國立臺灣大學口腔生物科學所 碩士論文
Graduate Institute of Oral Biology College of Medicine
National Taiwan University Master Thesis
探 討 利 用 酵 母 菌 進 行 豆 類 發 酵 後 的 產 物 對 實 驗 性 異 位 性 皮 膚 炎 老 鼠 模 式 的 免 疫 調 節 作 用 Immunomodulatory effect of a legume-based fermented product by Saccharomyces cerevisiae in
experimental atopic dermatitis
黃靖甯 Ching-ning Haung
指導教授：賈景山 博士 Advisor: Jean-san Chia,Ph.D.
中華民國 99 年 7 月
July, 2010
中文摘要
腸道是人體重要的免疫系統，在腸道的淋巴組織(Gut-associated lymphoid tissue, GALT)約占身體免疫系統的 70%。腸道細菌的刺激對於腸道免疫系統的調節是相 當重要的，其中像是益生菌，可以改變宿主腸道菌叢而產生有益健康效果，並可 以在大腸中利用小腸無法消化吸收的物質(益生物質)為食物，例如:β 聚糖，發酵產 生有益腸道之物質並抑制壞菌生長。豆科植物Legume 特別是指帶有豆莢且有整齊 排列種子包裹在內的植物，像是蠶豆、豌豆等。豆類的營養價值高，富含有纖維 素、脂質、礦物質及維他命等，其中大豆更含有大量的必需胺基酸，是很好的蛋 白質來源。發酵作用可分解大分子物質、增加易消化性、增進生物可利用率，進 而提高營養價值;發酵物不僅易於消化吸收，還可消除自由基、抗老化，增強抵抗 力。本實驗主要的研究目的:是想去探討酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)以及利用 酵母菌進行豆類發酵後的產物對 實 驗 性 異 位 性 皮 膚 炎 老 鼠 模 式 的 免 疫 調 節 作 用。已有許多文獻指出:食用以酵母菌、乳酸菌發酵的食品是具有抗氧化、抗癌 以及增加免疫力等功效，此外，韓國的一種傳統的豆類發酵食品Chungkukjang 在 文獻中提到對於過敏反應是有益的，特別像是氣喘和異位性皮膚炎。首先，利用 異位性皮膚炎的老鼠動物模式來進行實驗，結果顯示，不論在誘導期或是作用期 的異位性皮膚炎，餵食豆類發酵產物(SCLFP)的老鼠，所分泌的細胞激素會傾向 TH1 的反應，以及顯著提升抗發炎細胞 IL-10 的量，在細胞增生指數則是呈現顯著 被抑制的結果。為了增強免疫反應的差異，在藥劑的部分添加了金黃色葡萄球菌 腸毒素B，在外觀以及組織切片的結果，都可以看到餵食豆類發酵產物在異位性皮 膚炎的症狀上都有明顯的改善。最後，去探討建立口服耐受性對異位性皮膚炎的 影響，結果顯示，建立口服耐受性是可以成功降低對於外來物質容易產生敏感性 的免疫反應，進一步去影響異位性皮膚炎的免疫調節。綜合以上，我們推測餵食 豆類發酵產物可以去調節TH1 與 TH2 之間的平衡，此外，對於異位性皮膚炎症狀 的改善，推測可能是與誘導調節性T 細胞的產生有關。
英文摘要
The gastrointestinal tract is the important immunity system and the functions as a barrier against antigens from microorganisms and food. The generation of immunophysiologic regulation in the gut depends on the establishment of indigenous microflora. Probiotics are defined as live bacterial preparations with clinically documented health effects in humans. Legumes are plants that have pods with tidy rows of seeds inside includes beans, peas, lentils and peanuts. Pulses contain significant amounts of crude fibre, lipids, minerals and vitamins. Soy contains significant amounts of all the essential amino acids for humans and so is a good source of protein. The fermentation process helps not only in improving the organoleptic quality of legumes but also enhances nutritional quality. Fermentation is an important area of research, which entails the ability to hydrolyze soy protein into smaller peptides. In addition, previous study demonstrated that a Korean traditional fermented soybean food: Chungkukjang may be beneficial for several allergic conditions such as asthma and atopic dermatitis. In this study, we use an experimental atopic dermatitis animal model to investigate immunomodulation effect of saccharomyces cerevisiae and it’s legume fermented product. Our result showed that in mice under induction or effection phase of atopic dermatitis, the administration of saccharomyces cerevisiae legume fermented product (SCLFP) can induce Th1 specific immune response and increase cytokine IL-10.
Furthermore, SCLFP-administration can improve skin lesions. On the other hand, SCLFP may enhance oral tolerance that decreased allergic response. We hypothesized that the effect of SCLFP on atopic dermatitis may be related to the induction of regulatory T cells.
目錄
中文摘要 ...I 英文摘要 ...II 目錄 ...III 圖目錄……….V
第一章 文獻回顧 ...1
第一節 飲食影響免疫調節... 1
第二節 豆科植物(Legume) ... 3
第三節 豆類的營養價值及用途... 4
第四節 直接食用豆類的問題... 5
第五節 發酵豆類食品之營養與機能... 6
第六節 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) ... 7
第七節 過敏簡介... 9
第八節 異位性皮膚炎(atopic dermatitis) ... 9
第九節 金黃色葡萄球菌與異位性皮膚炎的關係... 12
第十節 口服耐受性與異位性皮膚炎的關係... 13
第十一節 研究目的與實驗設計... 14
第二章 實驗材料與方法 ...15
第一節 實驗動物小鼠... 15
第二節 建立異位性皮膚炎老鼠動物模式(Atopic dermatitis model) ... 15
第三節 豆類發酵產物的製備... 16
第四節 熱致死酵母菌(Saccharomyces cerevisiae) 的製備 ... 16
第五節 老鼠食道插管餵食... 17
第六節 異位性皮膚炎之誘導期實驗設計... 17
第七節 異位性皮膚炎之作用期實驗設計... 17
第八節 作用期的異位性皮膚炎老鼠模式加上金黃色葡萄球菌腸毒素 B (Staphylococcal enterotoxin B)實驗設計... 18
第九節 建立口服耐受性(oral tolerance)對異位性皮膚炎之作用期實驗設計 19 第十節 老鼠血清特異性抗體(specific antibody)的偵測... 19
第十一節 老鼠脾臟(Spleen)、腸繫膜淋巴結(Mesenteric lymph node)、浸潤淋 巴結(Draing lymph node)細胞培養及刺激的方法 ... 20
第十二節 細胞增生(cell proliferation)的偵測 ... 22
第十三節 細胞激素(cytokine)的偵測 ... 22
第十四節 組織化學染色(H&E stain) ... 23
第十五節 組織化學染色表皮厚度加以量化... 23
第十六節 組織化學染色發炎細胞 Eosinphils 的計數... 23
第十七節 統計分析... 24
第三章 實驗結果 ...24
第一節 偵測誘導期的浸潤淋巴結以 OVA 刺激後分泌細胞激素的情形 ... 24
第二節 偵測誘導期的浸潤淋巴結以 OVA 刺激後細胞增生的情形 ... 25
第三節 偵測作用期的老鼠血清中抗 OVA 特異性抗體 ... 26
第四節 作用期的異位性皮膚炎老鼠模式各組在外觀上的差異... 27
第五節 偵測作用期的脾臟細胞及腸繫膜淋巴結細胞以 OVA 刺激後分泌細胞 激素的情形... 27
第六節 偵測作用期的脾臟細胞及腸繫膜淋巴結以 OVA 刺激後細胞增生的情 形... 29
第七節 作用期的異位性皮膚炎老鼠模式加上金黃色葡萄球菌腸毒素 B (Staphylococcal enterotoxin B) 各組在外觀上的差異... 29
第八節 作用期的異位性皮膚炎老鼠模式加上金黃色葡萄球菌腸毒素 B (Staphylococcal enterotoxin B) H&E stain 在各組皮膚上的差異... 30
第九節 作用期的異位性皮膚炎老鼠模式加上金黃色葡萄球菌腸毒素 B (Staphylococcal enterotoxin B) H&E stain 在各組皮膚上的差異加以量化統計 ... 31
第十節 作用期的異位性皮膚炎老鼠模式加上金黃色葡萄球菌腸毒素 B (Staphylococcal enterotoxin B)在各組皮膚上發炎細胞 Eosinophils 浸潤的差異 加以量化統計... 32
第十一節 作用期的異位性皮膚炎老鼠模式加上金黃色葡萄球菌腸毒素 B (Staphylococcal enterotoxin B)體重的變化... 32
第十二節 建立口服耐受性在作用期的異位性皮膚炎老鼠模式各組在外觀上 的差異... 33
第十三節 建立口服耐受性在偵測作用期的老鼠血清中抗 OVA 特異性抗體 ... 34
第十四節 建立口服耐受性在偵測作用期的脾臟細胞及腸繫膜淋巴結細胞以 OVA 刺激後分泌細胞激素的情形 ... 35
第十五節 建立口服耐受性在偵測作用期的脾臟細胞及腸繫膜淋巴結以 OVA 刺激後細胞增生的情形... 36
第四章 討論 ...37
第五章 參考文獻 ...44
圖目錄
圖一、異位性皮膚炎的建立 ...61
圖二、異位性皮膚炎之誘導期實驗設計 ...62
圖三、偵測誘導期的浸潤淋巴結以 OVA 刺激後分泌細胞激素的情形 ...63
圖四、偵測誘導期的浸潤淋巴結以 OVA 刺激後細胞增生的情形 ...64
圖五、異位性皮膚炎之作用期實驗設計 ...65
圖六、偵測作用期的老鼠血清中抗 OVA 特異性抗體 ...66
圖七、作用期的異位性皮膚炎老鼠模式各組在外觀上的差異 ...67
圖八、偵測作用期的脾臟細胞以 OVA 刺激後分泌細胞激素的情形 ...68
圖九、偵測作用期的腸繫膜淋巴結細胞以 OVA 刺激後分泌細胞激素的情形 ....69
圖十、偵測作用期的脾臟細胞及腸繫膜淋巴結以 OVA 刺激後細胞增生的情形 ..70
圖十一、作用期的異位性皮膚炎老鼠模式加上金黃色葡萄球菌腸毒素 B (Staphylococcal enterotoxin B) 各組在外觀上的差異 ...71
圖十二、作用期的異位性皮膚炎老鼠模式加上金黃色葡萄球菌腸毒素 B (Staphylococcal enterotoxin B) H&E stain 在各組皮膚上的差異 ...72
圖十三、作用期的異位性皮膚炎老鼠模式加上金黃色葡萄球菌腸毒素 B (Staphylococcal enterotoxin B) H&E stain 在各組皮膚上的差異加以量化統計 ...73
圖十四、作用期的異位性皮膚炎老鼠模式加上金黃色葡萄球菌腸毒素 B (Staphylococcal enterotoxin B)在各組皮膚上發炎細胞 Eosinophils 浸潤的差 異加以量化統計 ...74
圖十五、作用期的異位性皮膚炎老鼠模式加上金黃色葡萄球菌腸毒素 B (Staphylococcal enterotoxin B)體重的變化 ...75
圖十六、探討建立口服耐受性(oral tolerance)對異位性皮膚炎之作用期實驗設 計 ...76
圖十七、建立口服耐受性在作用期的異位性皮膚炎老鼠模式各組在外觀上的差異 ...77
圖十八、建立口服耐受性在偵測作用期的老鼠血清中抗 OVA 特異性抗體 ...78
圖十九、建立口服耐受性在偵測作用期的脾臟細胞以 OVA 刺激後分泌細胞激素的 情形 ...79
圖二十、建立口服耐受性在偵測作用期的腸繫膜淋巴結細胞以 OVA 刺激後分泌細 胞激素的情形 ...80
圖二十一、建立口服耐受性在偵測作用期的脾臟細胞及腸繫膜淋巴結以 OVA 刺激 後細胞增生的情形 ...81
附表、附圖 ...82
第一章 文獻回顧
第一節 飲食影響免疫調節
近年來人們對腸道的看法出現了新轉向，過去，我們只知道腸道具有消化、吸 收的功能，但有愈來愈多的文獻指出，腸道不只是消化系統，還與免疫能力息息 相關。Sanderson 指出，改變飲食的組成成分可能可以調節免疫能力，例如:減少 病菌感染及致病的機率、降低過敏反應等(Sanderson, 2007)。
腸道概論
腸道是將食物消化，且能選擇性吸收的重要器官，黏膜表面對於食物成分、病源 性微生物、腸內細菌和消化酵素等各式各樣的刺激，具有物理性與化學性的隔離 機能。腸道也是人體最重要的免疫系統，存在於腸道的淋巴組織(Gut-associated lymphoid tissue, GALT)約占身體免疫系統的 70%(Isolauri, 2001b)。
腸道表面除了有腸道上皮細胞外，還有一種特化成圓頂狀的上皮細胞，稱為M 細 胞(Membranous cell)，其表面不具有絨毛覆蓋，而是呈現凹陷的形狀，使得微生物 或抗原可由此路徑通過，M 細胞底下即為派伊爾氏淋巴結(Payer’s patch, PP)，派伊 爾氏淋巴結中的抗原呈獻細胞(Antigen presenting cell, APC)將會進行免疫細胞的 辨識。除此之外，存在於黏膜固有層中之免疫細胞還包括:B 細胞、輔助型 T 細胞、
毒殺型T 細胞、單核球、巨噬細胞、樹突細胞、和顆粒細胞、肥大細胞等(Isolauri, 2001a; Nagata et al., 2000)。
腸道黏膜中的抗體，以IgA(Immunoglobulin A,IgA)含量最豐富，IgA 是經由漿細胞 分泌之J 鍊(J chain)將兩個單體結合而以雙體的型式存在。在腸道的黏膜中分泌型 的IgA(Secretory IgA,S-IgA)會以結合的方式達到抵禦外來病原菌的角色，S-IgA 為 直接與病原菌結合，進而避免病原菌黏附到上皮細胞表面，因此S-IgA 在腸道黏
膜系統中扮演著免疫防禦的重要角色(Blum et al., 1999)。
腸道細菌的刺激對於腸道免疫系統的調節是相當重要的(Fujioka et al., 2004)，其中 口服耐受性(oral tolerance)是指對於經口攝取的食物抗原，在免疫耐受性狀態下並 不會誘導產生對抗食物抗原的免疫反應，這也是跟腸道中的細菌有很大的關係 (Brandtzaeg, 2002)，此外，也有研究證實腸道菌會去影響口服耐受性的作用，導致 過敏的免疫反應產生，研究指出，利用腸道無菌老鼠與正常老鼠進行口服耐受性 的實驗，將老鼠經口攝取蛋白抗原一段時間，之後再將相同蛋白抗原注入腹腔內，
接著進行老鼠體內免疫反應的測試，結果顯示，腸道無菌老鼠的Th2 相關的免疫 反應IgG1 和 IgE 抗體相對於正常老鼠是顯著上升的(Sudo et al., 1997)。
益生菌(probiotic)
益生菌，衍生自希臘語是”for life”，解釋為某一原生動物產生的物質可以促使另一 原生動物生長。是指可以改變宿主腸道菌叢而產生有益健康效果的活性微生物，
並可以在大腸中利用小腸無法消化吸收的物質為食物，發酵產生有益腸道之物質 並抑制壞菌生長(Commane et al., 2005)。廣義的定義為:凡是應用到人類或其他動 物，藉由改善腸內微生物平衡且有益於宿主的活菌，不論是單一或混合菌株均可 視為益生菌(Spanhaak et al., 1998)。
俄國科學家Metchnikoff 在 1908 年提出飲用發酵乳可以延長壽命的理論，認為乳 酸菌可以抑制有害菌的生長，進而延緩老化(Mercenier et al., 2003)。研究指出，以 乳酸菌餵食老鼠，可以使腸道中IgA 的分泌量增加，顯示可增強腸道黏膜的免疫 反應(Perdigon et al., 1994)。其他研究也顯示，益生菌能對抗腸胃道及呼吸道的感 染，尤其是Lactobacillus 和 Bifidobacterium 有刺激免疫力的效果，藉由增加抗體 產生和白血球的吞噬作用以強化免疫系統(Sakai et al., 2006)。實驗也證實，讓患有 異位性皮膚炎的孕婦服用發酵乳，可降低嬰兒出生後異位性皮膚炎的發生率(Jung and Stingl, 2008; Kalliomaki et al., 2001)。除此之外，在預防感染以及抗腫瘤的研究 也指出，乳酸菌及雙叉桿菌之菌體的成分可以活化人體淋巴細胞且具有抗腫瘤的 效果。最後在營養方面的研究指出，人體在營養不良的情況下，容易導致腸道上 皮細胞萎縮，使得免疫力下降，影響消化吸收的能力，而益生菌能強化免疫力並
改善營養不良的狀況，此外，益生菌也可以改善乳糖不耐症(lactose intolerance)的 營養問題(Hamilton-Miller, 2004)(附圖六)。
益生物質(Prebiotics)
益生物質，是指能夠選擇性促進益生菌生長之物質，其在小腸內不被消化吸收但 可以提供益生菌在大腸內生長繁殖所必須的營養和發酵的原料，間接調節宿主的 免疫力(de Vrese and Schrezenmeir, 2008)。例如:一些食物原料，膳食纖維(dietary fibre)、不被消化的澱粉(nondigestible food ingredients)以及寡糖(Oligosaccharides)，
由於結構特殊，不能被人體消化道酵素分解，可通過消化道而被腸內的益生菌選 擇性的發酵利用(Gibson and Roberfroid, 1995; Kullen and Bettler, 2005; Palframan et al., 2003)。研究指出，木寡糖可選擇性的被腸道中的雙叉桿菌發酵產生短鏈脂肪 酸，而降低腸道pH 值，使腸內菌相組成產生變化(Campbell et al., 1997)。同時，
也有文獻指出，果寡糖可提高腸道中雙叉桿菌的數量，且能降低腸道的有害菌 (Gibson and Roberfroid, 1995)。Iikura 與 Nagura 從動物實驗中發現，給與食物過敏 的老鼠餵食果寡糖，糞便中的有機酸(如酪酸等)會增加，而且能夠降低血清中 IgE 的濃度，進而改善過敏症狀(Nagura et al., 2002)。除此之外，在餵食果寡糖五周的 老鼠中發現，糞便的IgA 與血清中的 IgG 都是顯著上升的，並且在致免後感染沙 門氏桿菌的存活率也較高(Benyacoub et al., 2008)。
第二節 豆科植物(Legume)
Legume 特別是指帶有豆莢且有整齊排列種子包裹在內的植物，像是蠶豆、豌 豆、扁豆、花生……等，都是屬於 legume 中的一員。豆類的營養價值高，富含有 纖維素、脂質、礦物質及維他命……等，其中常見的大豆更含有大量的必需胺基 酸，是很好的蛋白質來源，另外大豆的成分像是大豆異黃酮素(isoflavones)，研究 發現他可以減少癌症、心臟病及其他疾病的危險性、而皂素(saponin)則可以促進免 疫功能並具有抗癌的功效。(美國黃豆學會台灣辦事處網站資料)(附表一)
第三節 豆類的營養價值及用途
近幾年來，大豆及其製品受到科學家和營養學家的重視，因為研究指出具有 防癌及增進健康的效果。其中特別是大豆蛋白質具有許多神奇的機能，包括降低 膽固醇、預防動脈硬化、預防高血壓、預防肥胖、增加免疫力、預防腦中風、降 血糖、預防骨質疏鬆症、防癌、延年益壽、增強筋肉……等(青山敏明,1999)。大豆 蛋白質水解物(beta-conglycinin)也具有免疫活性及抗氧化效應(Yamauchi &
Suetsuna, 1993; Chen et al., 1995)。
根據流行病學資料指出，西方人罹患乳癌，大腸癌和攝護腺癌的機率比東方 人高出約4 倍，可能與大豆食品攝取量有密切的關係(Messina et al., 1994)。除了大 豆外一些常見的豆類也含有許多營養物，列舉如下:
青豆：為豌豆之製品，營養價值較新鮮豌豆稍差，經常均作為菜餚中之配料。
黑豆：又稱烏豆，營養價值與黃豆等，能治腳氣，療風濕，可補腎亦能補血。
綠豆：性寒，能解暑熱，豆粉能外敷，豆殼可作枕蕊，為夏令消暑解熱食品。
紅豆：含維他命 B 極豐富，功能利小便，治泄瀉，治腳踵。頗為有益之食品。
四季豆: 青翠爽脆，普通均作菜餚食，富含維他命 C 類，營養不及黑豆與黃豆。
豌豆：含有糖質脂肪質很豐，為炒菜中主要配料，有益中氣，並能治療泄瀉。
扁豆：健脾胃，除濕熱，治綠便，療治多年便溏，是豆類中良好營養品之一。
眉豆: 健脾養胃，營養成份較其它豆類稍差，普通用作糕點，或作豆沙餡用。
蠶豆：營養價值最高，含有蛋白質、糖、維他命 B 和 C 甚豐，礦物質頗多。
第四節 直接食用豆類的問題
雖然豆類的營養成份豐富，但豆類並非絕無缺點，直接食用豆類的生物利用 率較差，因為含有某些抗營養因數(antinutritional factors)，不僅不利於人體對養分 的的消化吸收，而且有害於健康。例如:
1.影響人體對碳水化合物的利用效率
隱藏在豆類中的蛋白抑制劑，可以與胰蛋白(trypsin inhibitor)或抑凝乳蛋白結合，
抑制水解蛋白的活性，使胃腸消化蛋白質的能力下降。另外，尚有γ 澱粉抑制劑，
使澱粉活性下降，影響人體對碳水化合物的利用效率。
2.造成鈣、鎂等礦物元素吸收下降
植酸(phytic acid)，是由肌酸與磷組成，是一種有機酸，在所有種子中都存在，豆 類中含量最高。它既可與豆類本身所含的鈣、鎂結合，生成不為人體吸收的植酸 鈣鎂鹽類，又可在腸道中與其他食物中的鈣結合，變成不溶性的植酸鈣，導致鈣、
鎂等礦物元素的吸收率下降。故長期偏食豆類是會導致體內鈣缺乏的可能性。
3.脹氣
豆類中含有產氣化合物，因此一旦吃得過多會造成腸胃脹氣的不舒服的感覺，脹 氣是由不能被人體消化吸收的寡糖,如水酥四糖(stachyose)及棉實糖(raffinose),在胃 腸中被微生物發酵產生之氣體。
4.刺激腸胃道
豆類中所含的皂角素，會有降低表面張力的作用，食用後對消化道粘膜有強烈的 刺激性，會導致胃腸道紅腫、充血。如果可以延長煮沸的時間及進行發酵可以減 少或消除這些問題(王豐洲,1972;Wood, 1998)。
第五節 發酵豆類食品之營養與機能
所謂發酵，就是利用微生物分類對於食物進行加工處理，又稱為發酵食品。
在發酵過程中，微生物保留了原來食物中的一些活性成分，如多糖、膳食纖維、
生物類黃酮等對機體有益的物質，還能分解某些對人體不利的因子，如豆類中的 低聚糖、脹氣因子等。微生物新陳代謝時產生的不少代謝產物，多數有調節機體 生物功能的作用，能抑制體內有害物的產生(Wang et al., 2006)。
此外，發酵具有保存食物的效果，既可防止不良微生物腐敗，又能防止氧化 性品質劣變。我們不難發現，發酵食品不添加抗氧化劑也沒有油耗味，可能與抗 氧化成份有關，許多生大豆具有之營養阻害物質，經浸泡、清洗、蒸煮後可去除 大部分。發酵作用可分解大分子物質及營養阻害物質，能增加易消化性，增進生 物可利用率，進而提高營養價值;同時發酵作用也產生一些物質，有些使風味變好，
有些具有增進健康的效果。發酵物不僅易於消化吸收，還可消除自由基，抗老化，
增強抵抗力(Frias et al., 2008; Reddy et al., 1982)。
豆類發酵食品例如:味增具有強抗氧化劑活性，味噌湯有降低胃癌死亡率之效 果(Ebine, 1986)。豆腐乳具有高蛋白質及高鈣，天貝具有抗氧化活性，發酵後產生 抗菌物質，能抑制某些革蘭氏陽性菌(Winarno & Reddy, 1986)。發酵使豆奶減少豆 臭味及引起脹氣的碳水化合物，並增加必須胺基酸。納豆(natto)是發酵大豆食品中 機能性效果研發最完全的，納豆中的脂質能抵抗氧化腐敗，可能是在發酵過程中 產生的抗氧化物質的作用(Esaki, et al., 1990,Hattori, et al.1995)亦研究出納豆菌發酵 的大豆可保護不飽和脂肪酸和細胞免於氧化，其效果與維他命E 相當或更高。活 性氧自由基會危害健康，造成動脈硬化、老化、破壞DNA 及引起癌症;超氧歧化 脢(superoxide dismutase, SOD)，與延長壽命有關。納豆具有 SOD 及過氧化氫脢
(caltase)能消除自由基,與納豆的健康機能性很有關。目前納豆受人矚目的效能還有 溶解血栓，預防骨質疏鬆症，強抗菌性及抗氧化作用。
第六節 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
又稱啤酒酵母、麵包酵母。自古以來，酵母菌是用途最廣泛的真菌，人類經 常利用它的發酵作用來製造各種發麵食品與醇酒。釀酒酵母的分類是屬於真菌子 囊菌群(Division Ascomycota)半子囊菌綱(Class Hemiascomycetes)內孢黴目(Order Endomycetales) 酵母科(Family Saccharomycetaceas) 酵母屬(Genus
Saccharomyces)。其細胞為球形或卵型，直徑為 5–10 μm，生活史可分為:(1)單倍體:
以出芽方式產生個體(2)二倍體:通過簡單的有絲分裂繁殖，但在外界條件不佳時能 夠進入減數分裂，生成一系列單倍體的孢子。單倍體可以交配，重新形成二倍體。
酵母有兩種交配類型，稱作a 和 α，是一種原始的性別分化，因此很有研究價值，
由於是最簡單的真核生物，所以也被運用在分子生物學和細胞生物學研究的模式 生物。
β-聚醣(β-glucans)
β-聚醣為多醣體，是構成釀酒酵母細胞壁的主要成分。除此之外，也可以來自真菌 像是:靈芝、特定的致病菌以及穀類植物像是:燕麥、大麥等，β-聚醣是 β(1→3), β(1→6)的異型聚合體，會依照不同的來源而有不同的化學結構，主要是以 β(1→3) 的六碳糖為骨幹，相隔不同數目的β(1→3)六碳糖接有 β(1→6)六碳糖的側鍊，例如:
在真菌則是β(1→3)的六碳糖接上短的 β(1→6)六碳糖的側鍊，在酵母菌則是 β(1→3) 的六碳糖接上長的β(1→6)六碳糖的側鍊。(Volman et al., 2008)
β-聚醣的免疫調節
β-聚醣是真菌及酵母菌細胞壁的主要成分，能被先天型的免疫性統辨認，像是分子 型態辨識受器(pattern recognition receptor, PRRs)或是補體(complement)系統，進一 步引發免疫反應。也由於來源不同，有不同的化學鍵結，產生多種水溶性、分子 量、帶電量等特性，進一步去刺激抗原呈獻細胞(APC)誘導出不同表面受體集合的 免疫細胞分化(Volman et al., 2008)，有些加強免疫反應，有的則能活化 T 細胞分化 為Th1 免疫反應，以避免 IgE 所引起的過敏反應(Saito et al., 2003)。同時研究也指 出釀酒酵母細胞壁上的β-聚醣主要為 zymosan，可以刺激巨噬細胞(macrophages) 分泌細胞激素TNF-α(Brown et al., 2003)、IL-2、IL-10 以及 IL-12 來引發進一步的 免疫反應(Du et al., 2006)。
In vitro studies
研究指出β-聚醣在體外的實驗中證實，可以增強巨噬細胞的活性、活化抗菌的能 力、以及幫助單核球與嗜中性球的活化(Tzianabos, 2000; Williams, 1997; Zekovic et al., 2005)。同時，也可以藉由增加發炎前趨物、抗氧化物質以及一些化學機素來達 到促進免疫反應的功效(Adachi et al., 1994; Olson et al., 1996; Young et al., 2001)。除 了對巨噬細胞以及嗜中性球的影響外，在靈芝的β-聚醣外研究中發現，β-聚醣可 以去影響樹突細胞(dendritic cells)誘導 Th1 免疫反應的細胞激素的產生(Lin et al., 2006)。
In vivo studies
在老鼠實驗中，餵食來自於靈芝的β-聚醣與 Sclerotinia sclerotiorum glucan(SSG)，
結果顯示，測試老鼠的脾臟細胞發現由ovalbumin 所誘導產生的 Th1 免疫反應的細 胞激素IFN-r 是顯示上升的，然而與 Th2 免疫反應相關的細胞激素 IL-4 與 IL-5 則 是呈現下降的(Lin et al., 2006; Saito et al., 2003; Suzuki et al., 2001)。除此之外，
Suzuki et al 也證實測試餵食 Sclerotinia sclerotiorum glucan(SSG)的老鼠脾臟細胞，
可以看到Th1 相關的細胞激素 IgG2a 的分泌顯著上升，而 Th2 免疫反應相關的 IgG1 則是顯著下降，這些文獻都支持了β-聚醣可以誘導 Th1 特異性的免疫反應，進一 步去調節與Th2 之間的免疫平衡的反應。
第七節 過敏簡介
過敏是指身體對應該無害的外來蛋白質(過敏原)，例如:灰塵、花粉、塵螨，產 生免應反應過度的結果。會過敏的人主要是有異位性體質，與遺傳(基因)有關，使 得體內的免疫系統傾向Th2 的反應並且容易產生免疫球蛋白 E(IgE)抗體，去抵抗 過敏原。過敏原通常是透過呼吸道、肺、皮膚、和腸道等進入人體，當身體第一 次接觸到過敏原並不會產生過敏反應，但之後再次接觸時就會產生發炎、腫脹、
發紅、發癢、以及水質(例如流淚)的分泌物增加等過敏反應。
當過量 IgE 刺激化學物質釋放，造成微血管擴張、平滑肌收縮，引發皮膚、
呼吸道、腸胃等不適。由IgE 引起的過度免疫反應稱為第一型過敏，異位性皮膚 炎、氣喘、過敏性鼻炎都是第一型過敏的臨床症狀。(康健雜誌,過敏專刊,2009)
第八節 異位性皮膚炎(atopic dermatitis)
又稱為異位性溼疹（atopic eczema）是一種慢性反覆性的皮膚疾病(Barnetson and Rogers, 2002)，此種疾病在嬰幼兒、兒童、青少年及成人都會發生，主要發病 期為五歲以下的兒童，研究顯示:大約有50%的病患是在一歲以前發病，另有30%
的病患在1~5歲間發病，有將近80%的異位性皮膚炎患者會在後來出現過敏性鼻炎 或氣喘(Spergel and Paller, 2003)(朱家瑜, 2007)。根據統計，在開發中國家約有15-20
%的兒童會有異位性皮膚炎的困擾，且發生率還在逐年升高(Williams, 2002)。根據
衛生署國民健康局委託台大公衛學院所做「台灣出生世代研究」嬰幼兒異位性皮 膚炎盛行率已從1995年的1%，大幅攀升到2004年的6.7%。據估計，全台目前約有 300萬人飽受異位性皮膚炎之苦(康健雜誌,過敏專刊,2009)。目前認為異位性皮膚炎 的致病機轉相當複雜，包括基因上具有敏感性、免疫功能的失調、週遭環境的影 響、生化代謝上的異常與皮膚障壁功能的缺陷等(Fartasch, 1997; Leung and Bieber, 2003; Pastore et al., 1997; Trautmann et al., 2000) (Geha, 2003; Howell et al., 2004;
Leung and Bieber, 2003; Novak et al., 2003)。
基因的異常
研究指出與異位性皮膚炎發病有關的染色體位置包括:1q21、3q21、5q31-33、
16q12、17q11等等。5q31-33區域內包含許多Th2細胞相關之細胞激素的基因，像 是:介白素(interleukin;IL)3、4、5、13，而目前已知異位性皮膚炎與Th2免疫反應有 密切的關係。另外1q21則與另一種皮膚角化疾病-乾癬有關的基因位置，由這個關 聯性也暗示異位性皮膚炎可能也與皮膚本身的分化不正常相關(Forrest et al., 1999;
Leung and Bieber, 2003)(附圖五)。
免疫上的異常
大約在70%~80%異位性皮膚炎的患者血液中可測得E型免疫球蛋白(IgE)上升的情 形，同時也看到患者血中的嗜伊紅性血球數量的上升(Eosinophilia)。研究發現，異 位性皮膚炎的病人血液中具有較高比例的過敏原特異性T細胞，而這些T細胞主要 會分泌細胞激素IL-4、IL-5、IL-13，但只有分泌少量的丙型干擾素(interferon-γ)，
此一免疫功能上的異常會導致病人較容易產生IgE。此外這些細胞激素也會誘發 vascular cell adhesion molecule-1(VCAM-1)、E-selectin以及intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)表現增加，使得嗜伊紅性血球(Eosinophils)浸潤到皮膚發炎處 (Hanifin et al., 1996; Sampson, 2003; Spergel et al., 1998; Wakita et al., 1994)。
皮膚障壁功能的異常
許多研究發現，異位性皮膚炎的病患的皮膚障壁功能有顯著的異常，包含經皮水 分散失度transepidermal water loss(TEWL)明顯上升、與皮膚角質纖維相關的蛋白 filaggrin基因的突變、角質層含水量減少與皮膚天然油脂含量下降，這樣的現象即 使是在病患的正常皮膚也很顯著，因此可能不是因為皮膚發炎所造成的，而是先 天病患就有所缺失的結果。目前對於異位性皮膚炎的致病機轉被認為可以分為:(1) 由內而外(The inside-out):也就是因為患者體內免異體質異常而引發皮膚炎。(2)由外 而內(The outside-in):是由於患者先天的皮膚代謝與保護功能的異常，使得許多過敏 原極易經由皮膚吸收致敏，而引發免疫反應的結果(Boguniewicz and Leung, ; Morar et al., 2007; Nomura et al., 2007; Palmer et al., 2006)。
造成異位性皮膚炎發作或使病情惡化的危險因子以吸入性過敏原（inhalant allergens）、日常飲食及其他刺激物（irritants）佔大多數；此外如氣候、患者的精 神狀態及細菌感染也都算是危險因子之一(Chan and Hanifin, 1993; Geha, 2003;
Leung and Bieber, 2003; Novak et al., 2003)。異位性皮膚炎最主要的症狀為皮膚搔癢
（pruritus），同時經常伴隨紅斑（eryThema）及皮膚乾燥（skin dry）。皮膚搔癢 對於患者來說是一件非常痛苦的事，患者常因抓癢而造成皮膚破皮，進一步引起 細菌感染而造成更嚴重的傷害。如果病情控制的不盡理想，則病灶有可能會蔓延 全身，包括頭皮、身上、手掌、腳掌、都可受到侵犯，最後甚至演變成紅皮症，
也就是全身超過買分之九十的皮膚侵犯，使得患者與其他正常人的外表也有很大 的差異，對患者的心理及日常社交生活也會造成非常大的影響及困擾(RoThe and Grant-Kels, 1996) (附圖一)。
目前為止異位性皮膚炎仍然沒有根治的方法，因此治療的目的主要著重在「控 制病情」而不是「治癒」。異位性皮膚炎的主要治療目標為降低皮膚發炎程度、
避免接觸危險因子以及緩解患者皮膚搔癢和乾燥狀態。治療方法主要可分為藥物 及非藥物療法，藥物療法又有局部性及全身性給藥的區別，要決定以何種方法治 療，取決於患者症狀發作時的速度與嚴重程度而定。
第九節 金黃色葡萄球菌與異位性皮膚炎的關係
研究指出皮膚上的細菌，尤其是金黃色葡萄球菌，可能與異位性皮膚炎的發 生扮演一個相當重要的關係。Leyden等人在1974年發表異位性皮膚炎病患皮膚上 金黃色葡萄球菌菌落數之定量研究，發現金黃色葡萄球菌可以在超過90%異位性皮 膚炎病患病灶處分離出來，即使在病患的外觀正常皮膚處，也有50%以上的檢出 率；然而，在正常人的皮膚只有5%可以檢測到金黃色葡萄球菌的存在，這些菌多 半只存在於正常人的鼻子或皮膚皺摺處。除此之外，研究也發現病灶處的菌落密 度與病灶的嚴重性有顯著的相關，皮膚炎的程度越厲害，檢測出金黃色葡萄球菌 的比例就越高(Leyden and Kligman, 1977; Leyden et al., 1974)(朱家瑜,2007)。
近年的研究發現金黃色葡萄球菌所製造的外毒素(exotoxins)可以做為超級抗 原(superantigens)，例如金黃色葡萄球菌腸毒素B (Staphylococcal enterotoxin B)，這 些超級抗原可以直接活化T細胞並放大T細胞之反應而不需要經由抗原的辨認的過 程。實驗也證實:直接將這些超級抗原的萃取物塗抹在正常的皮膚上可以引發皮膚 的發炎反應，超級抗原也可以提高T細胞之皮膚淋巴相關抗原cutaneous
lymphocyte-associated antigen(CLA; The homing receptor for The skin)的表現量，因 而促進了T細胞浸潤到皮膚的過程，這些超級抗原也可以做為過敏原，引發IgE的 相關反應，導致肥大細胞(mast cells)與嗜鹼性白血球的去顆粒作用，IgE的產生也 與異位性皮膚炎的嚴重度呈現高度的相關性(Breuer et al., 2000; Leung et al., 1993;
Strickland et al., 1999)(朱家瑜,2007)。
台大醫院研究發現，雖然金黃色葡萄球菌腸毒素B 在健康人及異位性皮膚炎 病人身上都會引起T 細胞的活化，但是兩者的 T 細胞被活化之後所製造的細胞激 素以及細胞凋亡的情形卻大不相同。金黃色葡萄球菌腸毒素B 在健康人的 T 細胞 引起Th1 細胞激素的製造，而在異位性皮膚炎病人的 T 細胞卻引起 Th2 細胞激素 的製造。而且，異位性皮膚炎病人的T 細胞比健康人的 T 細胞較少有金黃色葡萄 球菌腸毒素B 活化之後引起的細胞凋亡。此外，Th2 細胞激素如 IL-4 可抑制此種 細胞凋亡。這些結果暗示異位性皮膚炎皮膚內的T 細胞受到金黃色葡萄球菌超級 抗原活化後主要製造Th2 細胞激素，因而比較不容易死亡，因此發炎處被活化的 T 細胞無法被清除，皮膚的過敏性發炎反應也就不會終止，這可能是異位性皮膚炎 為何會多年不癒的主要原因之一(Cardona et al., 2006; Cho et al., 2001a; Cho et al., 2001b)(台大醫院小兒科衛教資訊，蔡紋如醫師，2005)。
第十節 口服耐受性與異位性皮膚炎的關係
人體的腸道免疫系統 原本具有黏膜耐受性的機能，能對經由腸道進入的蛋白 有耐受性而不會出現免疫反應，稱為口服耐受性(oral tolerance)。孩童在一歲以前 腸道的屏障還未成熟，所以蛋白抗原較容易通過而誘發出過敏反應；再加上小朋 友在一歲前免疫系統的口服耐受性機轉還沒有成熟，所以遇到外來的蛋白就會造 成過敏的症狀(Isolauri, 1997)。
在先前的文獻探討中提到，異位性皮膚炎好發生在五歲以下的兒童，有研究 推測，異位性皮膚炎的發生是與孩童的口服耐受性(oral tolerance)尚未建立健全所 導致，使得孩童對於外來物質容易產生敏感性的免疫反應，當孩童再次經由皮膚 接觸到相同的抗原，就會引起異位性皮膚炎的過敏症狀。
近年來許多研究都認為腸道內的免疫反應以及腸道內的菌叢，都與引起過敏
反應有高度的相關性，研究指出患有異位性皮膚炎的孩童，大多伴隨著食物過敏 的症狀，當吃到敏感性的食物，會使得皮膚上的過敏症狀變得更加嚴重(Sampson, 2003)。實驗的結果也可以看到，在異位性皮膚炎的患者腸道的菌叢相較於健康人 的腸道，是有較多的金黃色葡萄球菌的分佈，而明顯有較少的益生菌
Bifidobacterium 存在(Watanabe et al., 2003)，所以我們可以知道腸道的失衡可能在 引起異位性皮膚炎或是使得病情惡化中扮演重要的角色。
第十一節 研究目的與實驗設計
由文獻回顧中我們可以知道腸道免疫的重要性，其中特別是腸道內的微生 物生態系，稱為腸道菌相，扮演著主要的調節角色。文獻中提到益生菌與部分疾 病間的免疫調節存在有很大的相關性。此外，益生菌利用益生物質在腸道進行發 酵加以調節，以及從動物實驗中也看到餵食益生物質也的確對宿主的免疫調節有 所影響。
文獻中指出，食用豆類具有防癌及增進健康的效果。其中特別是大豆蛋白質 可以降低膽固醇、預防動脈硬化、預防高血壓、預防肥胖、增加免疫力、預防腦 中風、降血糖等 (青山敏明,1999)。除此之外，利用發酵作用可分解大分子物質及 營養阻害物質,能增加易消化性,增進生物可利用率,進而提高營養價值;同時發酵作 用也產生一些物質,有些使風味變好,有些具有增進健康的效果.發酵物不僅易於消 化,吸收,還可消除自由基,抗老化,增強抵抗力(Frias et al., 2008; Reddy et al., 1982)。
此外，在韓國的一種傳統的豆類發酵食品Chungkukjang 研究顯示，食用後對 於過敏反應是有益的，特別像是氣喘(asThma)和異位性皮膚炎(atopic dermatitis) (Choi et al., 2008)。本實驗主要的研究目的:是想去探討酵母菌(Saccharomyces
cerevisiae)以及利用酵母菌進行豆類發酵後的產物對 實 驗 性 異 位 性 皮 膚 炎 老 鼠 模 式 的 免 疫 調 節 作 用 。
在實驗設計的部份，首先要建立異位性皮膚炎的老鼠動物模式來進行實驗(圖 一)(Spergel et al., 1998)，除了已有文獻的佐證外，另一方面，利用異位性皮膚炎的 老鼠動物模式可以很直接的在外觀上進行觀測，對於初步探討豆類發酵產物在過 敏反應方面的調節是很有幫助的。在實驗的過程中老鼠以插管餵食的方式，持續 餵食豆類發酵產物(Saccharomyces cerevisiae Legume fermented product)，簡稱 SCLFP。
在實驗的進行過程中，除了要注意外觀皮膚的變化，也要抽血來偵測血清中 抗體的變化，另外也定期量測老鼠的體重變化確定豆類發酵產物的安全性。最後，
將老鼠犧牲後取血清、脾臟、腸繫膜淋巴結、浸潤淋巴結來進行免疫調節的偵測。
第二章 實驗材料與方法
第一節 實驗動物小鼠
購自台大醫學院繁殖組之 4-5 週 BALA/C 雌鼠，於代養單位飼養在溫度 20-22 度的代養環境中;設定夜晚及白日各 12 小時，飼料與飲水供小鼠自由取食。
第二節 建立異位性皮膚炎老鼠動物模式(Atopic dermatitis model) 主要是參照王莉芳醫師實驗室進行老鼠貼膚致敏(Epicutaneous
sensitization )，以及參考文獻(Spergel et al., 1998)的方式。所使用的為 BALB/C 雌
性老鼠(n=6~10)，在開始餵食後一周進行(老鼠八周大)，利用雞卵蛋白 Ovalbumin (OVA)用量:100mg/ml、20μl/patch;加於貼布膠帶(finn chambers)上，將老鼠背部剃 毛後，直接黏附於剃毛後老鼠的背部皮膚，並且利用止血繃帶加以固定。以每天 換藥的方式，連續五天的貼皮致敏，之後須休息兩個禮拜，為一個循環，必須進 行三個循環(圖一)。
第三節 豆類發酵產物的製備
實驗中所使用的豆類發酵產物(Saccharomyces cerevisiae Legume fermented product)主要是由廠商所提供。主要的成分含有大豆、黑豆以及紅豆，其大概的製 備的流程如下:
(1) 分別將不同的豆類潤濕及浸泡。
(2)泡軟後研磨成液狀，並以酵母菌 Saccharomyces cerevisiae 進行 150 小時的發酵 作用。
(3)最後以高溫乾燥，並以一定比例混合後，製裝於膠囊中即完成。
第四節 熱致死酵母菌(Saccharomyces cerevisiae) 的製備
參考市售酵母菌豆類發酵產物的製造過程，將豆類浸潤研磨後以酵母菌共同 發酵150 小時後加熱至 100°C 持續 30 分鐘，其後加以乾燥。製備只含酵母菌的餵 食劑時，以含有10 克酵母菌抽取物(yeast extrat)與 20 克細菌白腖(Bacto peptone) 以及20 克葡萄糖(glucose)的一公升培養液，接種酵母菌培養 24 小時至 600nm 吸 光值約為1.4~1.5。將培養後的酵母菌加以高速離心後倒上清，利用二次水混合洗 去培養液，再次高速離心後加二次水型成懸浮液，以滾水進行隔水加熱30 分鐘，
過程中不斷攪拌。待其懸浮液冷卻後，以每1.5ml 離心管分裝 1ml 懸浮液進行真空 乾燥，儲存於4°C 備用，餵食前才稱重並復水。
第五節 老鼠食道插管餵食
依照所設計的不同實驗組別分別餵食二次水、豆類發酵產物、酵母菌
Saccharomyces cerevisiae，以餵食管強迫定量餵食，從老鼠七周大開始餵食，每週 餵食三次，豆類發酵產物、酵母菌製備為粉末且溶於二次水中，餵食濃度為 150mg/ml，0.2ml/隻，餵食二次水的量為 0.2ml/隻。
第六節 異位性皮膚炎之誘導期實驗設計
使用 5-8 週齡的 BALB/c 小鼠，每組有 5 隻老鼠。分組如下:
(a) Negative 組: 貼膚致敏的藥劑為 PBS，沒有進行餵食。
(b) Positive 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA，沒有進行餵食。
(c) SCLFP 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA，進行豆類發酵產物的餵食。
(d) Yeast 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA，進行酵母菌的餵食。
(e) H2O 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA，進行二次水的餵食。
從6 周大開始進行餵食，每週餵食三次，餵食的動作會一直持續到老鼠犧牲時，
在餵食一個禮拜後，開始進行連續五天的貼皮致敏，老鼠在致敏後一星期犧牲(圖 二)。
藥劑的用量:
(a) PBS:20μl/patch。
(b) OVA:100mg/ml，20μl/patch。
第七節 異位性皮膚炎之作用期實驗設計
使用 5-8 週齡的 BALB/c 小鼠，每組有 6-10 隻老鼠。分組如下:
(a) Negative 組: 貼膚致敏的藥劑為 PBS，沒有進行餵食。
(b) Positive 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA，沒有進行餵食。
(c) SCLFP 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA，進行豆類發酵產物的餵食。
(d) Yeast 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA，進行酵母菌的餵食。
(e) H2O 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA，進行二次水的餵食。
從6 周大開始進行餵食，每週餵食三次，餵食的動作會一直持續到老鼠犧牲時，
在餵食一個禮拜後，開始進行連續五天的貼皮致敏，之後須休息兩個禮拜，為一 個循環，必須進行三個循環，老鼠在最後一次貼皮致敏後一星期犧牲(圖五)。
藥劑的用量:
(a) PBS:20μl/patch。
(b) OVA:100mg/ml，20μl/patch。
第八節 作用期的異位性皮膚炎老鼠模式加上金黃色葡萄球菌腸毒素 B (Staphylococcal enterotoxin B)實驗設計
使用 5-8 週齡的 BALB/c 小鼠，每組有 6-10 隻老鼠。分組如下:
(a) Negative 組: 貼膚致敏的藥劑為 PBS+SEB，沒有進行餵食。
(b) SCLFP 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA+SEB，進行豆類發酵產物的餵食。
(c) H2O 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA+SEB，進行二次水的餵食。
從6 周大開始進行餵食，每週餵食三次，餵食的動作會一直持續到老鼠犧牲時，
在餵食一個禮拜後，開始進行連續五天的貼皮致敏，之後須休息兩個禮拜，為一 個循環，必須進行三個循環，老鼠在最後一次貼皮致敏後一星期犧牲。(附圖二) 藥劑的用量:
(a) PBS:20μl/patch。
(b) OVA:100mg/ml，20μl/patch。
(c) SEB:400μg/ml，10μl/patch。
第九節 建立口服耐受性(oral tolerance)對異位性皮膚炎之作用期實驗 設計
參考文獻(Chehade and Mayer, 2005; Mayer and Shao, 2004; Mucida et al., 2005) 採用每天餵食，以低劑量(Low dose)的方式進行。(附圖三)
(A) SCLFP 組:SCLFP:90mg/ml，200μl/mice。
(B) TOL 組:OVA:25mg/ml，200μl/mice。
(C) SCLFP+TOL 組:SCLFP: 90mg/ml，OVA:25mg/ml，200μl/mice。
使用 5-8 週齡的 BALB/c 小鼠，每組有 6-10 隻老鼠。分組如下:
(a) Negative 組: 貼膚致敏的藥劑為 PBS，沒有進行餵食。
(b) Positive 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA，沒有進行餵食。
(c) SCLFP 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA，進行豆類發酵產物的餵食。
(d) TOL 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA，進行 OVA 的餵食。
(e) SCLFP+TOL 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA，進行豆類發酵產物加上 OVA 的餵 食。
從6 周大開始進行餵食，餵食的動作會一直持續到老鼠犧牲時，在餵食一個禮拜 後，開始進行連續五天的貼皮致敏，之後須休息兩個禮拜，為一個循環，必須進 行三個循環，老鼠在最後一次貼皮致敏後一星期犧牲(圖十六)。
藥劑的用量:
(a) PBS:20μl/patch。
(b) OVA:100mg/ml，20μl/patch。
第十節 老鼠血清特異性抗體(specific antibody)的偵測
利用眼窩採血的方式取血，之後以7500 r.p.m. 10 min 進行離心，取血清。偵 測血清中抗OVA 之特異性抗體 IgE、IgG1、IgA、IgG2a 的表現。
(1)參照ELISA套組(BeThyl; Laboratory, Montgomery, Texas, USA)說明書。以 coating buffer (0.05 M carbonate-bicarbonate, pH 9.6)稀釋OVA，最終濃度為 20μg/ml ， 各 取100 μl/well 加入96孔 微 定 量 盤(96-well plate, Nunc, Roskild, Denmark)中，置於4℃作用隔夜。
(2)隔天以一倍PBST (PBS buffer, 0.05 % Tween 20)清洗三次，以除去未結合之蛋白 質，再加入200 μl/well blocking buffer (50 mM Tris, 0.14 M NaCl, 1 % BSA, pH 8.0)，室溫作用2個小時，以阻隔非特異性之結合位置，再以一倍PBST清洗三 次後，加入100 μl/well以sample diluent (50 mM Tris, 0.14 M NaCl, 1 % BSA, 0.05
% Tween 20, pH 8.0)稀釋過的檢體，置於4℃作用隔夜。
(3)隔天以一倍PBST清洗三次後，加入100 μl/well以sample diluent 1：10000至 1:50000稀釋之HRP conjugated detect antibody，於室溫下作用2個小時，接著再 以一倍PBST清洗三次後，加入100 μl/well TMB呈色劑(Clinical)，避光靜置10~20 分鐘呈色，以100 μl/well 2 M H
2SO
4終止反應後，在波長450 nm下判讀吸光值。
第十一節 老鼠脾臟(Spleen)、腸繫膜淋巴結(Mesenteric lymph node)、
浸潤淋巴結(Draing lymph node)細胞培養及刺激的方法
細胞培養
(1)在老鼠犧牲時取脾臟、腸繫膜淋巴結以及浸潤淋巴結，將取出的脾臟放入裝有 10ml 之一倍 HBSS medium 10 公分培養皿中，將腸繫膜淋巴結取出後放入裝有 0.5ml cRPMI medium 的 24 孔盤中，將浸潤淋巴結取出後放入裝有 2 ml cRPMI medium 的 6 孔盤中，藉由將淋巴結移至加有新鮮 cRPMI 的圓孔洗去表面血液。
(2)以兩片滅菌後的磨砂玻片進行脾臟的研磨，而以滅菌後針筒的尾端進行腸繫膜 淋巴結的研磨，利用滅菌後針筒的尾端壓出浸潤淋巴結的細胞再以兩片滅菌後 的磨砂玻片加以研磨。
(3)將細胞磨出後，以鑷子將茶包袋以漏斗樣方式置於15 mL 離心管管口上，以 pipet 將 tissue cell mixure sup.吸起，緩慢滴入茶包袋中，使 sup.過濾並流入 15 mL 離心管中，加以濾去大塊組織。
(4)離心，1500 rpm，5 mim，室溫下，stop wiThout brakes。
(5)去除上清液(pellet 為紅色加白色)，輕拍打散細胞後，在脾臟的部分加入 10 ml 冰的含8.3% NH4Cl 及 1% KHCO3 之紅血球分解緩衝液(RBC lysis buffer); 腸 繫膜淋巴結不需加紅血球分解緩衝液，而浸潤淋巴結則加2ml 紅血球分解緩衝 液。
(6)離心，1500 rpm，5 mim，室溫下，stop wiThout brakes。
(7)去除上清液(pellet 為白色)，輕拍打散細胞，在加入 1ml 含有 10%胎牛血清(fetal calf serum,FCS)，1%HEPES，1%L-glutamine，1% Penicillin/Streptomycin 之 cRPMI 1640 細胞培養液(complete RPMI, cRPMI)。
(8)將打散後的細胞懸浮於 cRPMI 中，混合均勻，並取少許細胞液計算細胞數目。
(9)於 96 well culture plate 中種入 1x106個細胞/well；多餘之細胞則丟棄不使用。
刺激的方法
(1) 在脾臟、腸繫膜淋巴結的部分，將同一隻老鼠的細胞分成三個刺激條件，並且 做三重覆的處理，分別是:
(a)控制組:每個 well 種入細胞後不做任何處理。
(b)OVA 組:每個 well 加入濃度為 50ug/ml 的 OVA 進行刺激。
(c)Concanavalin A (ConA; Sigma, St.Louis, MO.T 細胞分裂素)組:當作 proliferation 的 positive control，每個 well 加入濃度為 2ug/ml。
(2) 在浸潤淋巴結的部分則將同組老鼠的細胞放在一起，以組為單位同樣做三個條 件的刺激，且做三至五個重覆的處理，條件如上述。
(3) 培養於 37°C，5% CO2 之細胞培養箱。培養48 小時後，每孔收取 0.15ml 細胞 培養液，用於細胞激素的測定。
第十二節 細胞增生(cell proliferation)的偵測
參考 Humen et al.發表的實驗方法。(Humen et al., 2005)
(1)在培養48 小時後，每孔收取 0.15ml 細胞培養液，用於細胞激素的測定。
同時加回0.15ml 含有 isotopes:[meThyl-3H] Thymidine (PerkinElmer, Boston, Massachusetts, USA) 培養液，濃度為 1uci/well。在不同刺激的組別同樣加入如 上的刺激濃度(OVA 組: 加入濃度為 50ug/ml 的 OVA 進行刺激。ConA 組: 加 入濃度為2ug/ml)。
(2)一起培養16~22 小時後，使用細胞收集器(Unifilter harvester, PerkinElmer)將細 胞收至96 孔濾紙盤(unifilter-96 GF/C)，風乾兩天，盤底貼上膠膜(BackSeal)，
並加入25ul/well 閃爍液(Microscint-20, Packard, Meriden, Connecticut, USA)，貼 上封膜(TopSeal)後送入計數儀器(TopCount, PerkinElmer)進行放射記數。
第十三節 細胞激素(cytokine)的偵測
(1)參照ELISA套組(DuoSet ELISA; R&D Systems, Minneapolis, Minneaota, USA)說明書。將cytokine capture antibody以一倍的PBS(PH7.2)加以稀釋 後 ， 各 取100 μl/well 加 入 96 孔 微 定 量 盤 (96-well plate, Nunc, Roskild, Denmark)中，置於4℃作用隔夜。
(2)隔天以一倍PBST (PBS buffer, 0.05 % Tween 20)清洗三次，以除去未結合之 蛋白質，再加入200 μl/well reagent diluent (1%BSA於一倍的PBS中)，於室 溫下作用兩個小時，以阻隔非特異性之結合位置，再以一倍PBST (PBS buffer, 0.05 % Tween 20)清洗三次後，加入以reagent diluent 連續稀釋兩倍 的標準品，以及稀釋過的細胞培養液(100ul/well)，置於4℃作用隔夜。
(3)隔天以一倍PBST (PBS buffer, 0.05 % Tween 20)清洗三次後，加入以一倍的 PBS稀釋後的抗小鼠細胞激素的單株抗體(detection antibody)，於室溫下作 用兩個小時，以一倍PBST (PBS buffer, 0.05 % Tween 20)清洗三次後，加入 稀釋200倍之strepavidin-HRP，室溫下避光作用20分鐘。接著以一倍PBST
(PBS buffer, 0.05 % Tween 20)清洗三次後，加入四甲基聯苯胺(TMB ，3,3 5,5- tetrameThyl benzidine)呈色(100ul/well)，避光靜置，直到呈現藍色後，
視顏色深淺情況加入2 M H
2SO
4終止反應，在波長450 nm下判讀吸光值，
再扣除波長550nm所測的背景值。以標準品濃度做標準曲線，將各樣品吸 光值代入標準曲線計算各抗體濃度。
第十四節 組織化學染色(H&E stain)
在老鼠犧牲時取下皮膚，以福馬林浸泡 4 個小時以上，利用 PBS 加以清洗組 織後，以石蠟進行包埋，之後將組織切成4-5μm 大小的標本。
(1) 加標本浸入 xyline 中，進行脫蠟的動作。
(2) 在依次浸入 100-70%的酒精中，進行回水的動作。
(3) 浸入 Haematoxylin(紫色)中約 90 秒，用流水清洗後，在浸入胺水中，在以清水 清洗後，放入Eosin(紅色)中約 40 秒。
(4) 最後放入 100%酒精中，加以洗乾淨以及退色，等組織風乾後，進行封片。
第十五節 組織化學染色表皮厚度加以量化
在 200 倍視野的顯微鏡下利用尺標刻度來進行表皮增厚的量化，分別是以: (輕 度) Mild :10μm~20μm，(中度) Moderate :20μm~50μm，(重度)Severe : > 50μm 來做 為皮膚發炎程度的區分。
第十六節 組織化學染色發炎細胞 Eosinphils 的計數
利用量測各組皮膚上發炎細胞 Eosinophils 浸潤來評估老鼠皮膚發炎的程度。
主要是計數四個顯微鏡下400 倍的視野中 Eosinophils 的細胞個數後再平均所顯示 的結果。
第十七節 統計分析
本研究中實驗結果皆以平均值(Mean)與標準差(Standard Deviation)表示，利用 Student’s t-test 比較實驗結果中各項數據之間的差異，並且以 P<0.05 作為達到統計 學上的顯著差異的界定標準。*代表統計學上 P 值<0.05，**代表 P 值<0.001，***
代表統計學上P 值<0.0001。
第三章 實驗結果
第一節 偵測誘導期的浸潤淋巴結以 OVA 刺激後分泌細胞激素的情形 在誘導期的異位性皮膚炎動物模式中，為了去觀察餵食豆類發酵產物(SCLFP) 後浸潤淋巴結的免疫反應，我們利用Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 的方式，偵測誘導期的浸潤淋巴結以雞卵蛋白OVA 刺激 48hr 後分泌細胞激素的 情形。此外，在實驗中多增加了一個以酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)進行餵食 的組別以當作免疫調節的positive control。由於文獻中指出酵母菌的細胞壁中的主 要成分-beta-glucan 具有免疫調節的功能(Suzuki et al., 2001; Volman et al., 2008)。在 實驗中沒有以OVA 致敏，是利用 PBS 來進行貼膚不會引起免疫反應的組別來當 作negative control。
我們觀察與Th1 相關的細胞激素 IFN-γ 以及與 Th2 相關的細胞激素 IL-13、IL-4 的表現，同時也偵測了抗發炎細胞激素IL-10，想要去比較在餵食豆類發酵產物後 Th1 與 Th2 的免疫反應是否有差異。實驗結果顯示，餵食豆類發酵產物(SCLFP)老 鼠的浸潤淋巴結細胞 in vitro 以 OVA 的刺激 48hr 後，細胞分泌細胞激素 IFN-γ 的量相對於餵食酵母菌與餵食二次水的組別是有顯著上升的，同時，我們也看到 餵食酵母菌的組別細胞分泌細胞激素IFN-γ的量，相對於餵食二次水的組別也是 有顯著上升的(圖三(A))。
在細胞分泌細胞激素 IL-13 的部分，結果顯示，餵食酵母菌的組別細胞分泌細 胞激素IL-13，相對於餵食豆類發酵產物的組別與餵食二次水的組別，量是有顯著 下降的(圖三(B))。在細胞分泌細胞激素 IL-4 的部分，結果顯示，餵食豆類發酵產 物的組別與餵食酵母菌的組別細胞分泌細胞激素IL-4，相對於餵食二次水的組別，
量是有下降的趨勢，但沒有達到顯著差異(圖三(C))。在細胞分泌細胞激素 IL-10 的 部分，結果顯示，餵食豆類發酵產物的組別細胞分泌細胞激素IL-10，相對於餵食 酵母菌的組別及餵食二次水的組別，量是有顯著上升的(圖三(D))。
在偵測誘導期的浸潤淋巴結以 OVA 刺激後分泌細胞激素的結果中，我們可以 看到餵食豆類發酵產物後老鼠浸潤淋巴結的免疫反應，細胞分泌細胞激素會傾向 於Th1 的反應，以及顯著提升抗發炎細胞激素 IL-10 的量。另外，在餵食酵母菌的 組別中，我們可以看到老鼠浸潤淋巴結的免疫反應也是傾向於Th1 的反應，以及 可以看到Th2 相關的細胞激素 IL-13 的顯著下降，但對於分泌抗發炎激素 IL-10 沒 有影響。
第二節 偵測誘導期的浸潤淋巴結以 OVA 刺激後細胞增生的情形 為了更進一步探討餵食豆類發酵產物後，在異位性皮膚炎誘導期的浸潤淋巴 結對於OVA的刺激所產生的免疫反應，我們利用isotopes[H3] Thymidine
Incorporation偵測浸潤淋巴結細胞以OVA刺激後細胞增生的情形。首先，將老鼠犧 牲後取出浸潤淋巴結，以有無加OVA兩個條件進行細胞培養48hr後，加入isotopes [H3]Thymidine Incorporation培養16hr，以計數儀器進行放射線計數。圖示以有加 OVA的細胞增生結果cpm值除以沒有以OVA培養的組別，所得到增生的倍數，
stimulation indexes=[H3]Thymidine Incorporation (cpm) / unstimulated cells。結果顯 示，餵食豆類發酵產物老鼠的浸潤淋巴結細胞以in vitro OVA的刺激增生的結果，
相對於餵食酵母菌的組別及餵食二次水的組別，stimulation indexes是有顯著被抑制 的(圖四)。另外，在餵食酵母菌的組別，則可以看到老鼠的浸潤淋巴結細胞以in vitro
OVA的刺激增生，相對於餵食二次水的組別，stimulation indexes是有顯著上升的 (圖四) 。
在偵測誘導期的浸潤淋巴結以OVA刺激後細胞增生的結果中，我們可以看到 餵食豆類發酵產物後老鼠浸潤淋巴結的免疫反應，對於OVA的刺激細胞增生是顯 著被抑制的，我們推測可能是由於餵食豆類發酵產物後，老鼠浸潤淋巴結細胞誘 導分泌抗發炎細胞激素IL-10，加以調控了細胞對於OVA刺激後增生的情形。同時 我們也看到餵食酵母菌的組別，對於OVA的刺激細胞增生是顯著上升的，我們推 測可能餵食酵母菌對於分泌抗發炎激素IL-10沒有影響(圖三(D))，所以也無法藉由 分泌IL-10加以調控了細胞對於OVA刺激後增生的情形。
第三節 偵測作用期的老鼠血清中抗 OVA 特異性抗體
在誘導期的異位性皮膚炎動物模式中，我們的確看到餵食豆類發酵產物後對 於老鼠浸潤淋巴結細胞的免疫調節會造成影響。進一步我們建立作用期的異位性 皮膚炎動物模式，加以探討所引起系統性的免疫反應。
為了觀察在餵食豆類發酵產物後血清中抗 OVA 特異性抗體的表現，首先將犧 牲後的老鼠血清利用Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)的方式，以血清 連續10 倍稀釋的方式來偵測 OD450 的值，並取 OD450 值為 1.0 以內的結果來進 行比較，OD450 的值越高表示在血清中所偵測的抗體越多，想要去比較在餵食豆 類發酵產物後Th1 與 Th2 的免疫反應是否有差異。實驗結果顯示，餵食豆類發酵 產物的組別，血清中產生抗OVA 特異性抗體 IgE，相對於餵食二次水的組別是有 顯著下降(圖六(A))。相反的，在血清中產生抗 OVA 特異性抗體 IgG2a，餵食豆類 發酵產物的組別相對於餵食二次水的組別是則是有顯著上升(圖六(B))。
在偵測作用期的老鼠血清中抗OVA特異性抗體的結果中，我們可以看到餵食 豆類發酵產物老鼠體內產生的抗OVA之特異性抗體與Th2相關的IgE的結果是顯著 下降，而與Th1相關的抗體IgG2a的表現是顯著上升。因此我們推測，餵食豆類發 酵產物在作用期異位性皮膚炎的老鼠動物模式中，可能可以藉由提升Th1細胞的免
疫調節而進一步降低Th2細胞引起的過敏反應。
第四節 作用期的異位性皮膚炎老鼠模式各組在外觀上的差異
除了探討作用期的異位性皮膚炎老鼠模式體內的免疫反應外，我們也可以藉 由觀測外觀上各組皮膚的差異來進行討論。結果顯示，在進行貼皮致敏三個循環 後，老鼠犧牲前的皮膚狀況。分組如下: (A)Negative 組: 貼膚致敏的藥劑為 PBS，
沒有進行餵食。(B)Positive 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA，沒有進行餵食。(C)SCLFP 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA，進行豆類發酵產物的餵食。(D)Yeast 組: 貼膚致敏的 藥劑為OVA，進行酵母菌的餵食。(E) H2O 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA，進行二 次水的餵食。箭頭所指為明顯的紅腫傷口(圖七)。
在外觀上的觀察，我們可以看到 Positive 的組別，在背部的皮膚出現明顯紅腫 發炎的情形，並伴隨著一些傷口，相反的Negative 的組別則沒有明顯的發炎情形。
然而，在餵食豆類發酵產物(SCLFP)、餵食酵母菌與餵食二次水的組別在外觀上，
都可以看到有紅腫發炎的情形，但難以利用肉眼加以分辨三組的嚴重程度。
第五節 偵測作用期的脾臟細胞及腸繫膜淋巴結細胞以 OVA 刺激後分 泌細胞激素的情形
在先前偵測老鼠血清的部分，我們看到了餵食豆類發酵產物老鼠體內的抗 OVA 之特異性抗體與 Th2 相關的抗體 IgE 的表現是顯著下降，而與 Th1 相關的抗 體IgG2a 的表現是顯著上升。接著我們利用 Enzyme-linked immunosorbent
assay(ELISA)的方式來偵測脾臟細胞及腸繫膜淋巴結細胞以 OVA 刺激 48hr 後分泌 細胞激素的情形。我們觀察與Th1 相關的細胞激素 IFN-r 以及與 Th2 相關的細胞 激素IL-4 的表現，同時也偵測了抗發炎細胞激素 IL-10，想要去比較在餵食豆類發 酵產物後Th1 與 Th2 的免疫反應是否有差異。實驗結果顯示，在偵測脾臟細胞的
部分，餵食豆類發酵產物老鼠 in vitro 以 OVA 的刺激 48hr 後，細胞分泌細胞激素 IFN-γ的量相對於餵食二次水的組別是有顯著上升的，同時，我們也看到餵食酵 母菌的組別細胞分泌細胞激素IFN-γ的量，相對於餵食二次水的組別也是有顯著 上升的(圖八(A))。
在脾臟細胞分泌細胞激素 IL-4 的部分，結果顯示，餵食酵母菌的組別細胞分 泌細胞激素IL-4，相對於餵食豆類發酵產物的組別與餵食二次水的組別，量是有 顯著下降(圖八(B))。在脾臟細胞分泌細胞激素 IL-10 的部分，結果顯示，餵食豆類 發酵產物的組別細胞分泌細胞激素IL-10，相對於餵食酵母菌的組別及餵食二次水 的組別，量是有顯著上升的(圖八(C))。
在偵測腸繫膜淋巴結細胞的部分，餵食豆類發酵產物老鼠 in vitro 以 OVA 的 刺激48hr 後，細胞分泌細胞激素 IFN-γ的量相對於餵食二次水的組以及餵食酵母 菌的組別細胞分泌細胞激素IFN-γ的量，相對於餵食二次水的組別呈現有統計上 的差異，但沒有顯著差異(圖九(A))。在腸繫膜淋巴結細胞分泌細胞激素 IL-4、IL-10 的部分，結果顯示，有統計上的意義但皆沒有達到顯著差異(圖九(B)(C))。
在偵測作用期的脾臟細胞及腸繫膜淋巴結細胞以 OVA 刺激後分泌細胞激素的 結果中，我們可以看到在系統性的免疫反應上，不論是脾臟細胞或腸繫膜淋巴結 細胞在餵食豆類發酵產物後都傾向Th1 的免疫反應，並且顯著提升抗發炎細胞激 素IL-10 的量。結果與先前偵測老鼠血清的部分，Th1 相關的抗體 IgG2a 的表現是 顯著上升，以及偵測誘導期的浸潤淋巴結以OVA 刺激後分泌細胞激素的結果都是 呈現一致的。另外，在餵食酵母菌的組別中，我們可以看到老鼠在系統性的免疫 反應也是傾向於Th1 的反應，以及可以看到 Th2 相關的細胞激素 IL-4 在脾臟細胞 的顯著下降，有趣的是，在腸繫膜淋巴結細胞刺激分泌IL-4 則呈現顯著上升。同 樣的對於分泌抗發炎激素IL-10 沒有影響，與偵測誘導期的浸潤淋巴結以 OVA 刺 激後分泌細胞激素的結果是呈現一致的。
第六節 偵測作用期的脾臟細胞及腸繫膜淋巴結以 OVA 刺激後細胞增
生的情形
同樣的，為了更進一步探討餵食豆類發酵產物後，在異位性皮膚炎作用期的脾 臟細胞及腸繫膜淋巴結細胞對於OVA 的刺激所產生系統性的免疫反應，我們利用 isotopes[H3] Thymidine Incorporation 偵測脾臟細胞及腸繫膜淋巴結細胞以 OVA 刺 激後細胞增生的情形。首先，將老鼠犧牲後取出脾臟細胞及腸繫膜淋巴結，以有 無加OVA 兩個條件進行細胞培養 48hr 後，加入 isotopes [H3]Thymidine
Incorporation 培養 16hr，以記數儀器進行放射線計數。圖示以有加 OVA 的細胞增 生結果cpm 值除以沒有以 OVA 培養的組別，所得到增生的倍數，stimulation indexes= [H3] Thymidine Incorporation (cpm) / unstimulated cells。結果顯示，餵食豆 類發酵產物老鼠的脾臟細胞以 in vitro OVA 的刺激增生的結果，相對於餵食酵母菌 的組別stimulation indexes 是有顯著被抑制的，而相對於餵食二次水的組別，
stimulation indexes 也是呈現被抑制的情形，但沒有達到顯著差異(圖十(A))。然而，
在餵食豆類發酵產物老鼠的腸繫膜淋巴結細胞以 in vitro OVA 的刺激增生的結 果，我們可以看到相對於餵食酵母菌的組別及餵食二次水的組別，都沒有達到顯 著差異(圖十(B))。
第七節 作用期的異位性皮膚炎老鼠模式加上金黃色葡萄球菌腸毒素 B (Staphylococcal enterotoxin B) 各組在外觀上的差異
在先前的實驗中，比較皮膚外觀上的差異，餵食豆類發酵產物、餵食酵母菌 與餵食二次水的組別在外觀上，都可以看到有紅腫發炎的情形，但難以利用肉眼 加以分辨三組的嚴重程度(圖七)。為了增強免疫反應的差異，在藥劑的部分添加了 金黃色葡萄球菌腸毒素B (SEB)。研究指出:有 90%的異位性皮膚炎患者在皮膚損 傷的部位發現有金黃色葡萄球菌的聚集(Breuer K, et al.2000 Allergy)，同時也有文
獻指出，在這些聚集的金黃色葡萄球菌中，有65%會產生具有超級抗原特性的腸 毒素(Campbell DE, et al.1998 Arch Dis Child)，所以研究推測，這些聚集產生的具 有超級抗原特性的腸毒素，可能在異位性皮膚炎的皮膚上扮演促進發炎的角色 (Girolomoni G, et al. 2001 J Am Acad Dermatol ，Kyu Han Kim, et al. 2006 J Korean Med Sci)。
實驗進行貼皮致敏三個循環後，老鼠犧牲前的皮膚狀況，實驗的組別中，在 藥劑的部分都會添加SEB，其中利用 PBS 來進行貼膚沒有以 OVA 致敏的組別當 作negative control，以 OVA 致敏且餵水的組別當作 positive control。分組如下:
(A)Negative 組: 貼膚致敏的藥劑為 PBS+SEB，沒有進行餵食。(B) SCLFP 組: 貼 膚致敏的藥劑為OVA+SEB，進行豆類發酵產物的餵食。(C) H2O 組: 貼膚致敏的 藥劑為OVA+SEB，進行二次水的餵食。箭頭所指為明顯的紅腫傷口。(圖十一) 在外觀上的觀測，我們可以清楚的看到，在餵食二次水的組別老鼠皮膚有明顯 的紅腫發炎以及傷口的出現，同時掉毛的情形相對於Negative 的組別與餵食豆類 發酵產物的組別都更為明顯。而在Negative 的組別，我們可以看到也有出現紅腫 發炎的皮膚，推測是由於加了金黃色葡萄球菌腸毒素B (SEB)所以也造成輕微的免 疫反應。在餵食豆類發酵產物(SCLFP)的組別中，我們可以看到相對於餵食二次水 的組別，老鼠皮膚紅腫發炎、傷口的出現以及掉毛的情形，都有改善的現象。
第八節 作用期的異位性皮膚炎老鼠模式加上金黃色葡萄球菌腸毒素 B (Staphylococcal enterotoxin B) H&E stain 在各組皮膚上的差異
在外觀上我們已經看到在(A)Negative 組 (B) SCLFP 組 (C) H2O 組是有明顯差 異的(圖十一)。所以我們進一步利用以 Haematoxylin(紫色) & Eosin(紅色)進行皮膚 的組織染色，分組如下: (A) 100 倍視野下(E) 200 倍視野下 Normal 組: 為沒有做任 何處理的老鼠皮膚。(B) 100 倍視野下(F) 200 倍視野下 Negative 組: 貼膚致敏的藥 PBS+SEB，沒有進行餵食。(C) 100 倍視野下(G) 200 倍視野下 SCLFP 組: 貼
膚致敏的藥劑為OVA+SEB，進行豆類發酵產物的餵食。(D) 100 倍視野下(H) 200 倍視野下H2O 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA+SEB，進行二次水的餵食(圖十二)。
由 H&E stain 的結果我們可以看到，在餵食二次水的組別皮膚發炎的情形以及 表皮的增厚，相對於Negative 的組別與餵食豆類發酵產物的組別都是呈現明顯較 嚴重的免疫反應。我們也可以看到在餵食豆類發酵產物後，在老鼠皮膚的發炎反 應於表皮的增厚，相對於餵食二次水的皮膚狀況是有明顯的改善的。然而在 Negative 的組別，相對於 Normal 沒有做任何處理的老鼠皮膚，也可以看到表皮有 增厚的情形。各組在老鼠皮膚所顯示H&E stain 的結果，與我們在外觀上的觀測有 一致的情形(圖十一)。
第九節 作用期的異位性皮膚炎老鼠模式加上金黃色葡萄球菌腸毒素 B (Staphylococcal enterotoxin B) H&E stain 在各組皮膚上的差異加以量化
統計
在 H&E stain 的結果中我們看到各組的差異，接著利用量測表皮的厚度來加以 量化皮膚發炎的程度，分別是: (輕度) Mild :10μm~20μm，(中度)
Moderate :20μm~50μm，(重度)Severe : > 50μm(圖十二(A)(B)(C))。
每組各有五隻老鼠的染色結果，結果顯示，在 Negative 的組別有四隻是屬於 輕度增厚(Mild)，一隻屬於中度增厚(Moderate)。在餵食豆類發酵產物的組別有兩 隻是屬於輕度增厚(Mild)，兩隻是屬於中度增厚(Moderate)，一隻是屬於重度增厚 (Severe)。在餵食二次水的組別則可以看到有兩隻是屬於中度增厚(Moderate)，三隻 是屬於重度增厚(Severe)(圖十三)。
將各組皮膚上的差異加以量化統計的結果中，我們可以看到 Negative 的組別皮 膚表皮增厚傾向輕度的，餵食豆類發酵產物的組別則傾向輕度與中度，在餵食二 次水的組別則傾向表現中度與重度的結果。所以我們可以知道餵食豆類發酵產物
