第四章 討論
4.4 蓮花胎座及花梗多醣的抗氧化能力
在清除ABTS陽離子自由基活性方面，不同來源的多醣呈現差異的 IC50值，例如天花粉 (Trichosanthes Fructus)為 857 μg/mL (Chen et al., 2017)，川明參 (Chuanminshen violaceum)為 1049 μg/mL (Dong et al., 2016)，灰樹花 (Grifola frondosa)為 1788 μg/mL (Mao et al., 2014)，馬鈴 薯皮為 2000 μg/mL (Jeddou et al., 2016)。NPP及NFP的IC50分別為 93 μg/mL與 205 μg/mL且濃度都在 15–250 μg/mL時活性呈現顯著上升趨 勢。維生素C的IC50約為28 μg/mL。因此，NPP及NFP 清除ABTS自由基 的活性優於灰樹花、川明參、天花粉等，而且NPP的清除活性是NFP的 2.2 倍，但是不及維生素C的三分之一。
在清除DPPH自由基活性方面，不同來源的多醣呈現差異的IC50值，
例如菸草花 (Nicotiana tabacum)為 20 μg/mL (Xu et al., 2013)，構樹果實 (Broussonetia papyrifera)為 570 μg/mL (Han et al., 2016)，波羅蜜果實 (Arotcarpus heteropyllus)為 680 μg/mL (Zhu et al., 2017)，槐樹花 (Sophora japonica L) 為 868 μg/mL (Zhang et al., 2013) ， 小 球 藻 (Chlorella pyrenoidosa)為 2130 μg/mL (Shi et al., 2016)，小蘋果果實為 2640 μg/mL (Dou et al., 2015)，藥蜀葵花 (Althaea officinalis)為 4770 μg/mL (Tabarsa et al., 2017)，番石榴果實 (Psidium guajava)為 10800 μg/mL (Hua et al.,
例如綠茶花 (Camellia sinensis)約為 139 μg/mL (Xu et al., 2012)，黑醋栗 果實 (Ribes nigrum)多為 690 μg/mL (Xu et al., 2018)，槐樹花 (Sophora japonica L)為 1069 μg/mL (Zhang et al., 2013)，茭白莖 (Zizania latifolia) 為1130 μg/mL (Wang et al., 2017)。NPP及NFP的IC50分別為805 μg/mL與 923 μg/mL，活性在濃度 500–1000 μg/mL呈現上升趨勢。維生素C的IC50約 為 211 μg/mL。因此，NPP清除超氧陰離子的能力優於槐樹花、茭白莖 及NFP，但是略遜於黑醋栗果實，而綠茶花則顯示優異的清除超氧陰離 子效果。
螯合亞鐵離子能力方面，Chang等人 (2010)萃取紅棗多醣體，並以 DEAE-cellucose樹脂分離為一類中性多醣與三類酸性多醣，其中三類紅
棗酸性多醣在濃度2.5 mg/mL的螯合亞鐵離子能力皆為 95%以上，而相 同濃度的中性多醣為 43%。仙人掌 (Opuntia ficus indica)多醣的IC50為 2000 μg/mL (Lefsih et al., 2016)，白柚種籽多醣的IC50為2480 μg/mL (蔡，
2011)，綠茶花 (Camellia sinensis)多醣的IC50在4000 μg/mL以上 (Xu et al., 2012)。本論文中NPP及NFP的IC50分別為 431 μg/mL及 976 μg/mL，
且在濃度 62–1000 μg/mL都有活性上升趨勢。因此，NPP螯合亞鐵離子 能力優於仙人掌、白柚籽、綠茶花及NFP，而且NPP的螯合能力是NFP 的2.3 倍。維生素C的 IC50約為 102 μg/mL，是NPP的 4.2 倍。
Chang 等人 (2010)認為螯合亞鐵離子能力與醣醛酸含量呈正相關。
維生素C 並沒有醣醛酸，卻有很強的螯合亞鐵離子能力；而白柚種籽多
醣的醣醛酸含量為38.7% (蔡，2011)，高於 NPP 及 NFP 的 25.8%及 17.7%
(表 3)，但螯合亞鐵離子能力低於 NPP 及 NFP。因此，推測除了醣醛酸，
應還有其他因素會影響不同多醣的螯合亞鐵離子能力。
Essaidi等人 (2013)提及多醣的總酚及類黃酮含量與抗氧化及清除 自由基能力有關；Robak等人 (1988)也認為超氧陰離子的清除活性與類 黃酮有正相關。Wei等人 (2010)測定綠茶花多醣的總酚及類黃銅含量為 10.7%與 11.7%，比NPP及NFP都高出許多。在抗氧化部分，綠茶花多醣 除了清除超氧陰離子能力IC50為139 μg/mL，清除DPPH自由基能力及螯 合亞鐵離子能力IC50都在 4000 μg/mL以上 (Xu et al., 2012)，效果不及 NPP及NFP。因此，除了醣醛酸、總酚及類黃酮的含量，應該還有其他 因素影響不同多醣的抗氧化能力。
4.5 抑制酪胺酸酶活性
在抑制酪胺酸酶活性方面，不同來源的多醣呈現差異的IC50值，例 如阿勃勒花 (Cassia fistula)約為 200 μg/mL (Limtrakul et al., 2016)，海帶
(Laminaria japonica)為 820 μg/mL (Yu and Sun., 2014)。NPP及NFP的IC50
分別為 2099 μg/mL與 2407 μg/mL，且分別在濃度 500–2500 μg/mL及 1000–2500 μg/mL有抑制活性上升的趨勢。維生素C的IC50約為 505 μg/mL。因此，NPP的抑制活性是NFP的 1.1 倍，而阿勃勒花及海帶多醣 的抑制活性都優於NPP，且維生素C抑制活性是NPP的 4.2 倍。
4.6
4.7
蓮花胎座及花梗多醣之純化
天然的黏質物可能為單一多醣或複合多醣的混合物 (Erskine and Jones, 1956)。Wang 等人 (2010)將綠茶 (Camellia sinensis)花的多醣以 DEAE-Sepharose 成功分離出四種劃分，為一未吸附的中性多醣 (TFPS1) 及以不同NaCl 濃度 (0.1、0.2 與 0.3 M)層析出的三種酸性多醣 (TFPS2、
3 與 4)，回收率分別為 18%、36%、28%與 5%。Xu 等人 (2012)也使用 綠茶 (Camellia sinensis)花的多醣以 DEAE-52 分離出三種劃分，包括一 未吸附中性多醣 (TFPS-1)及 0.1 與 0.2 M NaCl 分別層析出的兩種酸性 多醣 (TFPS-2 與 TFPS-3)，回收率分別為 3.6%、34.2%與 49.7%。上述 結果可以說明不同的純化介質可能會導致純化結果不一樣。NPP 及 NFP 以DE-52 樹脂各別分離出未吸附劃分及使用 0.13–0.19 M 與 0.07–0.18 M NaCl 流洗出的有吸附劃分。未吸附 NPP 及 purified NPP 回收率分別為 6.7%與 51.3%；而未吸附 NFP 及 purified NFP 回收率分別為 7.1%與 72.3%。因此，NPP、NFP 及綠茶花多醣的主要組成都為酸性多醣。
醣成分分析
Purified NPP 及 purified NFP 經 TFA 水解後，最主要的成份皆為 glucuronic acid，分別占 59.8%與 69.9%，次之為 mannose，分別占 25.5%
與14.7%。Wang 等人 (2015)純化茶多醣的主要成分為 galacturonic acid
及galactose，占比為 32.8%與 23.6%。歐亞璇覆花 (Inula britannica)多醣 主要由glucose 與 galactose 組成 (Hong et al., 2012)。Xu 等人 (2013)從菸草 花 (Nicotiana glauca)分離純化出一多醣 Fr-II，主要組成為 mannose 與 glucose。上述結果顯示，不同物種甚至相同植物不同部位的多醣組成及 比例都不相同。
4.8 純化多醣之分子量
以標準品Blue dextran T2000、Dextran T500、Dextran T70、Dextran T40 及 Dextran T10 製作檢量線，分別計算 purified NPP 及 purified NFP 的分子量範圍約為149−607 kDa 與 27−261 kDa (圖 9)。林 (2013)以相同 條件，文旦柚籽純化的多醣分子量範圍約為 176−589 kDa。Zheng 等人 (2016)在黃蜀葵花 (Abelmoschus manihot)純化出一主要多醣 AMPS-a，分 子量為 8.8 kDa。Wang 等人 (2010)純化綠茶花 (Camellia sinensis)多醣 (TFPS1)的分子量為 500 kDa。Hong 等人 (2012)將歐亞璇覆花 (Inula britannica)以 HPLC 測分子量為 3500 Da 與 700 Da。上述結果說明不同 物種多醣的分子量分布都不相同。
Zheng等人 (2014)萃取秋葵 (Abelmoschus esculentus) 花多醣，並以 DE-52 cellulose樹脂及SephacrylTM S-500 膠體分離出一純化多醣，並進 一步利用高壓粒徑排除層析/多角雷射散射 (high pressure size exclusion chromatography/multi-angle laser light scattering, SEC-MALLS) 確認其多 醣的分子量約為 1700 kDa。Tabarsa等人 (2017)將粗萃藥蜀葵(Althaea officinalis)花的多醣以SEC測得的分子量約為 33300 kDa。未來若將 purified NPP及purified NFP經SEC-MALLS分析可獲得更精確的平均分 子量。
4.9
4.10
傅立葉轉換紅外線光譜 (FT-IR)
圖10 為利用FT-IR分析經過DE-52、S-400 層析純化、透析脫鹽後的 乾燥樣品purified NPP及purified NFP之圖譜。多醣的特徵峰在 3600 cm-1–3200 cm-1、3000 cm-1–2800 cm-1、1400 cm-1–1200 cm-1及 1200 cm-1–1000 cm-1 (Wang et al., 2010)。在 2500 cm-1–3600 cm-1有兩個明顯的 波峰，其中3400 cm-1附近的O—H拉伸震動是因為glycopyranose hydroxyl groups的氫鍵結 (Yuen et al., 2009)，2940 cm-1附近為aliphatic的CH震動 (Tabarsa et al., 2017)。在 1736 cm-1、1634 cm-1及1430 cm-1附近強訊號為 酸性多醣，其中 1736 cm-1附近是酯化羧基group (—COOH)及 (—
COOCH3)，1634 cm-1及 1430 cm-1附近為uronic acid的殘基 (—COO–) (Zhao et al., 2010)。Wang等人 (2010)提到在 1643 cm-1與 1416 cm-1附近也 可能是acylamino，推測有蛋白質的存在。Purified NPP在 1736 cm-1有強 訊號為esterified carboxylic groups (—COOR)，往後可經由甲基化測其 CH3判斷是否為 (—COOCH3)或 (—COOH)。Purified NPP在 1429 cm-1及 1332 cm-1有強訊號，可能是C—H與C—O彎曲或拉伸 (Xu et al., 2015)。
在 1250 cm-1附近為S—O震動，說明多醣可能含有硫酸脂 (Wang et al., 2017)。在 950 cm-1–1200 cm-1是碳水化合物中pyranoid ring的指紋帶且可 能為β–型式，因此推測purified NPP及purified NFP皆屬於pyran殘基以β 鍵結的多醣。
蓮花胎座及花梗多醣體對 NIH-3T3 細胞的毒性分析
細胞死亡主要為細胞壞死 (necrosis)及細胞凋亡 (apoptosis)兩種途 徑。細胞壞死是細胞受到外在因子 (例如輻射、紫外線等)或毒素所引 起，在光學顯微鏡下可觀察到細胞腫大、破裂，且胞內物質流出 (Majno and Joris, 1995; Broker et al., 2005)。由活細胞數目及細胞外觀型態，可判 定樣品對細胞是否具有毒性。圖11 顯示，於細胞培養液添加 5–300 μg/mL
的purified NPP 並培養 24 小時，對小鼠纖維母細胞的細胞存活率皆無影 響 (P<0.05)；而添加 purified NFP 培養 24 小時，發現對細胞是有毒性的，
且在濃度5 μg/mL 以上就有毒性。圖 12 A 顯示健康且未做添加處理的小 鼠纖維母細胞外觀型態，可看出細長型外觀，兩端如手臂抓緊培養盤，
且覆蓋性高，像表皮層層保護般。添加100 μg/mL purified NPP 培養 24 小時後的細胞型態並無改變 (圖 12 B)；而添加 purified NFP 培養 24 小 時後的細胞型態雖無變化，但數量有減少現象 (圖 12 C)。
纖維母細胞 (fibroblasts)是真皮層 (dermis)的主要細胞 (張，2014)，
因此可初步認為NPP 使用於化妝原料在濃度低於 300 μg/mL 對皮膚沒有 毒性。
第五章 未來研究方向
根據以上試驗結果，未來方向可分成學術及應用研究
在學術研究方面：
1.
使用統計實驗設計方法，藉由改變溫度、時間、固/液比等參數，找尋NPP 及 NFP 的最佳萃取條件。
2.
利用high pressure size exclusion chromatography (HPSEC)更精確分 析purified NPP 及 purified NFP 的分子量。3.
使用scanning electron microscope (SEM)掃描式電子顯微鏡觀察 NPP 及NFP 與 purified NPP 及 purified NFP 外觀的差異。4.
使用 thermogravimetric analyzer (TGA)熱重量分析觀察 NPP 及 NFP 與 purified NPP 及 purified NFP 的熱崩解情況。在應用研究方面：
1.
NPP 具有良好的保水能力及抑制酪胺酸酶的效果，期待做為添加化 妝品的可能性。且具有高黏稠度的特性，可添加甚至取代食品增稠 劑等方面的應用。2.
試驗purified NPP 及 purified NFP 是否具有抗醣化、抗發炎作用或抗 腫瘤活性。3.
近年來，天然多醣的化學修飾已引起人們極大的關注，可以用於修飾 結 構 以 達 到 特 定 的 目 的 ， 並 產 生 新 的 生 物 活 性 (Jiang et al., 2015)。因此，可嘗試化學修飾蓮花多醣。
第六章 參考文獻
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