屬以下分類群的系統演化關係，以及種內族群間地理親緣重建與評估在地質歷史過程的遷移路線。本研究利用哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨葉綠體 DNA 的變異來探討此二物種的親緣關係、族群遺傳多樣性與地理親緣關係，並根據葉綠體基因型的地理分布檢測不同的地理遷移模式假說。. 參考文獻陶君容﹒1992﹒中國第三紀植被和植物區系歷史及分區﹒植物分類學報 30(1): 25-43. 郭城孟﹒1998﹒台灣蕨類植物區系之研究﹒於邱少婷及彭鏡毅（主編） ﹐海峽兩岸植物多樣性與保育論文集﹐pp. 9-19﹐國立自然科學博物館﹐台中﹒ 8.

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(27) 第二章哈氏狗脊蕨複合種群之系統分類學研究壹、前言哈氏狗脊蕨(Woodwardia harlandii)及細葉狗脊蕨(W. kempii)為烏毛蕨科 (Blechnaceae)狗脊蕨屬(Woodwardia)植物。本屬植物外部形態的主要特點為︰沿主脈及羽軸兩側各有一列平行於主脈或羽軸的狹長網狀脈，其外側尚有 1 至 2 列多角形的網眼，網眼內不具小脈，其餘葉脈均為游離，游離脈通常極短，直達葉片邊緣；孢子囊群為線形或橢圓形，呈不連續、單列平行著生於主脈或羽軸兩側的狹長網眼上，並多少陷入葉肉中，成熟時囊群蓋朝主脈或羽軸開裂而宿存(裘佩熹, 1974; Cranfill﹐2001)，染色體基數為 31、34 或 35（Kramer, 1990; Takamiya et al, 1992; Cranfill, 2001）。哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨的形態差異僅在於羽裂方式不同，其中哈氏狗脊蕨葉片為單葉至一回羽狀複葉，細葉狗脊蕨則為二回羽狀裂葉。哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨於近年來多數的分類處理 (Kramer, 1990; Chiou et al., 1994; Iwatsuki, 1995; Cranfill, 2001) 皆置於狗脊蕨屬 (Woodwardia)，Smith(1875)曾將哈氏狗脊蕨併入 Lorinseria 屬中，而大陸學者秦仁昌(1964)則根據此二物種之根莖長橫走、葉柄極長、葉片簡化（三出至羽狀深裂）、孢子囊群表面生（不陷入葉肉中）、及孢子具有明顯的翅狀周壁等特徵，將其處理成獨立一新屬— — 崇澍蕨屬（Chieniopteris，又稱假狗脊蕨屬）(秦仁昌, 1964; 裘佩熹, 1974; 吳兆洪, 1999)。 Cranfill（ 2001）在進行狗脊蕨屬植物的專論性研究後，共處理為 14 種，並將一些曾被分立的小屬，如 Anchistea、Chieniopteris 及 Lorinseria，皆併入狗脊蕨屬中，而在屬內設立 Lorinseria 及 Woodwardia 兩個亞屬。根據其處理，哈氏狗脊蕨及細葉狗脊蕨與美洲產的 W. areolata 共同組成 Lorinseria 亞屬，其餘種類則歸屬於為 Woodwardia 亞屬，此結果與 Tagawa（1936）的處理一致。Cranfill & Kato（2003）以形態特徵與葉綠體 DNA 序列進行狗. 13.

(28) 脊蕨屬的親緣關係研究，其結果支持 Anchistea 及 Lorinseria 為獨立的屬，其他種類則形成單系群之狗脊蕨屬（Woodwardia），而哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨包含於其中，並被提議單獨組成崇澍蕨組。屬的歸屬及屬內位置雖然已較為明朗，然而哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨彼此的關係一直存在爭議，日本學者 Masamune(1930)曾將細葉狗脊蕨處理為哈氏狗脊蕨的變種(W. harlandii var. takeoi (Hayata) Masamune)，而 Christensen (1934)及 Tagawa (1936)更直接將 W. kempii Copel.處理為 W. harlandii Hook.的同物異名，然而近十幾年的分類處理普遍接受其為不同的物種(Chiou et al, 1994; Iwatsuki, 1995; Cranfill, 2001; Cranfill & Kato, 2003; 吳兆洪, 1999)。物種種化的過程主要在於生殖隔離機制的形成，一般常見的生殖交流阻斷方式為地理上的分隔（Cox & Moore, 2000），也就是所謂的異域種化（allopatric speciation）。異域種化常是為適應不同環境的選汰加上基因交流中斷所形成，因此表現在地理分布上，分化的物種常具有不同的分布範圍或不同的分布模式，而即使後來再因族群擴散而共域分布，物種間也會因生態需求不同、生殖週期不同或遺傳分化所形成的內在生殖隔離機制而有所區隔。因此，地理分布資訊可提供物種間關係的基本訊息，當近緣分類群間尚未建立完善的生殖隔離機制時，有效的地理隔離方足以維持其為獨立可區分的物種。同域種化（sympatric speciation）的實例較少，在維管束植物達成同域種化最常見的方式為染色體套數的改變，也就是在同區域內形成不同倍體性的群體，而這些不同倍體性物種間常經由雜交後代的不孕性來形成生殖上的隔離。因此多倍體化可以使得植物在短時間內種化，而此分化類群間在遺傳物質上顯現親緣關係接近，然卻有顯著的生殖隔離。生殖週期或生殖行為的差異是另一種隔離機制，然而這樣的差異通常是異域種化的結果。當分隔的族群為了適應當地環境而有固定的生殖週期或生殖行為模式，當已分化的族群個體再共域生長時，這樣固定的生殖週期或. 14.

(29) 行為會阻礙其基因交流，因而能保持甚至強化其遺傳的分化。維管束植物的系統分類傳統上是以植物形態特徵為基礎，並廣納其他生物學資訊作為分類處理的佐證（Stuessy, 1990），這其中包括分布資訊、物候學資料、染色體訊息、遺傳學資訊、生殖交配試驗結果及分子生物學證據等。除了形態學資料以外其他資訊的多寡與可獲得性，會影響系統分類學者最後的分類處理，因此各種生物學資訊越充足，越能獲得一充分反應物種系統演化關係的分類結果。為解決哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨長久以來的分類爭議，本研究針對其地理分布資訊、物候現象、染色體資料及分子生物學證據進行資料收集、野外觀察與實驗分析，希望能對於其分類關係有更充足的證據支持。. 貳、研究材料及方法一、地理分布資訊參考主要標本館標本記錄與相關文獻，並至各地調查採集，野外發現哈氏狗脊蕨或細葉狗脊蕨族群時，觀察記錄其所在位置的生態環境。將標本館標本記錄及野外調查發現之地點，標示於地圖上。. 二、物候學資訊研究區設於台灣北部烏來地區雲仙樂園，海拔高約 450 公尺，生育地為次生闊葉林林緣，本研究調查時間為 2000 年 4 月起至 2003 年 12 月，共計 3 年 9 個月。哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨各選定 20 株，共計 40 株，每月 10 日前後進行調查，整理並統計各月之觀測結果，分析比較二物種之物候特性。本研究將蕨類各葉片發展與孢子囊發育之物候區分如下：葉片發展： 1. 幼葉捲曲期：新葉完全捲曲，未見葉肉。 15.

(30) 2. 幼葉辦捲期：可以明顯地看出葉肉，但尚有部分葉片或羽片捲曲。 3. 幼葉平展期：葉片完全平展，但尚未轉變為成熟葉色。 4. 成熟葉期：葉片平展，具成熟健康葉色。 5. 落葉期：葉片出現黃或褐色斑點或斑紋，至葉片完全掉落止。. 孢子囊發育： 1. 孢子囊發育期：孢子囊群凹陷至孢子囊飽滿但為淡黃色之時期。 2. 孢子囊成熟期：孢子囊飽滿且呈現成熟之黃褐色。 3. 孢子釋放期：孢子囊成熟且開始釋放。 4. 孢子囊殘存期：孢子囊內孢子已完全釋放，僅剩殘存之孢子囊殼。. 三、細胞學證據（一）染色體直接檢定以下列步驟進行根尖染色體數目之觀察 1. 根尖取下後，立即置於 18-20℃，0.002 M 之 8-hydroxyquinone 溶液中靜置處理 3-5 小時，溶液需為根尖之 20 倍體積以上。 2. 將材料取出，置於絕對酒精：冰醋酸（3：1）固定液內固定，過夜，但勿超過 24 小時。 3. 將材料換至 70%酒精溶液中保存。 4. 壓製前，將材料置於 60℃，1N HCl 溶液中加熱 8 分鐘，再以 pectinase 溶液解離數分鐘。 5. 以醋酸洋紅壓片法（acetocarmine squash method）製成染色體玻片，於光學顯微鏡下觀察有絲分裂時之染色體數目，並拍照記錄。（二）流式細胞術（flow cytometry, FCM）分析材料準備： 1. 取新鮮葉片葉柄部位，切成小段後，加入 1ml PI/Triton X-100（終濃 16.

(31) 度 PI= 20ug/ml, Triton-X 100=0.1%, RNase A= 0.2mg/ml），再以刀片將材料切碎呈泥狀，避光染色至少30分鐘。 2. 上機前打散細胞並以 35um 尼龍篩網過濾樣本。 3. 另取煙草葉片進行上述步驟，做為C value比對之基準值。. 上機操作： 1. 儀器設定：選擇設定以下參數：FS Lin、SS Lin、FL Lin、FL Peak、 Ratio（Ratio= FL Peak/ FL Lin），門檻值設定於FL。 2. 分析圖形：先以煙草樣品進行分析，調整FS、SS 電壓及Gain值，使細胞群落在FS Lin- SS Lin 圖形中央，再於FL Lin- FL Peak圖形調整 FL 電壓及Gain值設定，於FL Lin histogram 分析單顆細胞的螢光訊號。. 四、DNA 分子證據（一）研究材料：於台灣北部及東亞地區採集哈氏狗脊蕨複合群材料，共計取得 14 個族群共 364 棵植株樣品（表 5-1），其中台灣有 3 個族群 120 棵植株樣品，日本 2 個族群 41 棵植株樣品，大陸 8 個族群 183 棵植株樣品。取樣時自野外族群採集新鮮健康之新葉，或於野外即以矽膠進行快速乾燥，而後置於超低溫冷凍櫃備用。（二）研究方法： 1. DNA 萃取：以 Viogene® 的 Plant Genomic DNA Miniprep System Kit 進行 DNA 萃取。 (1) 取約 100mg 的植物材料，以液態氮研磨至粉末狀，並移至一離心管中。 (2) 加 400µl 的 PX1 溶劑及 4µl 的 Rnase (100mg/ml)，經振盪均勻混 17.

(32) 合後，置 65℃水浴 10 分鐘。 (3) 回室溫後，再加 130µl 的 PX2 溶劑至管中，經振盪均勻後，置冰浴 5 分鐘。 (4) 將反應完後之黏稠混合物移至過濾管（Shearing tube）內，再置於收集管上，經高速離心 (10,000rpm) 後，將液狀物質過濾至收集管中。 (5) 加 0.5 體積的 PX3 溶劑與等體積的純酒精，至步驟 4 所收集之回收管內，並以吸管充分混合。 (6) 取步驟 5 的混合液 650µl，移至離心柱（Spin column）內，再置於收集管上，經高速離心 1 分鐘後，將濾出液丟棄。 (7) 重複步驟 6，至步驟 5 的樣品全部處理完。. 表 2-1、Codes and sample size for populations of Woodwardia harlandii complex in this study. Shaded rows indicating the diploid populations while the others being tetraploid. Population (Code) Sample size 台灣 142 烏來(TY)** 100 陽明山(TS)** 22 貢寮(TT)** 20 日本 39 九州屋久島(JY)*** 20 琉球沖繩島(JO)* 19 中國大陸 183 香港(HK)** 33 福建南靖(CF)* 10 海南島(CH)* 15 廣東從化(CC)** 17 湖南南嶺莽山(CN1)* 10 廣東南嶺連州(CN2)* 11 廣東南嶺乳源(CN3)* 4 廣東新會古兜山(CG1)* 39 廣東新會大圓嶺(CG2)* 44 * 表示僅發現哈氏狗脊蕨之地點 ** 表示哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨共域分布之地點 *** 表示僅發現細葉狗脊蕨之地點 18.

(33) (8) 用 0.7ml 的清洗劑，以 30 秒高速離心的方式清洗離心柱 2 次，將濾出液丟棄。 (9) 高速離心 2 分鐘，去除殘留的清洗劑。 (10) 將過濾管 (2) 移至新的離心管 (1.5ml) 中，加 200µl 的 0.1×TE 緩衝液（事先預熱至 65℃），以高速離心的方式將 DNA 溶至離心管中。 (11) 將 DNA 保存於 -20℃。. 將以上兩種萃取方法所得之 DNA 溶液，以 1× TBE buffer 所配製的 1% agarose gel（內含 0.25 µg/ml 之 Ethidium Bromide 染劑），進行電泳約 30-50 分鐘後，利用已知濃度的 DNA Marker 比對所萃取的 DNA 之品質及濃度後，再將 DNA 濃度稀釋成 10 ng/µl，保存於 4°C 備用。 2. PCR 反應： (1)引子的選擇：選用的 DNA 片段為 atpB-rbcL 及 trnS-rps4 等 2 基因區間片段，其中 atpB-rbcL 片段參考 Chiang et al.(1998)設計的引子( atpB-1 及 rbcL-1)，再重新設計更專一性之引子（atpB-F: 5’-CCRAGAGTAGT TTCACCAA-3 及 rbcL-W: 5’-TCGGTATCTTTGGTCTTGTAT-3’），進行 atpB-rbcL 基因區間片段的擴增。trnS-rps4 片段則參考 Smith and Cranfill (2002)之引子（trnS R 及 rps4 R1），再重新設計更具專一性之引子（tSr4-W-f : 5’-CCGAGGGTTCGAATCCCTCC-3’及 tSr4-W-r : 5’-GCCAATCGAGAATCCGTCAATTT-3’）。核 DNA 部分選用單一拷貝的 pgiC 基因片段，擴增放大的範圍包括 intron 14、 15 及 exon 15，引子則是參考 Ishikawa 等（2002）設計之引子序列，再重新設計專一性更高的引子（pgiC-14fA：5’-GTG CTT CTG GGT. 19.

(34) CTT TTG AG-3’及 pgiC-16rA：5’-GTT GTC CAT TAG TTC CAG GT-3’）. (2)PCR 反應試藥與濃度：每個 PCR 反應試劑體積為 50µl，各試藥之濃度、所需體積及最終之反應試劑濃度如下（參考 Viogene Biotek® 之濃度配方）：. 試藥. 所需體積. 10×PCR buffer (with 15mM MgCl2 ,. 反應試劑最終濃度. 5µl. 1×. 10mM dNTP mixture. 1µl. 0.2 mM each. Primer mix(10u M each). 2.5µl. 0.5uM each. Template DNA. 1-10µl. VioTag DNA polymerase. 0.5µl. Autoclaved distilled water to. 50 µl. Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 1% Triton X-100, 50% glycerol). 2.5 units. (3) PCR 反應條件： PCR 反應採用之溫度週期及流程如下： a. 先以 94 °C 處理 5 分鐘，使雙股 DNA 變性。 b. 再以 94 °C（變性溫度）一分鐘、53 °C（鏈合溫度）一分鐘、72 °C （延長溫度）兩分鐘，進行 35~40 次的擴增循環。 c. 最後保持 72 °C 處理 8 分鐘。 d. 反應產物溫度降至室溫或 5°C 保存。 (4) PCR 結果檢測：以 1× TBE buffer所配製成之 1% agarose gel （內含 0.25 µg/ml之 EtBr 染劑）在 110mA 條件下，進行電泳約 30 分鐘後，隨即於紫外燈上 20.

(35) 觀察及記錄 PCR 產物的分子量、濃度及產物條帶是否單一。每次電泳中並加入分子量參考標記（molecular weight marker, 100 bp DNA ladder, Violet)，以標示 PCR 產物條帶的分子量並當作 PCR 產物之 DNA 濃度的參考。 3. PCR 產物之純化回收﹕ 利用 Viogene® Gel Extraction System Kit 純化回收，步驟如下: (1) 將所有 PCR 反應溶液取出，加入 1/10 體積的 loading dye，以 1.2% agarose gel進行電泳約 100 分鐘，於紫外燈上觀察並將膠片上的 PCR 產物切下（約 100 mg）放入 1.5ml 的離心管中。 (2) 加入 0.5 ml 的 GEX buffer，以 60℃水浴至少 10 分鐘直至 gel 完全溶解並使其與 buffer 均勻混合及反應。 (3) 先將 Kits 內附之 Gel extraction column 置入於收集管之上方，再將反應完全之溶液（約 0.6ml）以吸量管吸取入 Gel extraction column 內。 (4) 高速離心（10,000g）約 1 分鐘後，DNA 留滯於 Gel extraction column 之濾膜上，將濾出液丟棄。 (5) 以 0.5ml 之 Wash I buffer 沖洗濾膜上的 DNA，再以高速離心 1 分鐘後將濾出之沖洗液丟棄。 (6) 以 0.7ml 之 Wash II buffer 沖洗濾膜上的 DNA，以高速離心 1 分鐘後將濾出之沖洗液丟棄，此步驟進行兩次。 (7) 高速離心 3 分鐘，將殘餘之沖洗液完全濾出。 (8) 將 Gel extraction column 置於新的 1.5ml 離心管上，加入 30µl 的 ddH2O (60℃)於濾膜上，靜置約一分鐘後再以高速離心 2 分鐘將 DNA 濾至離心管內，完成 PCR 產物之純化回收。 (9) 取 2 µl 混合 1/10 體積的 loading dye，進行 1%瓊脂膠體電泳，觀察. 21.

(36) 回收效果是否良好，並估算 DNA 片段的濃度，以便進行直接定序，保存於-20℃備用。 4. DNA 定序： DNA 片段經純化回收後，以自動定序儀定序。 5. 資料分析： (1)序列分析：以 BioEdit 7.0 軟體進行序列排序，並以手動調整，再以 DNaSp 4.10.9 程式（Rozas and rozas, 2000）計算變異位點之比例、單套基因型歧異度（haplotype diversity, h）及核? 酸歧異度（necleotide diversity, π）。 (2)親緣關係樹之建構： a. 鄰接法分析利用 MEGA 4 程式（Tamura et al., 2007）以鄰接法（Neighbor joining, NJ），建構葉綠體單套型間之親緣關係樹。分析時遺傳距離採用 Kimura’s two-parameter，鹼基缺失（gap）設定為第五種鹼基（fifth base），再進行 1000 次的 Bootstrap 檢定，以獲得各分支支持度。 b. 貝葉氏法分析利用 MrBayes 3.0b4（Huelsenbeck & Ronquist, 2001）進行貝葉氏法（Bayesian inference analysis）分析，核? 酸替代模型設定為 GTR+G，採用 MCMCMC （ Metropolis-coupled Markov Chain Monte Carlo）演算法，以隨機樹為起始樹，進行 1,000,000 個 generation，每 1000 個 generation 取一次值，前 25％產生資料作為老化樣本（burnin）捨棄，總和剩餘資料後計算得各節點之機率值。. 22.

(37) 參、結果與討論一、地理分布資訊根據各主要標本館標本記錄及野外調查結果，配合文獻紀錄資料（嚴等, 2003），哈氏狗脊蕨複合種群主要分布於東亞及東南亞北部地區（圖 2-1），分布模式約略等於 Kuo（1985）及郭城孟（1998）所提出的「東南中國大陸型」，其中哈氏狗脊蕨分布較廣，包括中國大陸廣東、廣西、福建、湖南、海南島、日本九州屋久島、琉球群島、越南北部、泰國北部與台灣北部。細葉狗脊蕨的地理分布範圍基本上與哈氏狗脊蕨重疊，但分布地點較少，範圍較窄，最西分布至大陸廣西一帶，未見於更西的大陸海南島、越南及泰國。整體而言，此複合種群在東亞及東南亞地區呈現一長帶狀分布，以台灣至大陸廣西及海南島此一區域內發現紀錄的族群數量最多。台灣地區哈氏狗脊蕨複合種群族群約位處於世界地理分布的中間位置，野外調查發現的生育地點超過 12 個（圖 2-2），其中有 7 個生育地同時可發現哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨，其為混生或緊鄰生長，另 4 個生育地僅發現哈氏狗脊蕨，1 處則僅記錄到細葉狗脊蕨。根據標本記錄及野外調查結果，哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨在許多生育地點都呈現共域分布，導致生育地重疊的可能原因有二，其一為此二物種具有密切關係，因此利用極為相似的棲地環境；第二種可能原因為此二物種屬於關係較遠物種，但因具類似生態需求，而導致如此顯著的生育地重疊。Cranfill（2001）及 Cranfill & Kato（2003）針對狗脊蕨屬與相關類群的研究結果顯示，哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨是系統演化上關係最近緣的姊妹群，所以此二物種利用相同或相似棲地環境是因其具有密切關係而有類似生態需求。系統演化關係近緣物種共域分布情形亦見於其他同型孢子蕨類植物（Yatabe et al., 2001; Shinohara et al., 2006），然此類共域分布近緣種間通常具有明顯的生殖隔離，方能維持二個獨立可區分之分類群。如四倍體. 23.

(38) 與六倍體假蹄蓋蕨（Deparia petersenii）共域分布於日本奄美島，由於染色體倍體性不同，此二類群間遺傳物質並無法有效交流，偶發的雜交事件只能形成不具繁衍能力的五倍體個體（Shinohara et al., 2006），顯示四倍體與六倍體假蹄蓋蕨間具有明顯的生殖隔離。Yatabe 等（2001）研究印尼西爪哇島一山地國家公園內之山蘇花（Asplenium nidus）複合群植物時，發現同一地區形態無法區分的這群植物其實包含 3 個分類群，分別具有不同的葉綠體單套基因型，此 3 類群雖具有相同的染色體數，然其間具有生殖隔離機制使得彼此無法交配產生可孕的後代。共域分布的哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨為系統演化關係最近緣的姊妹群，因此其間應具有顯著的生殖隔離，方能維持此形態有所差異的群體為二個獨立之分類群。若無有效的生殖隔離機制，則兩者或僅為不同外型（葉片分裂形式不同）的同一分類群，其形態上的差異或另有其他因子所調控。. 圖 2-1、哈氏狗脊蕨複合種群之地理分布。黑色實心圓表示哈氏狗脊蕨之分布地，空心星號表示細葉狗脊蕨之分布地，實心星號表示哈氏細葉狗脊蕨共同之分布地點。. 24.

(39) 圖 2-2、台灣地區哈氏狗脊蕨複合種群野外調查紀錄之分布地點。黑色實心圓表示哈氏狗脊蕨之分布地，空心星號表示細葉狗脊蕨之分布地，實心星號表示哈氏細葉狗脊蕨共同之分布地點。. 25.

(40) 二、物候學資訊統計台灣北部烏來地區共域分布哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨 3 年週期（2000 至 2003 年）每月物候現象觀測記錄結果，繪製成圖 2-3 與 2-4 之新生葉片組成月變化圖。由此 3 年週期的物候統計資料可以發現兩種狗脊蕨葉片產生與組成都具有明顯的季節性變化，孢子葉的形成集中於 2 至 5 月，其中細葉狗脊蕨以 3 月為最高峰，而哈氏狗脊蕨則以 2 月為極大期。8 及 9 兩月另有一波抽新葉之高峰，此時期新長葉片全為營養葉，之後新葉數產生量明顯降低。. 12 營養葉. 10 平均新生幼葉數. 孢子葉. 8 6 4 2 0 1. 2. 3. 4. 5. 6 月. 圖 2-3、哈氏狗脊蕨新生幼葉數量月變化圖. 26. 7 份. 8. 9. 10. 11. 12.

(41) 12 營養葉. 10 新生幼葉數. 孢子葉. 8 6 4 2 0 1. 2. 3. 4. 5. 6 月. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 份. 圖 2-4、細葉狗脊蕨新生幼葉數量月變化圖. 孢子葉的發育具有季節性，孢子囊的發育、成熟與孢子釋放也具有明顯的季節性。圖 2-5 哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨孢子囊發育每年自 6 月開始成熟，7 及 8 月達到成熟期高峰，孢子釋放則一般自 7 月開始，8 及 9 兩月為最大釋放期，多數個體至 10 月時已接近釋放完畢。. 20 Wh-SM Wh-SR. 16. Wk-SM Wk-SR. 葉片數. 12 8 4 0 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 月. 份. 8. 9. 10. 11. 12. 圖 2-5、哈氏狗脊蕨（Wh）與細葉狗脊蕨（Wk）孢子囊成熟（SM）與孢子釋放（SR）月變化圖。 27.

(42) 哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨的物候現象基本上與鄰近地區針對另 16 種蕨類植物的調查結果（Lee et al., 2009）一致，即 2 至 3 月為孢子葉新葉抽芽鼎盛期，6 至 9 月則為孢子囊成熟與釋放的極大期。Lee 等研究地點（福山植物園）與本研究設樣的地點（烏來雲仙樂園）直線距離不到 10 公里，地理上應屬同一氣候區。過去的研究顯示蕨類植物季節性地物候現象受降雨量與氣溫變化所影響（Sharpe, 1997; Arens, 2001; Mehltreter & Palacios-Rios, 2003），因此同樣的氣候條件一致可能是決定本研究二物種與福山植物園地區 16 種具有幾為一致物候表現時期的主要原因。哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨於多處分布地區均為共域分布（見圖 2-1 及 2-2），本項物候學研究顯示共域分布的此二物種具有幾為一致的物候表現，推測此將影響孢子釋放後孢子萌發與配子體發育的時間亦趨於一致。許多開花植物會藉由錯開開花時間以避免近緣種間雜交，物候學觀測結果顯示哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨間並產生物候表現的差異，因此若共域分布的此二物種確實為獨立的分類群，則其應另有物候學以外其他生殖行為或遺傳物質方面的顯著差異，以達到生殖隔離的目的。. 28.

(43) 三、細胞學證據 Takamiya 等人（1992）曾對日本產狗脊蕨屬植物做過細胞學研究，結果顯示日本產細葉狗脊蕨為四倍體（ 2n=124），由此所推算的染色體基數（x=31）與同屬其他種類（x=34）明顯不同。Cranfill（2001）以台灣哈氏狗脊蕨材料所做的細胞學研究，亦顯示此類群為四倍體（n=ca.70），然而其染色體基數為 35。本研究以台灣北部烏來地區細葉狗脊蕨材料進行根尖細胞有絲分裂之染色體觀察，結果如圖 2-6，細葉狗脊蕨染色體數為 126。若參考前人觀察結果，台灣北部烏來地區所產細葉狗脊蕨應為四倍體，染色體基數為 31 或 32，結果與日本學者 Takamiya 等人（1992）的觀察類似，顯示台灣與日本產的細葉狗脊蕨可能都是四倍體，惟其確切之染色體基數則需要再進一步確認。. 圖 2-6、細葉狗脊蕨體細胞之染色體（2n=ca. 126） 29.

(44) 除了直接的細胞學觀察外，根據已知染色體數的個體（族群），以流式細胞技術比對細胞內 DNA 含量（C value）方法，檢測其他族群個體之染色體套數，以推估其倍體性。判讀方法為利用 PI（Propidium Iodide）單染後之 DNA 直方圖上二倍體峰（G1 細胞）落點位置（FL2-W 值），與已知倍體性個體之二倍體峰落點位置比較，以推估其倍體性。C value 推算方法為同時檢測已知 C value 值之物種（如煙草）之二倍體峰落點位置，比對 FL2-W 值後乘上該物種 C value 即得之。本研究共檢測台灣地區 3 個族群 18 個個體，其中哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨各 9 個個體，中國大陸廣東省新會地區 2 個哈氏狗脊蕨族群 5 個個體，福建省南靖地區哈氏狗脊蕨 1 個個體，以及香港大東山地區哈氏狗脊蕨族群 5 個個體。結果如圖 2-7 及 2-8 所示，經由與已知 C value 之煙草（Nicotiana tabacum L.）比對後，取自大陸廣東省新會地區哈氏狗脊蕨族群的 C value 約為 11 pg，台灣、香港及大陸福建地區哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨族群則都落在 20 至 23 pg 範圍。已知其中取自台灣北部烏來地區細葉狗脊蕨個體為四倍體（圖 2-6），據此推算台灣、香港及大陸福建地區所產哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨個體皆為四倍體，而中國大陸廣東省新會地區 2 個哈氏狗脊蕨族群則都為二倍體。由細胞學直接觀察，配合流式細胞儀檢測 C value 間接推算各族群個體染色體套數之結果，可以發現哈氏狗脊蕨實包含兩種不同倍體性的族群，其中二倍體類群僅見於大陸廣東省新會一帶，而四倍體類群則見於台灣及大陸香港與福建的族群（圖 2-9）。具有不同染色體套數的蕨類植物複合種群常可發現不同倍體性個體共域分布或生育於鄰近地區（ Ohta & Takamiya, 1999; Shinohara et al., 2006），由於倍體性差異使其無法交配，或交配後之孢子體不正常的減數分裂而無法產生可孕的孢子，因而阻隔不同倍體性類群間之基因交流。台灣北部 3 個細葉狗脊蕨族群的細胞學觀測結果都顯示為四倍體，而與其共域分布的哈氏狗脊蕨亦為四倍體，因此哈氏. 30.

(45) a. b. c. d. 圖 2-7、哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨細胞內 DNA 含量（C value）檢測結果。a: 大陸廣東省新會五指山哈氏狗脊蕨；b: 大陸廣東省新會大圓嶺哈氏狗脊蕨；c: 台灣烏來地區哈氏狗脊蕨；d: 台灣烏來地區細葉狗脊蕨 31.

(46) a. b. c. d. 圖 2-8、哈氏狗脊蕨與煙草細胞內 DNA 含量（C value）檢測結果。a: 大陸福建省南靖哈氏狗脊蕨；b: 香港哈氏狗脊蕨；c: 台灣貢寮地區哈氏狗脊蕨；d: 煙草（Nicotiana tabacum L.） 32.

(47) 狗脊蕨與細葉狗脊蕨間並無染色體倍體性差異以形成生殖上的隔離。因此若共域分布的此二形態種確實為獨立的分類群，則應有其他生殖隔離的機制，例如哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨的染色體具有不整倍體性的差異，而此需更多兩種類群個體的直接染色體數觀察結果予以驗證。. 圖 2-9、哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨體細胞型之地理分布。實心圓表示二倍體，實心正方形表示四倍體，空心菱形表示未知細胞型之 DNA 分子材料採樣族群。. 33.

(48) 四、DNA 分子證據哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨二段葉綠體基因區間片段（ atpB-rbcL 及 trnS-rps4）合併後共計長 1,313 bp，具有 21 個多型性位點，全為點突變（Point mutation），合計共獲得 15個單套基因型（表 2-2）。利用 MEGA 4程式（Tamura et al., 2007）以鄰接法（Neighbor joining, NJ），以及利用 MrBayes 3.0b4 程式（Huelsenbeck & Ronquist, 2001）軟體進行貝葉氏法（Bayesian inference analysis）分析，建構哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨葉綠體單套型間之親緣關係。分析時選用分布於台灣之同屬另三種（狗脊蕨（Woodwardia japonica）、台灣狗脊蕨（W. orientalis var. formosana）及頂芽狗脊蕨（W. unigemmata））作為外群，所建構之親緣關係樹如圖 2-10。兩種分析方法所建構的親緣關係樹基本上是一致的，哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨個體於此單套基因型之親緣關係樹中形成一單系群，而此單系群可以再區分為兩大分支（C1-C2 及 C3-C15），細葉狗脊蕨僅見於 C1-C2 分支，四倍體類群亦僅見於此一分支，而 C3-C15 分支包含所有二倍體類群。由已知二倍體與四倍體族群個體分別僅出現在此二分支之其一（圖 2-10），透露葉綠體 DNA 的演化與染色體套數有關，而大陸南嶺地區（CNh1）及海南島（CHh）哈氏狗脊蕨族群的單套基因型同時分布於 C1-C2（CNh1-C1 及 CHh-C1）及 C3-C15（CNh1-C3、 CNh1-C5、CNh1-C13 及 CHh-C4）分支中，顯示二倍體與四倍體間似乎仍有一定程度的基因交流。哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨細胞核基因 pgiC Intron 14-15 片段計長 349 至 352 bp，具有 3 處 Indel 及 12 個多型性位點，其中具系統演化訊息位點有 6 個，合計共有 12 個單套基因型（表 2-3）。利用 MEGA 4 程式（Tamura et al., 2007）以鄰接法，以及利用 MrBayes 3.0b4 程式（Huelsenbeck & Ronquist, 2001）軟體進行貝葉氏法分析，建構哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨細胞核單套基因型間之親緣關係。分析時亦選用分布於台灣之同屬另三種（狗脊蕨、 34.

(49) 表 2-2、 The variable loci (base substitution) of chloroplast atpB-rbcL and trnS-rps4 intergenic spacer sequences Variable sites atpB-rbcL intergenic spacer trnS-rps4 intergenic spacer Haplotype. 1. 1. 2. 3. 3. 4. 4. 4. 5. 6. 7. 0. 1. 1. 2. 2. 3. 3. 3. 3. 3. 1. 4. 5. 1. 2. 5. 6. 8. 5. 4. 8. 6. 0. 8. 2. 5. 2. 5. 6. 7. 7. 0. 1. 7. 8. 1. 2. 8. 1. 3. 6. 6. 1. 6. 6. 5. 7. 7. 6. 7. 1. 8. C1. C. C. T. C. C. G. T. G. A. G. G. C. A. G. A. G. T. C. T. C. G. C2. C. C. T. C. C. G. T. G. A. G. G. C. A. G. A. G. T. C. C. C. G. C3. C. C. T. C. C. G. T. G. A. G. G. C. G. G. A. G. T. C. C. T. G. C4. C. C. T. C. T. G. T. G. A. G. A. A. G. G. G. G. T. T. C. T. A. C5. C. C. T. C. T. A. C. G. G. A. G. C. G. G. A. G. T. C. C. T. G. C6. C. C. T. C. T. A. C. G. G. G. G. C. G. G. A. G. T. C. C. T. G. C7. C. T. T. C. T. A. C. G. G. A. G. C. G. G. A. G. T. C. C. T. G. C8. C. C. T. C. T. A. C. A. G. A. G. C. G. G. A. G. T. C. C. T. G. C9. C. C. T. C. T. A. C. G. G. A. G. C. G. G. A. G. C. C. C. T. G. C10. C. C. T. C. T. A. C. G. G. A. G. C. G. G. A. A. C. C. C. T. G. C11. C. C. T. C. T. A. C. G. G. A. G. C. G. G. A. G. T. C. C. C. G. C12. C. C. C. C. T. A. C. G. G. A. G. C. G. G. A. G. T. C. C. C. G. C13. C. C. T. C. T. A. C. G. G. A. G. C. A. G. A. G. T. C. T. C. G. C14. C. C. T. T. T. A. C. G. G. A. G. C. A. A. A. G. T. C. C. C. G. C15. T. C. T. C. T. G. C. G. G. A. G. C. A. G. A. G. T. C. C. C. G. 台灣狗脊蕨及頂芽狗脊蕨）作為外群，所建構之親緣關係樹如圖 2-11。哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨個體於核 pgiC Intron 14-15 基因片段所建構親緣關係樹中歸於一單系群，而此單系群再區分為三大分支（A、B 及 C），可信度分析支持率在 93%以上。檢視 A、B 及 C 三群之序列變異位點分布情形（表 2-3），可以發現其各具有 3 個以上變異位點或 Indel 是僅見於某一群者，如位點 101 為 G、位點 240-241 為 A-及位點 293 為 C 等組合為 A 群所特有的組合。相較於 C 群基因型序列，A 群基因型在位點 241 為缺失位點， B 群基因型則具有 240、241 及 293 等 3 處位點的缺失。所有檢測樣品除了採自大陸廣東省新會一帶 2 個族群的個體 PCR 後可以直接定序外，其餘地區樣品皆需進行 cloning，以獲得單一序列。所有大陸廣東省新會地區二倍體之個體均僅具有 A 群基因型，其他地區族群個體則至少具有 A、B 及 C 等 3 群基因型中任二群之序列（圖 2-11），如台灣烏 35.

(50) 圖 2-10、根據葉綠體 atpB-rbcL 及 trnS-rps4 基因區間片段 DNA 以貝葉氏分析法（BI）所建構之親緣關係樹。實心圓表示二倍體，實心正方形表示四倍體，空心菱形表示未知細胞型之 DNA 分子材料採樣族群。節點上方數值為貝葉氏分析之機率值，下方數值為鄰接法之 Bootstrap 支持度。方框表示共域分布之哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨。. 36.

(51) Table 2-3、The variable loci (indel & base substitution) of pgiC intron 14-15 sequences Variable sites Occuring 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Haplotype ploidy 9 0 1 2 3 3 2 4 4 5 6 7 8 8 9 4x 2x 4 1 5 0 6 7 4 0 1 9 9 3 1 6 3 A C A A C G C A G T A A C T T C v T T A A C A T - - T A A C T B1 v T T A A C A T - - T A G C T B2 v T G A A C G C A - C A A C T C A1 v v T G G A C G C A - C A A C T C A2 v v T G G A C G C A - T A A C T C A3 v v T G A A C G C A - T A A C T C A4 v T G A A T G C A - T A A C T C A5 v T G G A T G C A - T A A C T C A6 v T G A A C G C A - T A A A G C A7 v v T G A G C G C A - T A A C T C A8 v T G A A C G C A - T G A C T C A9 v. 來地區檢測的哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨所有個體均同時具有 A1 及 B1 兩種序列，而香港地區族群則都同時具有 A1、B1 及 C 序列。由已知染色體倍體性之族群樣品於細胞核基因型親緣關係樹之分布情形（圖 2-11），除了二倍體族群僅具有 A 群基因型外，其餘已知四倍體都至少具有 2 群之基因型，其餘未知倍體性族群檢測個體亦都具有 2 群以上之基因型。根據此細胞核基因型親緣關係與細胞學證據，推測已採集檢測樣品中，除了大陸廣東省新會地區 2 族群為二倍體外，其他地區族群皆為四倍體，且為異源四倍體（ allotetraploid ），而其基因體組成推測二倍體為 AA，四倍體類群則有 AABB、BBCC 及 ACBB 等 3 種（圖 2-12）。細葉狗脊蕨（所有個體基因體組成皆為 AABB）除了採自日本九州屋久島的族群具有 A1、A7 及 B1 基因型外，其餘細葉狗脊蕨族群基因體型都僅具有 A1 及 B1 基因型，ACBB 基因體型絕多數族群則都由 A1、B1 及 C 基因型組成，僅香港地區族群具有由 A1、B2 及 C 組成基因體型之個體，而同一地區共域分布的哈氏狗脊蕨則都擁有與細葉狗脊蕨一致的基因體型。此結果與葉綠體基因型於哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨的族群分布情形相吻合，顯示此二種外型不同的「類群」在遺傳組成上並無差異，彼此間基因 37.

(52) 交流顯然並無阻礙，此暗示這兩種形態種並無生殖上的隔離機制，因此遺傳組成並無差異。哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨的親緣關係情形恰與 Yatabe 等（2001）所研究山蘇花（Asplenium nidus）複合群植物案例相反，其研究顯示外形相似的山蘇花複合群其實包含 3 種具有不同葉綠體基因型且彼此生殖隔離的隱藏種（cryptic species）。Perrie & Brownsey （2005）研究的紐西蘭產虎克氏鐵角蕨（Asplenium hookerianum）複合種群則具有與類似哈氏狗脊蕨及與細葉狗脊蕨的情形，其發現兩個先前被認為不同種但共域分布的類群，雖然擁有明顯可分的羽片外形，然分子證據顯示共域分布的「兩種」總是具有一致或較類似遺傳組成，此種情況與本研究之類群相同。. 38.

(53) 圖 2-11、根據核 pgiC Intron 14-15 片段 DNA 以鄰接法（NJ）所建構之親緣關係樹。實心圓表示二倍體，實心正方形表示四倍體，空心菱形表示未知細胞型之 DNA 分子材料採樣族群。節點上方數值為貝葉氏分析之機率值，下方數值為鄰接法之 Bootstrap 支持度。方框表示共域分布之哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨。 39.

(54) 圖 2-12、核 pgiC Intron 14-15 片段單套基因型之地理分布。圓形餅圖顯示二倍體類群之基因型種類與頻率，方形餅圖顯示四倍體類群基因型種類與推測之頻率，餅圖旁之組合字母顯示推測之基因體型，斜體字與數字組合則為族群代碼。. 40.