壹、前言
生物的現今地理分布模式是由許多因子交互作用所形成，這些因子可 歸類為生態與歷史兩大部分(Barrington, 1993)，其中歷史因素包括過去的地 質歷史、長期的氣候改變及物種的播遷歷史等，生態因素則包括物種的生 態適應幅度、拓殖體擴散能力及物種間的競爭等。綜合不同的生態與歷史 因子所顯現的現今分布模式，是兩種不同的地理分布作用機制：散 播 (dispersal)與片段化(vicariance)（Kato, 1993; Avise, 2000）所彼此作用的結 果。親緣地理學(phylogeography) 為 Avise 等(1987)所提出有關歷史性生物 地理學(historical biogeography)的新觀念，主要在探討物種的演化與地質歷 史之間的關係。親緣地理學與傳統地理學的差異在於後者通常重視較高分 類群的地理分布，但親緣地理學的研究雖不排除高階分類群的探討，但主 要的研究對象則是近緣物種（強調其來自共同起源的歷史）及種內族群間 的關係，並藉由不同族群間的遺傳變異，分析探討現今物種分布模式的形 成 機 制 。 因 此 親 緣 地 理 學 的 研 究 被 視 為 族 群 遺 傳 （ 或 稱 微 演 化 (microevolution) ） 與 種 化 （ 或 稱 巨 演 化 (macroevolution) ） 之 間 的 橋 樑 (Bermingham and Martin, 1998; Avise, 2000)。
植物生育地範圍的拓殖需靠種子與孢子等拓殖體的散播，而隔離機制 (isolating mechanism)的形成則阻隔基因流傳，並產生遺傳分化。不同的演 化過程（如天擇或基因漂變）及不同的族群大小變動因子（如不同的族群 成長速率）會導致族群間基因譜系關係產生不同的分支結構（Page and Holmes, 1998）。因此，欲檢測某一特定分布模式究為散播與片段化何者所 造成，或其發生先後順序，可藉由分析近緣種或同種不同地理族群的遺傳
變異，基因型差異與親緣關係，以及族群間分化程度推估（Crawford et al., 1992; Cain et al., 2000）。
分子生物學及其相關應用的快速進展，使得研究者可以從許多不同基 因中選擇合適的片段探討生物遺傳變異的內容與方向，進行系統演化的研 究。分子標記的性質決定它們是否適合於解決或回答族群階層及親緣遺傳 關係的問題，植物體內蘊藏遺傳訊息的三種基因體在演化模式及種內遺傳 變異型式具有極大的差異（Ennos et al. 1999），因此，唯有選擇合適的分子 標記方能有效解析不同階層的系統演化關係。植物的胞器 DNA 因具有較低 的突變率（Wolfe et al., 1987; Graur & Li, 2000），以往被認為僅適合科及科 以上分類系統的探討(Olmstead & Palmer, 1994)，不適合做為分析種內族群 遺傳變異的標誌（Ennos et al. 1999）。然而近幾年愈來愈多的研究發現近緣 種間部份胞器 DNA 片段具有高度的遺傳變異，其中葉綠體的非編碼區
（noncoding region）因不具功能限制，具有自由變異與快速演化特性，可 提供足夠系統發育與演化訊息，此外，其具有單系遺傳（通常是母系遺傳
（Harris & Ingram, 1991; Vogel et al., 1998））與不具遺傳重組等特性，因而 被認為適合於建構屬以下分類群的系統演化關係（Chiang et al., 1998），以 及種內族群間地理親緣重建與評估在地質歷史過程的遷移路線（Clegg et al., 1994; Ferris et al., 1995; Gastony & Rollo, 1995; Haufler & Ranker, 1995;
Demesure et al., 1996; Avise, 2000; Huang et al., 2001）。
過去十幾年來探討東亞地區維管束植物親緣地理關係的研究逐漸盛起
（Chiang & Schaal, 2006），然其所涵蓋的地理範圍多以日本、琉球群島至台 灣此一島弧鍊為主（Huang et al., 2004），含括中國大陸物種材料的研究甚 少，即使有包含中國大陸材料，其所使用族群數通常甚少（Shinohara et al., 2006），代表性嚴重不足。取樣方法應儘量涵蓋物種主要分布範圍，以期能
植物為研究對象，甚少以蕨類植物為探討之主題。哈氏狗脊蕨複合種群主 要分布於東亞及東南亞北部地區（圖 2-1），分布模式約略等於 Kuo（1985）
及郭城孟（1998）所提出的「東南中國大陸型」，其中哈氏狗脊蕨分布較廣，
包括中國大陸廣東、廣西、福建、湖南、海南島、日本九州屋久島、琉球 群島、越南北部、泰國北部與台灣北部。細葉狗脊蕨的地理分布範圍基本 上與哈氏狗脊蕨重疊，但分布地點較少，範圍較窄，最西分布至大陸廣西 一帶，未見於更西的大陸海南島、越南及泰國。整體而言，此複合種群在 東亞及東南亞地區呈現一長帶狀分布，而台灣地區族群位處於此一帶狀地 理分布的中間位置，生育地點數量多，且多數地點兩者呈共域分布（圖 2-2），因此是研究哈氏狗脊蕨複合種群地理親緣關係關鍵的族群。本研究利 用葉綠體 trnS-rps4及 atpB-rbcL兩基因區間片段的變異來探討哈氏狗脊蕨複 合種群中二倍體類群與四倍體類群之親緣關係，以及複合種內各族群的遺 傳多樣性與地理親緣關係，並根據葉綠體基因型的地理分布檢測不同的地 理遷移模式假說。
貳、研究材料及方法 一、研究材料：
於台灣北部及東亞地區採集哈氏狗脊蕨複合群材料，共計取得 14 個族 群共 364 棵植株樣品（表 5-1），其中台灣有 3 個族群 120 棵植株樣品，
日本 2 個族群 41 棵植株樣品，大陸 8 個族群 183 棵植株樣品。此外，
以廣泛分布於東亞地區的日本狗脊蕨（Wj, W. japonica）、台灣狗脊蕨
（Wo, W. orientalis var. formosana）及頂芽狗脊蕨（Wu, W. unigemmata）
做為外群。取樣時自野外族群採集新鮮健康之新葉，或於野外即以矽 膠進行快速乾燥，而後置於超低溫冷凍櫃備用。
二、研究方法：
1. DNA 萃取：以 Viogene® 的 Plant Genomic DNA Miniprep System Kit 進行 DNA 萃取。
(1) 取約 100mg 的植物材料，以液態氮研磨至粉末狀，並移至一離心 管中。
(2) 加 400
µ
l 的 PX1 溶劑及 4µ
l 的 Rnase (100mg/ml)，經振盪均勻混 合後，置 65℃水浴 10 分鐘。(3) 回室溫後，再加 130
µ
l 的 PX2 溶劑至管中，經振盪均勻後，置冰浴 5 分鐘。(4) 將反應完後之黏稠混合物移至過濾管（Shearing tube）內，再置於 收集管上，經高速離心 (10,000rpm) 後，將液狀物質過濾至收集管 中。
(5) 加 0.5 體積的 PX3 溶劑與等體積的純酒精，至步驟 4 所收集之回收 管內，並以吸管充分混合。
(6) 取步驟 5 的混合液 650
µ
l，移至離心柱（Spin column）內，再置於 收集管上，經高速離心 1 分鐘後，將濾出液丟棄。(7) 重複步驟 6，至步驟 5 的樣品全部處理完。
(8) 用 0.7ml 的清洗劑，以 30 秒高速離心的方式清洗離心柱 2 次，將 濾出液丟棄。
(9) 高速離心 2 分鐘，去除殘留的清洗劑。
(10) 將過濾管 (2) 移至新的離心管 (1.5ml) 中，加 200
µ
l 的 0.1×TE 緩 衝液（事先預熱至 65℃），以高速離心的方式將 DNA 溶至離心管中。(11) 將 DNA 保存於 -20℃。
表 5-1、Codes and demographic parameters for populations of Woodwardia harlandii complex in this study. Shaded rows indicating the diploid populations while the others being tetraploid.
Population (Code) Sample size Polymorphic site No. of haplotype h p×103 Haplotype
台灣 142
烏來(TY)** 100 1 2 0.432 0.33 C1, C2
陽明山(TS)** 22 0 1 0 0 C1
貢寮(TT)** 20 0 1 0 0 C1
日本 39
九州屋久島(JY)*** 20 0 1 0 0 C1
琉球沖繩島(JO)* 19 0 1 0 0 C1
中國大陸 183
香港(HK)** 33 0 1 0 0 C1
福建南靖(CF)* 10 0 1 0 0 C1
海南島(CH)* 15 9 2 0.248 1.70 C1, C4
廣東從化(CC)** 17 0 1 0 0 C1
湖南南嶺莽山(CN1)* 10 8 4 0.533 2.17 C1, C3, C5, C13
廣東南嶺連州(CN2)* 11 4 2 0.545 1.66 C5, C15
廣東南嶺乳源(CN3)* 4 0 1 0 0 C1
廣東新會古兜山(CG1)* 39 7 6 0.703 1.18 C5, C8, C9, C10, C11, C14
廣東新會大圓嶺(CG2)* 44 5 6 0.770 0.83 C5, C6, C7, C9, C11, C12
* 表示僅發現哈氏狗脊蕨之地點
** 表示哈氏狗脊蕨與細葉狗脊蕨共域分布之地點
*** 表示僅發現細葉狗脊蕨之地點 h: Haplotype diversity
p: Nucleotide diversity
將以上兩種萃取方法所得之 DNA 溶液，以 1× TBE buffer 所配製的 1%
agarose gel（內含 0.25
µ
g/ml 之 Ethidium Bromide 染劑），進行電泳 約 30-50 分鐘後，利用已知濃度的 DNA Marker 比對所萃取的 DNA 之品質及濃度後，再將 DNA 濃度稀釋成 10 ng/µ
l，保存於 4°
C 備 用。2. PCR 反應：
(1)引子的選擇：
選用的 DNA 片段為 atpB-rbcL 及 trnS-rps4 等 2 基因區間片段，其 中 atpB-rbcL 片段參考 Chiang et al.(1998)設計的引子( atpB-1 及
rbcL-1)，再重新設計更專一性之引子（atpB-F: 5’-CCRAGAGTAGT
TTCACCAA-3 及 rbcL-W: 5’-TCGGTATCTTTGGTCTTGTAT-3’）， 進行 atpB-rbcL 基因區間片段的擴增。trnS-rps4 片段則參考 Smith and Cranfill (2002)之引子（trnS R 及 rps4 R1），再重新設計更具專 一 性 之引子（ tSr4-W-f : 5’-CCGAGGGTTCGAATCCCTCC-3’及 tSr4-W-r : 5’-GCCAATCGAGAATCCGTCAATTT-3’）(2)PCR 反應試藥與濃度：
每個 PCR 反應試劑體積為 50
µ
l，各試藥之濃度、所需體積及最終之 反應試劑濃度如下（參考 Viogene Biotek® 之濃度配方）：試藥 所需體積 反應試劑最終濃度
10×PCR buffer (with 15mM MgCl2, Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 1% Triton X-100, 50% glycerol)
5
µ
l 1×10mM dNTP mixture 1µl 0.2 mM each Primer mix(10u M each) 2.5µl 0.5uM each
Template DNA 1-10µl
(3) PCR 反應條件：
PCR 反應採用之溫度週期及流程如下：
a. 先以 94
°
C 處理 5 分鐘，使雙股 DNA 變性。b. 再以 94
°
C（變性溫度）一分鐘、53°
C（鏈合溫度）一分鐘、72°
C（延長溫度）兩分鐘，進行 35~40 次的擴增循環。
c. 最後保持 72
°
C 處理 8 分鐘。d. 反應產物溫度降至室溫或 5
°
C 保存。(4) PCR 結果檢測：
以 1× TBE buffer所配製成之 1% agarose gel（內含 0.25 µg/ml之 EtBr 染劑）在 110mA 條件下，進行電泳約 30 分鐘後，隨即於紫外燈上 觀察及記錄 PCR 產物的分子量、濃度及產物條帶是否單一。每次 電泳中並加入分子量參考標記（molecular weight marker, 100 bp DNA ladder, Violet)，以標示 PCR 產物條帶的分子量並當作 PCR 產 物之 DNA 濃度的參考。
3. PCR 產物之純化回收﹕
利用 Viogene® Gel Extraction System Kit 純化回收，步驟如下:
(1) 將所有 PCR 反應溶液取出，加入 1/10 體積的 loading dye，以 1.2%
agarose gel進行電泳約 100 分鐘，於紫外燈上觀察並將膠片上的 PCR 產物切下（約 100 mg）放入 1.5ml 的離心管中。
(2) 加入 0.5 ml 的 GEX buffer，以 60℃水浴至少 10 分鐘直至 gel 完全 溶解並使其與 buffer 均勻混合及反應。
(3) 先將 Kits 內附之 Gel extraction column 置入於收集管之上方，再將 反應完全之溶液（約 0.6ml）以吸量管吸取入 Gel extraction column 內。
(4) 高速離心（10,000g）約 1 分鐘後，DNA 留滯於 Gel extraction column
之濾膜上，將濾出液丟棄。
(5) 以 0.5ml 之 Wash I buffer 沖洗濾膜上的 DNA，再以高速離心 1 分鐘 後將濾出之沖洗液丟棄。
(6) 以 0.7ml 之 Wash II buffer 沖洗濾膜上的 DNA，以高速離心 1 分鐘 後將濾出之沖洗液丟棄，此步驟進行兩次。
(7) 高速離心 3 分鐘，將殘餘之沖洗液完全濾出。
(8) 將 Gel extraction column 置於新的 1.5ml 離心管上，加入 30
µ
l 的 ddH2O (60℃)於濾膜上，靜置約一分鐘後再以高速離心 2 分鐘將 DNA 濾至離心管內，完成 PCR 產物之純化回收。(9) 取 2
µ
l 混合 1/10 體積的 loading dye，進行 1%瓊脂膠體電泳，觀察 回收效果是否良好，並估算 DNA 片段的濃度，以便進行直接定序，保存於-20℃備用。
4. DNA 定序：
DNA 片段經純化回收後，以自動定序儀定序。
5. 資料分析：
(1)序列分析：
以 BioEdit 7.0 軟體進行序列排序，並以手動調整，再以 DNaSp 4.10.9 程式（Rozas and rozas, 2000）計算變異位點之比例。
(2)遺傳變異度與遺傳分化分析：
以 DnaSP 4.10.9 程式計算以下數值
a. 族群內核? 酸歧異度（Nucleotide diversity, p）
b. 單套基因型（單套型）歧異度（Haplotype diversity, h）
c. 族群內及族群間間遺傳分化指數 GST及 NST。
c. 族群內及族群間間遺傳分化指數 GST及 NST。