第二章 材料與方法
2.12 多醣對小鼠纖維母細胞NIH 3T3 之毒性測試
試劑：
1. Dulbecco,s modified Eagle Medium (DMEM培養基, Thermo, SH30022.02)
2. Fetal bovine serum (FBS, Thermo, SH30071.03 )
3. 無菌PBS緩衝溶液 (pH 7.4, phosphate buffered saline，0.8 g NaCl + 1.54 g Na2HPO4．12 H2O + 0.2 g KH2PO4 + 0.2 g KCl，補二次水至1 L 並滅菌)
4. 0.05% (w/v) Trypsin-EDTA (Thermo, SH30236.01) 5. Dimethyl sulfoxide (DMSO, MERCK, 1.02952)
6. 小鼠纖維母細胞NIH-3T3 mouse embryonic fibroblasts (NIH-3T3 cell, BCRC 60071)，為貼附型細胞。
培養條件：
培養在含10% FBS的DMEM培養基。培養環境為37℃、5% CO2及95%
空氣之培養箱。
冷凍細胞活化：
取出在液態氮桶內保存的細胞，以37℃水浴解凍，將細胞懸浮液加 入含適當培養基的離心管，以750 xg離心5分鐘，去除上清液，加入適當
培養基將細胞打散後移至培養盤。
細胞繼代培養：
將舊培養基移去，加入無菌PBS清洗細胞，去除殘留的培養基後加入 trypsin-EDTA溶液，並使溶液皆覆蓋細胞，將細胞置於37℃培養箱作用2 分鐘。顯微鏡下觀察細胞已脫落後，加入適當培養基使trypsin-EDTA溶液 中止作用，並均勻打散細胞後移至新的培養盤。
細胞冷凍保存：
將 舊 培 養 基 移 去 ， 加 入 無 菌PBS 去 除 殘 留 的 培 養 基 ， 使 用 trypsin-EDTA溶液將細胞脫落後，加入適當培養基中止trypsin-EDTA溶液 作用，以750 g離心5分鐘。除去上清液，加入適當FBS使細胞數目為 1×106/mL，取0.9 mL細胞溶液裝入冷凍小管，緩慢加入0.1 mL DMSO，
並混合均勻，置於冰上4℃，30分鐘，再移至-80℃，隔夜將冷凍小管移 入液態氮桶。
2.12.2 細胞計數
原理：
使用可以檢測活細胞的trypan blue染色細胞懸浮液，注入血球記數板 可計算細胞懸浮液中的活細胞數目。
試劑：
1. DMEM培養基 (Thermo, SH30022.02) 2. FBS (Thermo, SH30071.03 )
3. 無菌PBS緩衝溶液
4. 0.05% Trypsin-EDTA (Thermo, SH30236.01) 5. 0.4% Trypan blue solution (SIGMA, T8154)
方法：
將 舊 培 養 基 移 去 ， 加 入 無 菌PBS 去 除 殘 留 的 培 養 基 ， 使 用 trypsin-EDTA溶液將細胞脫落後，加入適當培養基中止trypsin-EDTA溶液 作用，均勻打散細胞後取10 μL細胞懸浮液並加入10 μL trypan blue混合後 取10 μL混合液注入血球計數盤計算活細胞數目。細胞計數盤有二個 chamber，每個chamber中細刻 9 個 1 mm2之大正方形，其中位於4個角 落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1 mm。當chamber上方蓋上蓋玻 片後，每個大正方形之體積為1 mm2×0.1 mm = 1.0×10-4 mL。使用時，計
數4個大正方形內之細胞數目，平均後乘以稀釋倍數，再乘以104，即為
每 mL中之細胞數目。
2.12.3 細胞存活率測試
原理：Methylthiazol tetrazolium (MTT)溶解在不含酚紅的培養液或鹽 溶液呈黃色；而活細胞粒線體中琥珀酸脫氫酶 (succinate dehydrogenase) 能將 MTT 黃色溶液還原為紫色的不可溶性 formazan 結晶，並沉積於細 胞中。以Dimethyl sulfoxide (DMSO)溶解 formazan 結晶，測定於 570 nm 的吸光值，所測得的吸光值與活細胞數成正比。
試劑：
1. DMEM培養基 (Thermo, SH30022.02) 2. FBS (Thermo, SH30071.03 )
3. 無菌PBS緩衝溶液
4. 0.05% Trypsin-EDTA (Thermo, SH30236.01)
5. 0.25 g/mL MTT溶液 (溶於50 mL 無菌PBS) (SIGMA, M5655) 6. DMSO (MERCK, 1.02952)
方法：
將舊培養基移去，加入無菌PBS去除殘留的培養基，使用
trypsin-EDTA溶液將細胞脫落後，加入適當培養基中止trypsin-EDTA溶液 作用，均勻打散細胞後取適量細胞懸液以細胞記數盤計算細胞數目。得 知細胞數目後，加入培養基調整細胞濃度，使100 μL細胞懸浮液內含 8×103細胞數，並注入96 孔盤培養 24 小時後取出舊培養基，加入 100 μL 含有樣品之DMEM培養基，使培養液內所含purified NPP及purified NFP 最終濃度分別為5、25、100 及 300 μg/mL，同時以含 10% FBS之DMEM 培養基做為控制組，繼續培養24 小時。培養 24 小時後，於避光狀態下，
加入100 μL MTT溶液繼續培養 4 小時，4 小時後移去培養液，加入 100 μL DMSO於避光狀態下振盪 20 分鐘，使formazan結晶充分溶解，再以 ELISA reader於 570 nm測定吸光值。
細胞存活率 (Cell viability) = 試驗組吸光值/控制組吸光值 × 100%