第三章 實驗結果
第五節 偵測作用期的脾臟細胞及腸繫膜淋巴結細胞以 OVA 刺激後分泌細胞
在先前偵測老鼠血清的部分，我們看到了餵食豆類發酵產物老鼠體內的抗 OVA 之特異性抗體與 Th2 相關的抗體 IgE 的表現是顯著下降，而與 Th1 相關的抗 體IgG2a 的表現是顯著上升。接著我們利用 Enzyme-linked immunosorbent
assay(ELISA)的方式來偵測脾臟細胞及腸繫膜淋巴結細胞以 OVA 刺激 48hr 後分泌 細胞激素的情形。我們觀察與Th1 相關的細胞激素 IFN-r 以及與 Th2 相關的細胞 激素IL-4 的表現，同時也偵測了抗發炎細胞激素 IL-10，想要去比較在餵食豆類發 酵產物後Th1 與 Th2 的免疫反應是否有差異。實驗結果顯示，在偵測脾臟細胞的
部分，餵食豆類發酵產物老鼠 in vitro 以 OVA 的刺激 48hr 後，細胞分泌細胞激素 IFN-γ的量相對於餵食二次水的組別是有顯著上升的，同時，我們也看到餵食酵 母菌的組別細胞分泌細胞激素IFN-γ的量，相對於餵食二次水的組別也是有顯著 上升的(圖八(A))。
在脾臟細胞分泌細胞激素 IL-4 的部分，結果顯示，餵食酵母菌的組別細胞分 泌細胞激素IL-4，相對於餵食豆類發酵產物的組別與餵食二次水的組別，量是有 顯著下降(圖八(B))。在脾臟細胞分泌細胞激素 IL-10 的部分，結果顯示，餵食豆類 發酵產物的組別細胞分泌細胞激素IL-10，相對於餵食酵母菌的組別及餵食二次水 的組別，量是有顯著上升的(圖八(C))。
在偵測腸繫膜淋巴結細胞的部分，餵食豆類發酵產物老鼠 in vitro 以 OVA 的 刺激48hr 後，細胞分泌細胞激素 IFN-γ的量相對於餵食二次水的組以及餵食酵母 菌的組別細胞分泌細胞激素IFN-γ的量，相對於餵食二次水的組別呈現有統計上 的差異，但沒有顯著差異(圖九(A))。在腸繫膜淋巴結細胞分泌細胞激素 IL-4、IL-10 的部分，結果顯示，有統計上的意義但皆沒有達到顯著差異(圖九(B)(C))。
在偵測作用期的脾臟細胞及腸繫膜淋巴結細胞以 OVA 刺激後分泌細胞激素的 結果中，我們可以看到在系統性的免疫反應上，不論是脾臟細胞或腸繫膜淋巴結 細胞在餵食豆類發酵產物後都傾向Th1 的免疫反應，並且顯著提升抗發炎細胞激 素IL-10 的量。結果與先前偵測老鼠血清的部分，Th1 相關的抗體 IgG2a 的表現是 顯著上升，以及偵測誘導期的浸潤淋巴結以OVA 刺激後分泌細胞激素的結果都是 呈現一致的。另外，在餵食酵母菌的組別中，我們可以看到老鼠在系統性的免疫 反應也是傾向於Th1 的反應，以及可以看到 Th2 相關的細胞激素 IL-4 在脾臟細胞 的顯著下降，有趣的是，在腸繫膜淋巴結細胞刺激分泌IL-4 則呈現顯著上升。同 樣的對於分泌抗發炎激素IL-10 沒有影響，與偵測誘導期的浸潤淋巴結以 OVA 刺 激後分泌細胞激素的結果是呈現一致的。
第六節 偵測作用期的脾臟細胞及腸繫膜淋巴結以 OVA 刺激後細胞增
生的情形
同樣的，為了更進一步探討餵食豆類發酵產物後，在異位性皮膚炎作用期的脾 臟細胞及腸繫膜淋巴結細胞對於OVA 的刺激所產生系統性的免疫反應，我們利用 isotopes[H3] Thymidine Incorporation 偵測脾臟細胞及腸繫膜淋巴結細胞以 OVA 刺 激後細胞增生的情形。首先，將老鼠犧牲後取出脾臟細胞及腸繫膜淋巴結，以有 無加OVA 兩個條件進行細胞培養 48hr 後，加入 isotopes [H3]Thymidine
Incorporation 培養 16hr，以記數儀器進行放射線計數。圖示以有加 OVA 的細胞增 生結果cpm 值除以沒有以 OVA 培養的組別，所得到增生的倍數，stimulation indexes= [H3] Thymidine Incorporation (cpm) / unstimulated cells。結果顯示，餵食豆 類發酵產物老鼠的脾臟細胞以 in vitro OVA 的刺激增生的結果，相對於餵食酵母菌 的組別stimulation indexes 是有顯著被抑制的，而相對於餵食二次水的組別，
stimulation indexes 也是呈現被抑制的情形，但沒有達到顯著差異(圖十(A))。然而，
在餵食豆類發酵產物老鼠的腸繫膜淋巴結細胞以 in vitro OVA 的刺激增生的結 果，我們可以看到相對於餵食酵母菌的組別及餵食二次水的組別，都沒有達到顯 著差異(圖十(B))。
第七節 作用期的異位性皮膚炎老鼠模式加上金黃色葡萄球菌腸毒素 B (Staphylococcal enterotoxin B) 各組在外觀上的差異
在先前的實驗中，比較皮膚外觀上的差異，餵食豆類發酵產物、餵食酵母菌 與餵食二次水的組別在外觀上，都可以看到有紅腫發炎的情形，但難以利用肉眼 加以分辨三組的嚴重程度(圖七)。為了增強免疫反應的差異，在藥劑的部分添加了 金黃色葡萄球菌腸毒素B (SEB)。研究指出:有 90%的異位性皮膚炎患者在皮膚損 傷的部位發現有金黃色葡萄球菌的聚集(Breuer K, et al.2000 Allergy)，同時也有文
獻指出，在這些聚集的金黃色葡萄球菌中，有65%會產生具有超級抗原特性的腸 毒素(Campbell DE, et al.1998 Arch Dis Child)，所以研究推測，這些聚集產生的具 有超級抗原特性的腸毒素，可能在異位性皮膚炎的皮膚上扮演促進發炎的角色 (Girolomoni G, et al. 2001 J Am Acad Dermatol ，Kyu Han Kim, et al. 2006 J Korean Med Sci)。
實驗進行貼皮致敏三個循環後，老鼠犧牲前的皮膚狀況，實驗的組別中，在 藥劑的部分都會添加SEB，其中利用 PBS 來進行貼膚沒有以 OVA 致敏的組別當 作negative control，以 OVA 致敏且餵水的組別當作 positive control。分組如下:
(A)Negative 組: 貼膚致敏的藥劑為 PBS+SEB，沒有進行餵食。(B) SCLFP 組: 貼 膚致敏的藥劑為OVA+SEB，進行豆類發酵產物的餵食。(C) H2O 組: 貼膚致敏的 藥劑為OVA+SEB，進行二次水的餵食。箭頭所指為明顯的紅腫傷口。(圖十一) 在外觀上的觀測，我們可以清楚的看到，在餵食二次水的組別老鼠皮膚有明顯 的紅腫發炎以及傷口的出現，同時掉毛的情形相對於Negative 的組別與餵食豆類 發酵產物的組別都更為明顯。而在Negative 的組別，我們可以看到也有出現紅腫 發炎的皮膚，推測是由於加了金黃色葡萄球菌腸毒素B (SEB)所以也造成輕微的免 疫反應。在餵食豆類發酵產物(SCLFP)的組別中，我們可以看到相對於餵食二次水 的組別，老鼠皮膚紅腫發炎、傷口的出現以及掉毛的情形，都有改善的現象。
第八節 作用期的異位性皮膚炎老鼠模式加上金黃色葡萄球菌腸毒素 B (Staphylococcal enterotoxin B) H&E stain 在各組皮膚上的差異
在外觀上我們已經看到在(A)Negative 組 (B) SCLFP 組 (C) H2O 組是有明顯差 異的(圖十一)。所以我們進一步利用以 Haematoxylin(紫色) & Eosin(紅色)進行皮膚 的組織染色，分組如下: (A) 100 倍視野下(E) 200 倍視野下 Normal 組: 為沒有做任 何處理的老鼠皮膚。(B) 100 倍視野下(F) 200 倍視野下 Negative 組: 貼膚致敏的藥 PBS+SEB，沒有進行餵食。(C) 100 倍視野下(G) 200 倍視野下 SCLFP 組: 貼
膚致敏的藥劑為OVA+SEB，進行豆類發酵產物的餵食。(D) 100 倍視野下(H) 200 倍視野下H2O 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA+SEB，進行二次水的餵食(圖十二)。
由 H&E stain 的結果我們可以看到，在餵食二次水的組別皮膚發炎的情形以及 表皮的增厚，相對於Negative 的組別與餵食豆類發酵產物的組別都是呈現明顯較 嚴重的免疫反應。我們也可以看到在餵食豆類發酵產物後，在老鼠皮膚的發炎反 應於表皮的增厚，相對於餵食二次水的皮膚狀況是有明顯的改善的。然而在 Negative 的組別，相對於 Normal 沒有做任何處理的老鼠皮膚，也可以看到表皮有 增厚的情形。各組在老鼠皮膚所顯示H&E stain 的結果，與我們在外觀上的觀測有 一致的情形(圖十一)。
第九節 作用期的異位性皮膚炎老鼠模式加上金黃色葡萄球菌腸毒素 B (Staphylococcal enterotoxin B) H&E stain 在各組皮膚上的差異加以量化
統計
在 H&E stain 的結果中我們看到各組的差異，接著利用量測表皮的厚度來加以 量化皮膚發炎的程度，分別是: (輕度) Mild :10μm~20μm，(中度)
Moderate :20μm~50μm，(重度)Severe : > 50μm(圖十二(A)(B)(C))。
每組各有五隻老鼠的染色結果，結果顯示，在 Negative 的組別有四隻是屬於 輕度增厚(Mild)，一隻屬於中度增厚(Moderate)。在餵食豆類發酵產物的組別有兩 隻是屬於輕度增厚(Mild)，兩隻是屬於中度增厚(Moderate)，一隻是屬於重度增厚 (Severe)。在餵食二次水的組別則可以看到有兩隻是屬於中度增厚(Moderate)，三隻 是屬於重度增厚(Severe)(圖十三)。
將各組皮膚上的差異加以量化統計的結果中，我們可以看到 Negative 的組別皮 膚表皮增厚傾向輕度的，餵食豆類發酵產物的組別則傾向輕度與中度，在餵食二 次水的組別則傾向表現中度與重度的結果。所以我們可以知道餵食豆類發酵產物
後對於皮膚上的發炎反應也可以加以調節。
第十節 作用期的異位性皮膚炎老鼠模式加上金黃色葡萄球菌腸毒素 B (Staphylococcal enterotoxin B)在各組皮膚上發炎細胞 Eosinophils 浸潤 的差異加以量化統計
在H&E stain 的結果中我們看到各組的差異，以及在表皮厚度的量測上也統 計出各組的差異，接著利用量測各組皮膚上發炎細胞Eosinophils 浸潤來評估老鼠 皮膚發炎的程度。
由(圖十四(A))可以看到，為 H2O 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA+SEB，進行二 次水的餵食。在400 倍視野下顯示發炎細胞 Eosinophils 的情形，箭頭所指即為發 炎細胞Eosinophils。主要是計數四個顯微鏡下 400 倍的視野中 Eosinophils 的細胞 個數後再平均所顯示的結果，每組有五隻老鼠，由實驗結果我們可以看到
Eosinophils 細胞浸潤的情形在餵二次水的組別相對於餵食豆類發酵產物的組別，
是有顯著上升的，所以我們可以知道，餵食豆類發酵產物可以減緩作用期的異位 性皮膚炎動物模式在皮膚損傷的發炎狀況。(圖十四(B))
第十一節 作用期的異位性皮膚炎老鼠模式加上金黃色葡萄球菌腸毒 素B (Staphylococcal enterotoxin B)體重的變化
在藥劑添加了金黃色葡萄球菌腸毒素 B(SEB)的實驗結果中，我們清楚的看到 老鼠外觀及切片染色後在各組的差異。接下來，我們將實驗的老鼠每個禮拜的體 重變化做了整裡，計算出每組老鼠的體重平均值，從第一周開始餵食，圖中箭頭 所指為進行貼膚致敏的週數(圖十五)。
結果顯示，從開始實驗到老鼠犧牲，各組老鼠的體重變化都維持在 15g~20g
以及Negative 的組別都是較重的，而且我們可以看到在 Negative 的組別老鼠體重 沒有太大的變化，但在進行第二次貼膚致敏(第四週)後餵食二次水的老鼠體重開始 下降，並且在第三次貼膚致敏(第六週) 餵食豆類發酵產物(SCLFP)的老鼠體重，相
以及Negative 的組別都是較重的，而且我們可以看到在 Negative 的組別老鼠體重 沒有太大的變化，但在進行第二次貼膚致敏(第四週)後餵食二次水的老鼠體重開始 下降，並且在第三次貼膚致敏(第六週) 餵食豆類發酵產物(SCLFP)的老鼠體重，相