結果

3.1

3.2

3.3

萃取蓮花胎座及花梗多醣之產率

表1 為 100 ，超音波萃取 30 分鐘，依序萃取 5 次的結果。NPP 的 產率依序為52.1%、24.6%、14.3%、8.4%及 0.6%；NFP 的產率依序為 32.8%、26.1%、20.3%、12.5%、及 8.3%。結果顯示 NPP 萃取前 3 次產 率已達91.0%；NFP 萃取前 3 次產率可達 79.2%。而 NPP 及 NFP 相對於 胎座及花梗鮮重的的總產率分別為6.7%及 1.8%，顯示 NPP 的產率是 NFP 的3.7 倍 (表 2)。

蓮花胎座及花梗多醣的組成

中性醣、醣醛酸、蛋白質、總酚及類黃酮在NPP 的含量分別為

42.4%、25.8%、2.3%、4.9%與 1.1%，而 NFP 是 51.1%、17.7%、4.1%、

4.9%與 1.0% (表 3)。上述結果說明 NPP 及 NFP 的蛋白質、總酚及類黃

酮含量都相對較低，是以中性醣與醣醛酸為主，而且NPP 的醣醛酸比

NFP 高，但 NFP 的中性醣含量較多。

蓮花胎座及花梗多醣之黏度

圖2 顯示，NPP、NFP、黃原膠及阿拉伯膠在不同濃度下的黏度變 化。濃度低於0.25% (w/v)時四種水溶液黏性低，無法比較其黏度差異；

高於0.25% (w/v)的黏度會隨著濃度增加而上升，也開始表現黏度特性。

在0.5% (w/v)、25 條件下的黏度分別為 236.0 cP、15.0 cP、1455.3 cP 與0.1cP，NPP 黏度明顯高於 NFP；對照組黃原膠黏度又比 NPP 高出許 多，且阿拉伯膠較不具黏性。在濃度0.75% (w/v)時 NPP 及 NFP 的黏度 分別為1523 cP 與 32 cP，NPP 呈現較高的黏度特性。

3.4

3.5

蓮花胎座及花梗多醣之保水力

NPP、NFP、黃原膠及阿拉伯膠在濃度 1% (w/v)條件下的保水力分 別為101、74、132 及 66 (g 水重量/g 乾重)，顯示 NPP 保水力是 NFP 的 1.4 倍；黃原膠的保水效果又優於 NPP，而阿拉伯膠保水性較不佳 (圖 3)。

蓮花胎座及花梗多醣之抗氧化測定

3.5.1 清除ABTS自由基能力

NPP及NFP清除ABTS自由基的能力會隨著濃度增加而上升 (圖 4 A)。NPP及NFP在濃度 250 µg/mL時清除能力分別為 95.3%及 60.9%，而 且IC₅₀分別約為93 µg/mL及 205 µg/mL，說明NPP清除ABTS自由基能力 是NFP的 2.2 倍。標準品維生素C的IC50為 28  6 µg/mL，且在濃度 250 µg/mL時清除能力可達 98%。

3.5.2 清除DPPH自由基能力

NPP及NFP清除DPPH自由基的能力會隨著濃度增加而上升 (圖 4 B)。NPP及NFP在濃度 1000 µg/mL時清除能力分別為 71.6%及 71.2%，

而且IC50分別約為185 µg/mL及 312 µg/mL，說明NPP清除DPPH自由基 能力是NFP的 1.7 倍。標準品維生素C的IC50為 100  11 µg/mL，且在濃 度1000 µg/mL時清除能力可達 80%。

3.5.3 清除超氧陰離子效果

NPP及NFP清除超氧陰離子的能力會隨著濃度增加而上升 (圖 4 C)。NPP及NFP在濃度 1000 µg/mL時清除活性分別為 74.0%及 56.9%，

而且IC50分別約為805 µg/mL及 923 µg/mL，說明NPP清除超氧陰離子能 力是NFP的 1.1 倍。標準品維生素C的IC50為 211  9 µg/mL，且在濃度

1000 µg/mL時清除能力可達 86.2%。

3.5.4 螯合亞鐵離子能力

NPP及NFP螯合亞鐵離子能力會隨著濃度增加而上升 (圖 4 )。NPP 及NFP在濃度 1000 µg/mL時螯合亞鐵離子活性分別為 74.9%及 54.5%，

而且IC50分別約為431 µg/mL及 976 µg/mL，說明NPP亞鐵離子螯合能力 是NFP的 2.3 倍。標準品維生素C的IC50為102  12 µg/mL，且在濃度 1000 µg/mL時螯合亞鐵離子能力可達 87.2%。

3.6

3.7

抑制酪胺酸酶活性

抑制NPP及NFP 酪胺酸酶能力會隨著濃度增加而上升 (圖 5)。NPP 及NFP在濃度 2500 µg/mL時抑制活性分別為 73.0%及 55.2%，而且IC50分 別約為2099 µg/mL及 2407 µg/mL，說明NPP酪胺酸酶抑制能力是NFP的 1.1 倍。標準品維生素C的IC₅₀為 505  26 µg/mL，且在濃度 2500 µg/mL 時抑制能力可達91.0%。

陰離子交換層析純化蓮花胎座及花梗多醣體

使用DE-52 做為陰離子交換介質，分別注入 25 mL NPP 及 NFP (5.1 mg/mL)，以二次水及 0.0−0.5 M NaCl 濃度梯度流洗，並分析各劃分的中 性醣含量及醣醛酸含量。結果顯示NPP 以二次水流洗的第 15 管至第 21 管發現一高中性醣含量劃分，為未吸附的小分子醣類命名為未吸附 NPP (unadsorbed NPP)，且在第 48 管至第 56 管，0.13–0.19 M NaCl 出現一高 醣醛酸含量的劃分，為吸附於DE-52 上純化後的多醣命名為 purified NPP (圖 6 A)，產率分別為 6.7%及 51.6%；而 NFP 以二次水流洗的第 6 管至 第 26 管發現一高中性醣含量劃分，命名為未吸附 NFP (unadsorbed NPP)，且在第 41 管至第 55 管，0.07–0.18 M NaCl 出現一高醣醛酸含量

的劃分，命名為purified NFP (圖 6 B)，產率分別為 7.1%及 72.3%。

3.8

3.9

3.10

純化蓮花多醣之醣組成

直接分析未吸附 NPP 的醣組成含有 glucose 與 fructose (圖 7 A)，相 對的比例依序為 1：2；而未吸附 NFP 醣組成含有 glucose、mannose、

fructose 與 sucrose (圖 7 B)，相對的比例依序為 8：1：20：3 (表 4)。

Purified NPP 經酸水解後，主要醣組成為 galactose、mannose 與 glucuronic acid (圖 8 B)，相對比例分別為 1：1：2 (表 5)；而 purified NFP 主要的醣組成有galactose、mannose、galacturonic acid 與 glucuronic acid (圖 8 C)，相對比例分別為 17：13：1：35 (表 5)，顯見 NPP 及 NFP 的醣 成分明顯不同。

純化蓮花多醣之分子量

利用Sephacryl^TM S-400 膠體，層析標準品Blue dextran T2000、Dextran T500、Dextran T70、Dextran T40 及Dextran T10，分別於 45、70、105、

125 及 140 mL被流洗出 (圖 9 A)。Purified NPP及purified NFP流洗出的 溶離體積分別為 60–95 mL與 75–135 mL。將標準品的分子量以底數為 10 的對數值對應標準品的溶離程度製作Kav檢量線 (圖 9 B)，再以流洗 體積計算Kav並內插Kav檢量線，可獲得purified NPP分子量範圍約為 149–607 kDa，purified NFP 分子量較小，約 27–261 kDa。

傅立葉轉換紅外線光譜 (FT-IR)

圖10 為利用FT-IR分析經過DE-52、S-400 層析純化、透析脫鹽後的 乾燥樣品purified NPP及purified NFP之圖譜。兩多醣皆具有一強訊號在 3400 cm^-1、3429 cm^-1附近，為OH基團分子間與分子內的氫鍵結造成O—

H拉伸。於 2940 cm^-1及1330 cm^-1附近為CH2及CH3基團的C—H震動。於 1630 cm^-1及1420 cm^-1附近是對稱與非對稱羧基團 (—COO^—)拉伸。1250 cm^-1附近為S=O振動，說明具有硫酸酯 (Wang et al., 2017)。在 1200~950 cm^-1指紋區為判別多醣之pyranose cycle上之官能基的共振指標。Purified NPP及purified NFP主要的差異是前者於 1736 cm^-1有強訊號為esterified carboxylic groups (—COOR)；後者於 1332 cm^-1及1245 cm^-1有強訊號。

3.11 多醣對小鼠纖維母細胞 NIH 3T3 之毒性測試

添加不同濃度的 purified NPP 及 purified NFP 於小鼠纖維母細胞 NIH-3T3 培養 24 小時後觀察細胞的存活率。以控制組的細胞存活率為 100%，含 5、25、100 及 300 μg/mL 的 purified NPP 與 purified NFP 實驗 組的細胞存活率分別為93.2、98.9、94.0 及 82.0%與 74.8、78.5、91.7 及 73.4% (圖 11)，purified NPP 對細胞存活率在生物統計上皆無顯著差異，

可說明在濃度300 μg/mL 以下對小鼠纖維母細胞無毒性；而 purified NFP 在濃度5 μg/mL 以上有細胞減少的趨勢。圖 12 顯示，添加 100 μg/mL 的 多醣培養24 小時，皆不影響小鼠纖維母細胞的型態。

表 1 依序萃取蓮花胎座及花梗多醣之產率及比例

Extraction* 1^st 2^nd 3^th 4^th 5^th Total NPP Weight (g) 0.253 0.119 0.069 0.041 0.003 0.4856

(%) 52.1 24.6 14.3 8.4 0.6 100

NFP Weight (g) 0.173 0.138 0.107 0.066 0.044 0.527

(%) 32.8 26.1 20.3 12.5 8.3 100

*以超音波於 100 下分別萃取 5 次。

表 2 超音波萃取蓮花胎座及花梗之產率*

NPP NFP

Yield (g DW/g FW) 6.7 ± 1.6 1.8 ± 0.3

*使用超音波分別萃取蓮花胎座及花梗的多醣產率。數據為平均值 ± SEM (n = 3)。

表 3 蓮花胎座及花梗多醣之化學特性及含量

Chemical characteristics (%, w/w)

NPP NFP

Neutral sugar (as glucose equivalent) 42.4 ± 0.8^b 51.1 ± 0.2^a Uronic acid (as glucuronic acid equivalent) 25.8 ± 0.8^a 17.7 ± 0.5^a

Protein (as BSA equivalent) 2.3 ± 0^b 4.1 ± 0.1^a

Total phenol (as gallic acid equivalent) 4.9 ± 0.3^a 4.9 ± 1.1^a

Flavonoids (as catechin equivalent) 1.1 ± 0.1^a 1.0 ± 0.3^a

數據為平均值 ± SD，n = 3。不同字母表示蓮花多醣組成含量達 5%試驗水準。

表 4 未吸附 NPP 及未吸附 NFP 之中性醣組成相對比例

Composition Unadsorbed NPP Unadsorbed NFP

Glucose 1 8

Mannose ND 1

Fructose 2 20

Sucrose ND 3

未吸附NPP 及未吸附 NFP 為經過陰離子層析純化未吸附劃分，利用離子液相層析系

統分析中性醣成份組成。

ND：not detectable

表 5 Purified NPP 及 purified NFP 之主要醣組成相對比例

Composition purified NPP purified NFP

Galactose 1 17

Mannose 1 13

Galacturonic acid ND 1

Glucuronic aicd 2 35

Purified NPP 及 purified NFP 為經過陰離子層析使用 0.0−0.5 M NaCl 濃度梯度流洗純

化後多醣，並以4 M TFA，121 水解 1 小時後，再利用離子液相層析系統分析醣成

份。

ND：not detectable

Concentration (wt%)

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Viscosity (cP)

0 500 1000 1500

Xanthan gum NPP NFP Gum arabic

圖 2 不同濃度的 PP 與 NFP 以及市售黃原膠與阿拉伯膠之黏度變化

N

NPP 及 NFP 是以 100 ，超音波分別萃取的蓮花胎座及花梗的多醣，並以不同濃度 比較其黏度。黃原膠 (xanthan gum)及阿拉伯膠 (gum arabic)作為對照組，數據為平 均值 ± SD，n = 3。

NPP NFP Gum arabic Xanthan gum

Water-holding capacity (g/g)

0 50 100 150

b

c

c

a

圖 3 NPP 與 NFP 之保水力

NPP 及 NFP 是以超音波於 100 下萃取，並使用黃原膠、阿拉伯膠作為對照組。數 據為平均值 ± SD，n = 3。

Concentration (μg/mL)

15 62 125 250

ABTS scavenging (%)

0

100 250 500 1000

DPPH scavenging (%)

0

100 250 500 1000

Superoxide scavenging (%)

0

62 250 500 1000

Ferrous ion chelating (%)

0

Concentration (μg/mL)

100 500 1000 2500

Tyrosinaes inhibition (%)

0 20 40 60 80

NPP NFP VitC

圖 5 NPP 及 NFP 之抑制酪胺酸酶活性 數據為平均值 ± SD，n = 3。

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Reaction time (min)

Retention time (min)

0 20 40 60 8

(A) Peak 1：glucose，peak 2：fructose。(B)Peak 1：glucose，peak 2：mannose，peak 3：fructose，peak 4：sucrose。

Retention time (min) 水解purified NPP (B)與purified NFP (C)的醣成份層析圖

Standards：peak 1, fucose; peak 2, rhamnose; peak 3, arabinose; peak 4, galactose; peak 5, glucose; peak 6, mannose; peak 7, fructose; peak 8, sucrose; peak 9, gulonic acid γ-lactone; peak 10, galacturonic acid; peak 11, glucuronic acid。

Tube number

Molecular Weight (kDa)

10 100 1000

Kav

Wavenumber (cm-1) Wavenumber ( )

1000

Concentration (μg/mL)

0 5 25 100 300

Cell Viability (% of control)

0 25 50 75 100

purified NPP purified NFP

A a A

b

A

ab

A ab A

b

圖 11 以不同濃度的 purified NPP 及 purified NFP 對小鼠纖維母細胞 的存活率之影響

數據為平均值±SD，n=6。不同字母表示兩種處理：大寫字母為 purified NPP，小寫 字母為purified NFP，達 5% (P<0.05)試驗水準。

(A)

(B)

(C)

圖 12 以倒立式相位差顯微鏡觀察小鼠纖維母細胞 NIH-3T3 之細胞型 態。健康且未添加處理的小鼠纖維母細胞外觀 (A)，添加 100 μg/mL

purified NPP (B)及添加 100 μg/mL purified NFP (C)

在文檔中 香水蓮花胎座及花梗多醣之萃取純化及特性 (頁 39-58)