皮膚老化之簡介

隨著年紀的增長，皮膚的老化會使油脂分泌能力下降。而且過度清 洗，也會使皮膚變得乾燥。除了大家熟知的過度使用肥皂之外，過熱的 水、浸泡時間太長、用力的搓洗皮膚及刺激物 (強效洗潔液或溫泉水)都 會導致皮膚的乾燥與發癢 (Gragnani et al., 2014)，這時應該要加強保濕 工作，使用潤膚乳液等具保濕性的產品，使皮膚維持在潤澤且不油膩的 狀態 (張，2014)。

皮膚老化會有許多徵象，在外觀上會使皮膚紋理粗糙、皮膚鬆弛，

並產生皺紋及褐斑等 (Quan et al., 2009)。在皮膚生理機能上，則有角質 層的水分含量減少、表皮細胞增殖能力降低、真皮纖維母細胞增殖能力 降低及皮下組織脂肪減少的現象 (Limtrakul et al., 2016)。此外，對於皮 膚老化有許多理論，目前最被接受的是自由基老化理論 (free radical theory)。自由基是具有不成對電子的化學物質，會攻擊細胞組織，促成 癌症及老化產生 (光井武夫，2005；陳與洪，2001)。

1.8

1.9

酪胺酸酶抑制活性

酪氨酸酶廣泛分佈於自然界，對黑色素生成扮演重要角色，是造成 皮膚色素沉澱 (Olivares et al., 2009)、水果和蔬菜褐變的原因 (Kim et al., 2005)。酪氨酸酶抑制劑可用來治療一些與黑色素堆積過度有關的皮膚病 變甚至是皮膚癌等 (Limtrakul et al., 2016)。因此，植物多醣在抑制酪胺 酸酶能力是研究探討的熱點 (Rout et al., 2007)。

黑色素對保護皮膚免受紫外線傷害非常重要，但是黑色素的過量產 生會導致嚴重的皮膚疾病如雀斑，變色和色素沉著斑點。在黑素細胞中 進行黑色素生成，它們主要位於表皮的基底層。黑化程度是動物身體膚 色的主要因素。黑素細胞內的黑色素生合成是由幾種酶控制，合成途徑 如下：

酪氨酸酶催化為首要步驟，被認為是黑色素生產的關鍵酶。因此尋 找有效的酪氨酸酶抑制劑在皮膚增白劑的開發中是有價值的 (Kong et al., 2008)。

研究目的

本論文使用台南林鳳營九品香水蓮花園負責人林朕古先生培育出的 九品香水蓮花 (Nymphaea odorata)。當蓮花胎座以熱水加熱後擠壓，會 出現晶瑩狀黏質物，抹於手及面部，即時體現緊縮、光滑、潤澤的美容 效果。此外，香水蓮花的花梗亦存有黏物質，且至今仍未有蓮花胎座及 花梗多醣相關的正式文獻。因此本論文選用九品香水蓮花的胎座及花梗

做為研究材料，使用超音波萃取技術萃取存在上述組織的多醣，分析其 基本化學及物理特性、抗氧化活性及抑制酪胺酸酶活性，並使用陰離子 交換層析純化，進一步檢視醣組成、分子量、FT-IR及細胞毒性測試。整 體實驗架構如圖1。

期望藉由上述的組成與特性分析，評估蓮花胎座及花梗多醣是否具 有作為食品、化妝品及藥物添加劑的應用潛力。

圖 1 實驗架構圖

第二章 材料與方法

2.1 實驗材料

本 論 文 使 用 材 料 為 購 自 台 南 林 鳳 營 的 香 水 蓮 花 (Nymphaea odorata)，並分別取出胎座及花梗，於-20℃冰箱保存。

2.2 超音波萃取香水蓮花胎座及花梗

取蓮花胎座及花梗，各別秤取濕重。放置 100 mL 血清瓶，加入 50 mL 室溫的二次水，並使用超音波萃取設備 (台超公司)萃取，設定溫度 100 震盪30 分鐘萃取 5 次。收集各批萃取液混合均勻，以尼龍網 (300 mesh) 抽氣過濾，將濾液經冷凍乾燥後，計算萃取回收率，並保存於乾燥箱。

蓮花胎座多醣命名為 Nymphaea odorata placenta polysaccharides (NPP)，

而花梗多醣命名為 Nymphaea odorata flower stalk polysaccharides (NFP)。

計算公式：

產率 (%) = (萃取物乾重/樣品濕重) × 100%

2.3 蓮花多醣之組成含量測定 2.3.1 中性醣含量

原理：以酚-硫酸呈色法 (phenol-sulfuric acid)測定樣品中性醣含量。

濃硫酸可使雙醣、寡醣或多醣水解成單醣，而單醣又會脫水形成furfural (from pentoses)或hydroxymethyl furfural (from hexoses)並與酚結合而產生 黃金色的產物，此產物於490 nm有最大吸光值，並以葡萄糖 (D-glucose) 製作檢量線換算中性醣含量。

方法：實驗方法修改自蔣 (2003)與蔡 (2011)。取400 μL樣品，加入 200 μL 5% (w/v) phenol (MERCK, 100206)溶液混合，於室溫快速加入1 mL sulfuric acid (J. T. Baker, 9681-03)，在室溫反應20分鐘。混合均勻後取

100 μL以ELISA reader (SYNERGY 4，BioTek)測定490 nm吸光值，並以濃 度範圍為0–0.5 mg/mL葡萄糖 (D-glucose) (MERCK, 8337)製作檢量線，將 樣品吸光值代入檢量線可計算得出樣品的中性醣含量。

2.3.2 醣醛酸含量

原理：sodium tetraborate-H2SO4加入樣品中，樣品中所含的uronic acid 與tetraborate於100°C作用後，再加入meta-hydroxydiphenyl生成紫紅色產 物，此產物於520 nm的吸光值與uronic acid的濃度成正比，並以葡萄醣醛 酸 (D-glucuronic acid)標準品製作檢量線進行比對。

方法：參考Blumenkrantz與Asboe-Hansen (1973)的方法，取100 μL樣 品緩慢加入冰浴中的0.6 mL12.5 mM sodium tetraborate (Nacalai Tesque, 1303-96-4，溶於 H2SO4)。混合均勻後以100°C熱水浴反應5分鐘後，迅速 移至冰水浴。再加入10 μL 0.15% (w/v) meta-hydroxydiphenyl (Fluka, 54895)溶於NaOH (MERCK, 1.06498)呈色，而空白組則加入10 μL 0.5%

NaOH取代meta-hydroxydiphenyl，混合均勻後取200 μL以ELISA reader測 定520 nm吸光值，並以濃度範圍0–0.5 mg/mL葡萄醣醛酸 (SIGMA, G-5269)製作檢量線，將樣品吸光值減去空白組的吸光值，並代入檢量線 可得樣品的醣醛酸含量。

2.3.3 蛋白質含量

原理：利用Coomassie Brilliant Blue G-250在不同蛋白質濃度下的顏 色變化來測定。此種染劑主要與鹼性與芳香性胺基酸殘基結合，於595 nm 有最大吸光值。

方法：取200 μL樣品加入50 μL Coomassi^® Brilliant Blue G-250 (Bio-Rad, 500-0006)混合均勻，室溫反應5分鐘。混合均勻後取200 μL溶液 以ELISA reader測定595 nm吸光值，並以濃度範圍0–0.5 mg/mL bovine

gamma globulin (Bio-Rad, 500-0001)製作檢量線，代入檢量線可得樣品的 蛋白質含量。

2.3.4 總酚含量

原理：Folin-Ciocalteu reagent在碳酸鈉之鹼性環境下，若有多酚類化 合物會造成鎢鉬酸還原產生藍色化合物，在波長750 nm可測得吸光值。

方法：參考Scalbert等人 (1989)的方法，將樣品溶解在80%甲醇 (MERCK, 1.06007)，離心 (11,000 ×g)，取上清液100 μL，於避光環境下 加入500 μL 10% Folin–Ciocalteu’s phenol (SIGMA, F9295)，混合均勻且暗 反應5分鐘後，再加入400 μL 7.5% (w/v) sodium carbonate (SIGMA，223530) 混合均勻在暗反應30分鐘後。取200 μl上清液在ELISA reader測定750 nm 吸光值。以濃度範圍0–0.5 mg/mL沒食子酸 (gallic acid) (SIGMA，G7384) 製作檢量線，以80%甲醇為空白組製作檢量線，代入檢量線可得樣品的 總酚含量。

2.3.5 類黃酮含量

原理：類黃酮化合物於鹼性條件下可與 sodium nitrite 及 aluminum chloride 形成穩定的紅色化合物，在波長 510 nm 可測得吸光值。

方法：參考Wolfe 等人 (2003)之方法，取 150 μL 樣品與 600 μL 水 混合後加入75 μL 5% sodium nitrite (Alfa Aesar，14244)溶液，於室溫反 應5 分鐘，再加入 150 μL 10% aluminum chloride (Alfa Aesar，L18489)，

於室溫反應6 分鐘，最後加入 500 μL 1M NaOH 與 275 μL 的水，測定 510 nm 吸光值。以濃度範圍 0–0.5 mg/mL 兒茶素 (catechin) (TCI，C0705) 製作檢量線。

2.4 黏度測定

原理：本實驗使用指針式黏度計 (Dial Reading viscometer #LVT, Brookfield)，是為同心圓柱黏度計 (concentric cylinder viscometer)，紡錘 (spindle)與槽室 (chamber)各為兩個同心圓柱，將樣品溶液注入兩個同心 圓柱之間，測定使紡錘轉動所需的力可得一力矩 (torque)，又將紡錘編 號與轉速對應廠商技術手冊所附的關係表可得一常數，將此常數乘以力 矩是為樣品黏度，黏度單位為centipoise (cP)。

方法：將樣品以二次水回溶為0.25、0.5、0.75、1.0 % (w/v)，注入

槽室，以水浴槽控制25°C 條件，測得力矩的讀值。依據廠商技術手冊，

對照紡錘編號與轉速相對之常數，並乘以力矩讀值後獲得樣品水溶液的 cP 值。以商業黃原膠 (xanthan gum) (SIGMA, G1253)及阿拉伯膠 (gum arabic) (Vetec, V900768)作為對照組。

2.5 保水能力測定 (water-holding capacity)

原理：將樣品吸飽水分測其濕重，然後將吸飽水分的樣品烘乾至重 量不變，測其乾重。

方法：參考 Robertson 等人 (2000)之方法。取約 10 mg 樣品於 2 mL eppendorf 中，加入 1 mL 二次水，放置室溫一天。待樣品吸飽水分後，

離心 (11,000 ×g)，30 分鐘，然後將上清液去除，秤得濕重。再將吸飽水

分的樣品置於60 烘箱內待其乾燥，秤得乾重。

計算公式：

保水能力 (g 水重量/g 樣品乾重)=(濕重-乾重)/乾重

2.6 抗氧化能力分析

2.6.1

原理： ABTS 經過氧化氫與過硫酸鉀氧化後，形成藍綠色水溶性的

ABTS 陽離子自由基，且在 734 nm 具有強吸光的特性。當抗氧化劑還原 ABTS 陽離子自由基，則溶液顏色會變淺，吸光值會降低或消失。因此 當吸光值越低時，表示樣品清除ABTS 陽離子自由基的能力越強。

方法：參考Dong 等人 (2016)之方法。將 7.4 mM ABTS (Boehringer ingelheim, 102946)溶液與 2.6 mM potassium persulfate (SIGMA, 216224) 以 1：1 均勻混合，於室溫下避光反應 12~16 小時，使其生成穩定之藍 綠色 ABTS 陽離子自由基水溶液。取 100 μL 不同濃度的樣品 (15–250 μg/mL)與 100 μL ABTS 陽離子自由基水溶液混合均勻，並避光反應 10 分鐘。測定在734 nm 的吸光值。以標準品維生素 C 做為對照組。

計算公式：Scavenging activity (%) = [Ab-(As-Asb)]/Ab ×100 Ab：blank，As：樣品，Asb：樣品 blank

2.6.2

原理：油脂在自氧化的過程中會產生自由基而造成油脂酸敗，常見 的抗氧化物藉由提供氫 (hydrogen donor)來清除脂質過氧化物自由基 (peroxyl radical)，進而達到抑制氧化連鎖反應之進行。在抗氧化的研究 上最常使用 DPPH 自由基來評估抗氧化劑的供氫能力。DPPH 自由基溶 液在517 nm 下會有強吸光，但被抗氧化劑還原時則吸光值降低。因此，

在517 nm 的吸光值越低即表示抗氧化劑的供氫能力越強。

方法：參考Yamaguchi 等人 (1998)之方法，在 ELISA plate 中依序 加入20 μL 不同濃度樣品 (100–1000 μg/mL)與 80 μL 100 mM Tris-HCl，

再加入100 μL 的 95% ethanol 均勻混合，最後加入 100 μL 0.25 mM DPPH (SIGMA, D9132)避光反應 20 分鐘，測定在 517 nm 的吸光值。以 標準品維生素C 做為對照組。

計算公式：Scavenging activity (%) = [Ab-(As-Asb)]/Ab ×100 Ab：blank，As：樣品，Asb：樣品 blank

2.6.3

原理：超氧陰離子是生物體遭受氧化壓力後，首先生成的活性氧化 物。相較於其它活氧化物，超氧陰離子是相對較弱的氧化劑，然而它會 分解成其它較強的活性氧化物，例如singlet oxygen、hydroxyl radicals與 hydroxyl peroxide。此外，由於H2O2的生成，超氧陰離子會間接的啟動脂 質過氧化，進而產生hydroxyl radicals的前驅物。因此，超氧陰離子的清 除在抗氧化方面是非常地重要。藉由phenazine methosulphate (PMS)與 nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)作用生成超氧陰離子，再進一 步將nitroblue tetrazolium (NBT)還原成藍黑色產物，此化合物在 560 nm 時有最大吸光值。若樣品與超氧陰離子反應，減少藍黑色產物生成，其 吸光值將會降低。因此，吸光值越低，表示樣品清除超氧陰離子的能力 越強。

方法：參考Li 等人 (2006)之方法，取 50 μL 不同濃度樣品 (100–1000 μg/mL)依序加入 50 μL 300 μM NBT (SIGMA, 298-83-9)、50 μL 120 μM PMS (SIGMA, 299-11-6)、50 μL 936 μM NADH (SIGMA, N8129)均勻混 合，室溫避光反應5 分鐘，測定在 560 nm 下的吸光值。以標準品維生 素C 做為對照組。

計算公式：Scavenging activity (%) = [Ab-(As-Asb)]/Ab ×100 Ab：blank，As：樣品，Asb：樣品 blank

2.6.4

原理：在所有金屬離子中，Fe²⁺是最易產生自由基，進而造成脂質、

蛋白質及其它細胞成分的氧化。利用Fe²⁺與ferrozine結合的複合物在 562 nm呈色，可測得樣品對Fe²⁺離子的螯合能力。當樣品螯合Fe²⁺能力越強

時，562 nm的吸光值越低。

方法：參考 Dinis 等人 (1994)之方法，取 100 μL 不同濃度樣品

方法：參考 Dinis 等人 (1994)之方法，取 100 μL 不同濃度樣品