哈氏狗脊蕨(Woodwardia harlandii)及細葉狗脊蕨(W. kempii)為烏毛蕨科 (Blechnaceae)狗脊蕨屬(Woodwardia)植物。本屬植物外部形態的主要特點 為︰沿主脈及羽軸兩側各有一列平行於主脈或羽軸的狹長網狀脈，其外側 尚有 1 至 2 列多角形的網眼，網眼內不具小脈，其餘葉脈均為游離，游離 脈通常極短，直達葉片邊緣；孢子囊群為線形或橢圓形，呈不連續、單列 平行著生於主脈或羽軸兩側的狹長網眼上，並多少陷入葉肉中，成熟時囊 群蓋朝主脈或羽軸開裂而宿存(裘佩熹, 1974; Cranfill﹐2001)，染色體基數為 31、34 或 35（Kramer, 1990; Takamiya et al, 1992; Cranfill, 2001）。哈氏狗脊 蕨與細葉狗脊蕨的形態差異僅在於羽裂方式不同，其中哈氏狗脊蕨葉片為 單葉至一回羽狀複葉，細葉狗脊蕨則為二回羽狀裂葉。
哈氏狗脊 蕨與細葉狗脊蕨於近年來多數的分類處理 (Kramer, 1990;
Chiou et al., 1994; Iwatsuki, 1995; Cranfill, 2001) 皆 置 於 狗 脊 蕨 屬 (Woodwardia)，Smith(1875)曾將哈氏狗脊蕨併入 Lorinseria 屬中，而大陸學 者秦仁昌(1964)則根據此二物種之根莖長橫走、葉柄極長、葉片簡化（三出 至羽狀深裂）、孢子囊群表面生（不陷入葉肉中）、及孢子具有明顯的翅狀 周壁等特徵，將其處理成獨立一新屬— — 崇澍蕨屬（Chieniopteris，又稱假 狗脊蕨屬）(秦仁昌, 1964; 裘佩熹, 1974; 吳兆洪, 1999)。
Cranfill（2001）在進行狗脊蕨屬植物的專論性研究後，共處理為 14 種，
並將一些曾被分立的小屬，如 Anchistea、Chieniopteris 及 Lorinseria，皆併 入狗脊蕨屬中，而在屬內設立 Lorinseria 及 Woodwardia 兩個亞屬。根據其 處理，哈氏狗脊蕨及細葉狗脊蕨與美洲產的 W. areolata 共同組成 Lorinseria 亞屬，其餘種類則歸屬於為 Woodwardia 亞屬，此結果與 Tagawa（1936）的 處理一致。Cranfill & Kato（2003）以形態特徵與葉綠體 DNA 序列進行狗
脊蕨屬的親緣關係研究，其結果支持 Anchistea 及 Lorinseria 為獨立的屬，
其他種類則形成單系群之狗脊蕨屬（Woodwardia），而哈氏狗脊蕨與細葉狗 脊蕨包含於其中，並被提議單獨組成崇澍蕨組。屬的歸屬及屬內位置雖然 已較為明朗，然而哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨彼此的關係一直存在爭議，日 本學者 Masamune(1930)曾將細葉狗脊蕨處理為哈氏狗脊蕨的變種(W.
harlandii var. takeoi (Hayata) Masamune)，而 Christensen (1934)及 Tagawa
(1936)更直接將 W. kempii Copel.處理為 W. harlandii Hook.的同物異名，然而 近十幾年的分類處理普遍接受其為不同的物種(Chiou et al, 1994; Iwatsuki, 1995; Cranfill, 2001; Cranfill & Kato, 2003; 吳兆洪, 1999)。物種種化的過程主要在於生殖隔離機制的形成，一般常見的生殖交流 阻斷方式為地理上的分隔（Cox & Moore, 2000），也就是所謂的異域種化
（allopatric speciation）。異域種化常是為適應不同環境的選汰加上基因交流 中斷所形成，因此表現在地理分布上，分化的物種常具有不同的分布範圍 或不同的分布模式，而即使後來再因族群擴散而共域分布，物種間也會因 生態需求不同、生殖週期不同或遺傳分化所形成的內在生殖隔離機制而有 所區隔。因此，地理分布資訊可提供物種間關係的基本訊息，當近緣分類 群間尚未建立完善的生殖隔離機制時，有效的地理隔離方足以維持其為獨 立可區分的物種。同域種化（sympatric speciation）的實例較少，在維管束 植物達成同域種化最常見的方式為染色體套數的改變，也就是在同區域內 形成不同倍體性的群體，而這些不同倍體性物種間常經由雜交後代的不孕 性來形成生殖上的隔離。因此多倍體化可以使得植物在短時間內種化，而 此分化類群間在遺傳物質上顯現親緣關係接近，然卻有顯著的生殖隔離。
生殖週期或生殖行為的差異是另一種隔離機制，然而這樣的差異通常是異 域種化的結果。當分隔的族群為了適應當地環境而有固定的生殖週期或生
行為會阻礙其基因交流，因而能保持甚至強化其遺傳的分化。
維管束植物的系統分類傳統上是以植物形態特徵為基礎，並廣納其他 生物學資訊作為分類處理的佐證（Stuessy, 1990），這其中包括分布資訊、
物候學資料、染色體訊息、遺傳學資訊、生殖交配試驗結果及分子生物學 證據等。除了形態學資料以外其他資訊的多寡與可獲得性，會影響系統分 類學者最後的分類處理，因此各種生物學資訊越充足，越能獲得一充分反 應物種系統演化關係的分類結果。為解決哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨長久以 來的分類爭議，本研究針對其地理分布資訊、物候現象、染色體資料及分 子生物學證據進行資料收集、野外觀察與實驗分析，希望能對於其分類關 係有更充足的證據支持。
貳、研究材料及方法 一、地理分布資訊
參考主要標本館標本記錄與相關文獻，並至各地調查採集，野外發現 哈氏狗脊蕨或細葉狗脊蕨族群時，觀察記錄其所在位置的生態環境。將標 本館標本記錄及野外調查發現之地點，標示於地圖上。
二、物候學資訊
研究區設於台灣北部烏來地區雲仙樂園，海拔高約 450 公尺，生育地 為次生闊葉林林緣，本研究調查時間為 2000 年 4 月起至 2003 年 12 月，共 計 3 年 9 個月。哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨各選定 20 株，共計 40 株，每月 10 日前後進行調查，整理並統計各月之觀測結果，分析比較二物種之物候 特性。
本研究將蕨類各葉片發展與孢子囊發育之物候區分如下：
葉片發展：
1. 幼葉捲曲期：新葉完全捲曲，未見葉肉。
2. 幼葉辦捲期：可以明顯地看出葉肉，但尚有部分葉片或羽片捲曲。
3. 幼葉平展期：葉片完全平展，但尚未轉變為成熟葉色。
4. 成熟葉期：葉片平展，具成熟健康葉色。
5. 落葉期：葉片出現黃或褐色斑點或斑紋，至葉片完全掉落止。
孢子囊發育：
1. 孢子囊發育期：孢子囊群凹陷至孢子囊飽滿但為淡黃色之時期。
2. 孢子囊成熟期：孢子囊飽滿且呈現成熟之黃褐色。
3. 孢子釋放期：孢子囊成熟且開始釋放。
4. 孢子囊殘存期：孢子囊內孢子已完全釋放，僅剩殘存之孢子囊殼。
三、細胞學證據
（一）染色體直接檢定
以下列步驟進行根尖染色體數目之觀察
1. 根尖取下後，立即置於 18-20℃，0.002 M 之 8-hydroxyquinone 溶液中 靜置處理 3-5 小時，溶液需為根尖之 20 倍體積以上。
2. 將材料取出，置於絕對酒精：冰醋酸（3：1）固定液內固定，過夜，
但勿超過 24 小時。
3. 將材料換至 70%酒精溶液中保存。
4. 壓製前，將材料置於 60℃，1N HCl 溶液中加熱 8 分鐘，再以 pectinase 溶液解離數分鐘。
5. 以醋酸洋紅壓片法（acetocarmine squash method）製成染色體玻片，
於光學顯微鏡下觀察有絲分裂時之染色體數目，並拍照記錄。
（二）流式細胞術（flow cytometry, FCM）分析 材料準備：
度 PI= 20ug/ml, Triton-X 100=0.1%, RNase A= 0.2mg/ml），再以刀片 將材料切碎呈泥狀，避光染色至少30分鐘。
2. 上機前打散細胞並以 35um 尼龍篩網過濾樣本。
3. 另取煙草葉片進行上述步驟，做為C value比對之基準值。
上機操作：
1. 儀器設定：選擇設定以下參數：FS Lin、SS Lin、FL Lin、FL Peak、
Ratio（Ratio= FL Peak/ FL Lin），門檻值設定於FL。
2. 分析圖形：先以煙草樣品進行分析，調整FS、SS 電壓及Gain值，使 細胞群落在FS Lin- SS Lin 圖形中央，再於FL Lin- FL Peak圖形調整 FL 電壓及Gain值設定，於FL Lin histogram 分析單顆細胞的螢光訊 號。
四、DNA 分子證據
（一）研究材料：
於台灣北部及東亞地區採集哈氏狗脊蕨複合群材料，共計取得 14 個族 群共 364 棵植株樣品（表 5-1），其中台灣有 3 個族群 120 棵植株樣品，
日本 2 個族群 41 棵植株樣品，大陸 8 個族群 183 棵植株樣品。取樣時 自野外族群採集新鮮健康之新葉，或於野外即以矽膠進行快速乾燥，
而後置於超低溫冷凍櫃備用。
（二）研究方法：
1. DNA 萃取：以 Viogene® 的 Plant Genomic DNA Miniprep System Kit 進行 DNA 萃取。
(1) 取約 100mg 的植物材料，以液態氮研磨至粉末狀，並移至一離心 管中。
(2) 加 400
µ
l 的 PX1 溶劑及 4µ
l 的 Rnase (100mg/ml)，經振盪均勻混合後，置 65℃水浴 10 分鐘。
表 2-1、Codes and sample size for populations of Woodwardia harlandii complex in this study.
Shaded rows indicating the diploid populations while the others being tetraploid.
Population (Code) Sample size
台灣 142
(8) 用 0.7ml 的清洗劑，以 30 秒高速離心的方式清洗離心柱 2 次，將 濾出液丟棄。
(9) 高速離心 2 分鐘，去除殘留的清洗劑。
(10) 將過濾管 (2) 移至新的離心管 (1.5ml) 中，加 200
µ
l 的 0.1×TE 緩 衝液（事先預熱至 65℃），以高速離心的方式將 DNA 溶至離心管中。(11) 將 DNA 保存於 -20℃。
將以上兩種萃取方法所得之 DNA 溶液，以 1× TBE buffer 所配製的 1%
agarose gel（內含 0.25
µ
g/ml 之 Ethidium Bromide 染劑），進行電泳 約 30-50 分鐘後，利用已知濃度的 DNA Marker 比對所萃取的 DNA 之品質及濃度後，再將 DNA 濃度稀釋成 10 ng/µl，保存於 4°
C 備 用。2. PCR 反應：
(1)引子的選擇：
選用的 DNA 片段為 atpB-rbcL 及 trnS-rps4 等 2 基因區間片段，其 中 atpB-rbcL 片段參考 Chiang et al.(1998)設計的引子( atpB-1 及
rbcL-1)，再重新設計更專一性之引子（atpB-F: 5’-CCRAGAGTAGT
TTCACCAA-3 及 rbcL-W: 5’-TCGGTATCTTTGGTCTTGTAT-3’）， 進行 atpB-rbcL 基因區間片段的擴增。trnS-rps4 片段則參考 Smith and Cranfill (2002)之引子（trnS R 及 rps4 R1），再重新設計更具專 一性之引子（tSr4-W-f : 5’-CCGAGGGTTCGAATCCCTCC-3’及 tSr4-W-r : 5’-GCCAATCGAGAATCCGTCAATTT-3’）。核 DNA 部分 選用單一拷貝的 pgiC 基因片段，擴增放大的範圍包括 intron 14、15 及 exon 15，引子則是參考 Ishikawa 等（2002）設計之引子序列，
再重新設計專一性更高的引子（pgiC-14fA：5’-GTG CTT CTG GGT
CTT TTG AG-3’及 pgiC-16rA：5’-GTT GTC CAT TAG TTC CAG GT-3’）
(2)PCR 反應試藥與濃度：
每個 PCR 反應試劑體積為 50
µ
l，各試藥之濃度、所需體積及最終之 反應試劑濃度如下（參考 Viogene Biotek® 之濃度配方）：試藥 所需體積 反應試劑最終濃度
10×PCR buffer (with 15mM MgCl2, Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 1% Triton X-100, 50% glycerol)
5µl 1×
10mM dNTP mixture 1µl 0.2 mM each Primer mix(10u M each) 2.5µl 0.5uM each Template DNA 1-10
µ
lVioTag DNA polymerase 0.5µl 2.5 units Autoclaved distilled water to 50 µl
(3) PCR 反應條件：
PCR 反應採用之溫度週期及流程如下：
a. 先以 94
°
C 處理 5 分鐘，使雙股 DNA 變性。b. 再以 94
°
C（變性溫度）一分鐘、53°
C（鏈合溫度）一分鐘、72°
C（延長溫度）兩分鐘，進行 35~40 次的擴增循環。
c. 最後保持 72
°
C 處理 8 分鐘。d. 反應產物溫度降至室溫或 5
°
C 保存。(4) PCR 結果檢測：
觀察及記錄 PCR 產物的分子量、濃度及產物條帶是否單一。每次 電泳中並加入分子量參考標記（molecular weight marker, 100 bp DNA ladder, Violet)，以標示 PCR 產物條帶的分子量並當作 PCR 產 物之 DNA 濃度的參考。
3. PCR 產物之純化回收﹕
利用 Viogene® Gel Extraction System Kit 純化回收，步驟如下:
(1) 將所有 PCR 反應溶液取出，加入 1/10 體積的 loading dye，以 1.2%
agarose gel進行電泳約 100 分鐘，於紫外燈上觀察並將膠片上的 PCR
agarose gel進行電泳約 100 分鐘，於紫外燈上觀察並將膠片上的 PCR