第一章 前言
1.2 多醣
植物中的碳水化合物包括單醣、雙醣、寡糖和多醣，醣類佔植物乾
重的80%以上。一般植物多醣由成百上千個單醣透過醣苷鍵所组成，已
不具甜味，其性質與單醣有很大不同 (何與潘，2010)。多醣通常存在於 植物的細胞壁中，有膠凝效果可用來增厚、穩定或保持植物質地，具有 特殊的生物活性，如協助消化 (Fu et al., 2018)、抗疲勞 (Gao et al., 2018)、抗病毒 (Lee et al., 2006)、抗菌消炎 (Chen et al., 2018)、抗衰老
(Gao et al., 2017)、抗腫瘤 (Deng et al., 2018)、降血糖 (Fan et al., 2018)、
保肝 (Lin et al., 2016)、降血脂及免疫調節 (Cheng et al., 2012; Zhang et al., 2017) 等，而且具低細胞毒性的特性 (Kardošová and Machová., 2006；Srivastava and Kulshreshtha., 1989)。因此，植物多醣廣泛地應用於 保健食品、醫藥和臨床上，成為食品科學、天然藥物、生物化學與生命 科學研究領域的熱點。
1.3
1.4
超音波萃取
不同的萃取方法不僅可以顯著影響植物多醣的產量，還有它們的結 構特點和生物活性 (Chen et al., 2017)。
超音波輔助萃取 (Ultrasound-assisted extraction, UAE)與其他萃取 法相比，是最廉價，快速，簡單和有效的技術之一 (Chen et al., 2016;
Maran et al., 2013)。超音波震動會產生氣泡，可產生化學、物理和機械 效應，促進萃取化合物的釋放，並增強樣品中溶劑的傳遞，增加目標化 合物從基質釋放到溶劑中的能力，達到深層萃取的目的 (Maran and Priya., 2014)。
UAE 的高重複性，已被廣泛使用於萃取各式生物活性物質，如:多 醣、黃酮類、精油以及生物活性成分。相較於傳統溶劑萃取方法，UAE 能夠提供較佳的產率及效率，並降低萃取的溫度及溶劑體積，與增加溶 劑的選擇性 (黃，2012)。
自由基之簡介
自由基定義為外層軌域具有不成對電子 (unpaired electron)的原子 或基團，因外層軌域的不穩定，而具有極高的化學反應性 (high chemical reactivity)，易與其它物質反應並奪取電子，穩定自由基本身但造成其它
物質的不穩定，引發一連串的反應，即為自由基的連鎖反應 (free radical chain reaction) (Halliwell, 1994)。
自由基的來源分為外生性 (exogenous)與內生性 (endogenous)兩 類，外生性為受到環境汙染、輻射、紫外線或吸菸等因素而誘導；內生 性 為人 體進行正 常代謝時 所產生 。 人 體 內 進 行 氧 化 代 謝 (oxidative metabolism)時，會產生活性氧 (reactive oxygen species, ROS)，活性氧是 以氧為中心的高反應分子。當活性氧與抗氧化防禦系統失衡時，過量的 活性氧攻擊細胞組織，造成氧化壓力 (oxidative stress)而促進老化或疾 病。常見的活性氧有超氧陰離子自由基 (superoxide radical, O2‧-)、過氧 化 氫 (hydrogen peroxide, H2O2) 及 氫 氧 離 子 自 由 基 (hydroxyl radical, ‧OH) (Lykkesfeldt, 1995)。
生物體在正常的活動中會不斷的產生多種自由基 (free radicals)，這 些自由基與癌症、心血管疾病等都有密切的關係 (Halliwell, 1987)。自由 基除了是各種疾病的致病因子之外，Harman 提出自由基及氧化傷害是造 成生物老化的重要原因。因此，如何有效的抑制或消除自由基，是當今 研究抗老化的重點之一 (Harman, 1993)。
抗氧化劑在生物系統中扮演重要的作用，包括細胞信號通路和防禦 氧化損傷 (Alencar et al., 2015)。細胞內抗氧化活性可防止由活性氧引起 的損傷。因此，抗氧化劑是有助於老化生理及人類疾病，如動脈硬化、
癌症、糖尿病、心血管和神經系統疾病，如帕金森病和阿茲海默症等
（Choudhari et al., 2014; Guetens et al., 2002）。
1.5 抗氧化能力分析
多醣會抑制氧化過程中所產生的自由基 (Bagchi et al., 2016)。本論 文以清除 2,2’-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS)自
由基能力、清除1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)自由基能力、清除 超氧陰離子能力及螯合亞鐵離子能力四種方法評估 NPP 及 NFP 的抗氧 化能力。
1.5.1 ABTS 自由基清除活性
ABTS經常被用來測定植物提取物或食品的抗氧化效果，且為親水 性抗氧化能力指標 (Dong et al., 2016)。ABTS加入過硫酸鉀 (potassium persulfate)產生氧化反應，形成藍綠色水溶性的ABTS•+陽離子自由基。
與抗氧化劑 (AOH)反應過程中，ABTS陽離子自由基水溶液被轉換成無 色的中性形式。形成反應式如下圖所示：
ABTS 陽離子自由基在 410 nm、645 nm、734 nm 及 815 nm 都有吸 光帶 (Child and Bardsley., 1975)。當 ABTS 陽離子自由基與抗氧化劑反 應時，吸光值會降低，表示樣品清除能力越強，進而評估樣品提供氫質 子清除自由基之能力。
1.5.2 DPPH 自由基清除活性
DPPH自由基是一相對安定的自由基，用來測試樣品提供氫質子 (H+) 以清除自由基之效力，屬疏水性抗氧化能力 (Dong et al., 2016)。由於短 時間內可測試大量樣品，為一普遍試驗樣品提供氫質子能力之方法 (Brand-Williams et al., 1995)，也被廣泛用來評估天然物的抗氧化效果 (Jin et al., 2016)。清除反應式如下：
DPPH 自由基在 517 nm 有強吸光 (Tabarsa et al., 2017)。
1.5.3
1.5.4
超氧陰離子清除活性
超氧陰離子自由基為最先產生、數量也最多的活性氧，半衰期短，
很少直接對人體造成傷害，卻會形成其它的活性氧，例如過氧化氫。雖 然過氧化氫不是自由基，但可穿透細胞膜到達人體各處，且易受過渡金 屬離子催化轉變為氫氧離子自由基。氫氧離子自由基的毒性最強，會使
細胞膜上的脂質過氧化及氧化修飾 DNA，將 DNA 上的鳥糞嘌呤
(guanine)突變為 8-hydroxyguanine 而造成細胞凋亡 (Yuan et al., 2018a)。
另外，氫氧離子自由基也可能氧化蛋白質，使蛋白質結構改變而失去活 性 (Zhu et al., 2004)。
亞鐵離子螯合能力
過渡金屬離子可催化H2O2產生氫氧離子自由基 (OH‧)及 (OH-)，
而OH-自由基也是造成脂質過氧化連鎖反應的原因之一。反應式如下：
過渡金屬離子中，Fe2+是最具影響力的助氧化劑。因此若是樣品有 螯合亞鐵離子能力，可認為具有抗脂質過氧化能力。許多文獻指出，螯 合能力的強度與羥基 (−OH)及羧基 (−COOH)的含量具有明顯之相關性 (Glusker, 1980; Wilson et al., 1980; Wilson et al., 1986)。
1.6 皮膚構造
皮膚是人體最大的器官，總表面積約 1.5−2.0 平方公尺，具有調節 體溫、防止乾燥及抵抗外來物質入侵的功能。皮膚由上而下可大致分為 表皮 (epidermis)、真皮 (dermis)和皮下組織 (subcutaneous tissue)三層，
另外還有一些附屬結構，如毛髮、指甲、皮膚腺體 (汗腺、皮脂腺)等 (吳，
2013)。
表皮平均厚度約0.1−0.3 mm，由內而外分為五層，即：基底層 (basal cell layer)、棘狀層 (stratum spinosum)、顆粒層 (stratum granulosum)、透 明層 (stratum lucidum)、角質層 (stratum corneum)，但只有手掌及腳掌 的部位具有透明層。表皮是由細胞縝密地堆積起來的，以三種型態的細 胞：角質細胞 (keratinocyte)、黑色素細胞 (melanocyte)及蘭格罕氏細胞 (langerhans cell) 所組成。角質細胞是表皮層裡主要行擴散代謝的細胞，
其功能為角質化以產生角質蛋白，表皮層內之各層是由角質細胞由其基 底層分裂代謝而形成。黑色素細胞生成黑色素，是造成膚色的主因之一。
蘭格罕氏細胞是皮膚之免疫反應中呈現抗原給淋巴球的細胞。
真皮以基底膜與表皮連繫，平均厚度約 0.3−2 mm，區分為乳頭層 (papillary layer)及網狀層 (reticular layer)，是由結締纖維、基質及細胞所
組成。真皮內含三類細胞：纖維母細胞 (fibroblast)、肥大細胞 (mast cell) 及巨噬細胞 (macrophage)。纖維母細胞可合成膠原蛋白纖維與彈力蛋白 纖維，其中膠原蛋白纖維其功用是保持組織的形狀，而彈力蛋白纖維可 使皮膚組織有彈性。肥大細胞和巨噬細胞則是與皮膚免疫反應有關。真 皮內基質功能為保持大量的水分，組成為醣蛋白和粘多醣，真皮內水分 可將養分從血管擴散到細胞中，同時使組織柔軟。
位於真皮下層的皮下組織是由海綿狀的結締組織與脂肪細胞所構 成，其中脂肪細胞會合成脂肪貯存於內，而脂肪的功能是保持體溫和貯 存能量。
1.7 皮膚老化之簡介
隨著年紀的增長，皮膚的老化會使油脂分泌能力下降。而且過度清 洗，也會使皮膚變得乾燥。除了大家熟知的過度使用肥皂之外，過熱的 水、浸泡時間太長、用力的搓洗皮膚及刺激物 (強效洗潔液或溫泉水)都 會導致皮膚的乾燥與發癢 (Gragnani et al., 2014)，這時應該要加強保濕 工作，使用潤膚乳液等具保濕性的產品，使皮膚維持在潤澤且不油膩的 狀態 (張，2014)。
皮膚老化會有許多徵象，在外觀上會使皮膚紋理粗糙、皮膚鬆弛，
並產生皺紋及褐斑等 (Quan et al., 2009)。在皮膚生理機能上，則有角質 層的水分含量減少、表皮細胞增殖能力降低、真皮纖維母細胞增殖能力 降低及皮下組織脂肪減少的現象 (Limtrakul et al., 2016)。此外，對於皮 膚老化有許多理論，目前最被接受的是自由基老化理論 (free radical theory)。自由基是具有不成對電子的化學物質，會攻擊細胞組織，促成 癌症及老化產生 (光井武夫，2005；陳與洪，2001)。
1.8
1.9
酪胺酸酶抑制活性
酪氨酸酶廣泛分佈於自然界，對黑色素生成扮演重要角色，是造成 皮膚色素沉澱 (Olivares et al., 2009)、水果和蔬菜褐變的原因 (Kim et al., 2005)。酪氨酸酶抑制劑可用來治療一些與黑色素堆積過度有關的皮膚病 變甚至是皮膚癌等 (Limtrakul et al., 2016)。因此，植物多醣在抑制酪胺 酸酶能力是研究探討的熱點 (Rout et al., 2007)。
黑色素對保護皮膚免受紫外線傷害非常重要，但是黑色素的過量產 生會導致嚴重的皮膚疾病如雀斑，變色和色素沉著斑點。在黑素細胞中 進行黑色素生成，它們主要位於表皮的基底層。黑化程度是動物身體膚 色的主要因素。黑素細胞內的黑色素生合成是由幾種酶控制，合成途徑 如下：
酪氨酸酶催化為首要步驟，被認為是黑色素生產的關鍵酶。因此尋 找有效的酪氨酸酶抑制劑在皮膚增白劑的開發中是有價值的 (Kong et al., 2008)。
研究目的
本論文使用台南林鳳營九品香水蓮花園負責人林朕古先生培育出的 九品香水蓮花 (Nymphaea odorata)。當蓮花胎座以熱水加熱後擠壓，會 出現晶瑩狀黏質物，抹於手及面部，即時體現緊縮、光滑、潤澤的美容 效果。此外，香水蓮花的花梗亦存有黏物質，且至今仍未有蓮花胎座及 花梗多醣相關的正式文獻。因此本論文選用九品香水蓮花的胎座及花梗
做為研究材料，使用超音波萃取技術萃取存在上述組織的多醣，分析其 基本化學及物理特性、抗氧化活性及抑制酪胺酸酶活性，並使用陰離子 交換層析純化，進一步檢視醣組成、分子量、FT-IR及細胞毒性測試。整 體實驗架構如圖1。
期望藉由上述的組成與特性分析，評估蓮花胎座及花梗多醣是否具 有作為食品、化妝品及藥物添加劑的應用潛力。
圖 1 實驗架構圖
第二章 材料與方法
2.1 實驗材料
本 論 文 使 用 材 料 為 購 自 台 南 林 鳳 營 的 香 水 蓮 花 (Nymphaea odorata)，並分別取出胎座及花梗，於-20℃冰箱保存。
2.2 超音波萃取香水蓮花胎座及花梗
取蓮花胎座及花梗，各別秤取濕重。放置 100 mL 血清瓶，加入 50 mL 室溫的二次水，並使用超音波萃取設備 (台超公司)萃取，設定溫度 100 震盪30 分鐘萃取 5 次。收集各批萃取液混合均勻，以尼龍網 (300 mesh)
取蓮花胎座及花梗，各別秤取濕重。放置 100 mL 血清瓶，加入 50 mL 室溫的二次水，並使用超音波萃取設備 (台超公司)萃取，設定溫度 100 震盪30 分鐘萃取 5 次。收集各批萃取液混合均勻，以尼龍網 (300 mesh)