建立口服耐受性(oral tolerance)對異位性皮膚炎之作用期實驗設計 19

參考文獻(Chehade and Mayer, 2005; Mayer and Shao, 2004; Mucida et al., 2005) 採用每天餵食，以低劑量(Low dose)的方式進行。(附圖三)

(A) SCLFP 組:SCLFP:90mg/ml，200μl/mice。

(B) TOL 組:OVA:25mg/ml，200μl/mice。

(C) SCLFP+TOL 組:SCLFP: 90mg/ml，OVA:25mg/ml，200μl/mice。

使用 5-8 週齡的 BALB/c 小鼠，每組有 6-10 隻老鼠。分組如下:

(a) Negative 組: 貼膚致敏的藥劑為 PBS，沒有進行餵食。

(b) Positive 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA，沒有進行餵食。

(c) SCLFP 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA，進行豆類發酵產物的餵食。

(d) TOL 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA，進行 OVA 的餵食。

(e) SCLFP+TOL 組: 貼膚致敏的藥劑為 OVA，進行豆類發酵產物加上 OVA 的餵 食。

從6 周大開始進行餵食，餵食的動作會一直持續到老鼠犧牲時，在餵食一個禮拜 後，開始進行連續五天的貼皮致敏，之後須休息兩個禮拜，為一個循環，必須進 行三個循環，老鼠在最後一次貼皮致敏後一星期犧牲(圖十六)。

藥劑的用量:

(a) PBS:20μl/patch。

(b) OVA:100mg/ml，20μl/patch。

第十節 老鼠血清特異性抗體(specific antibody)的偵測

利用眼窩採血的方式取血，之後以7500 r.p.m. 10 min 進行離心，取血清。偵 測血清中抗OVA 之特異性抗體 IgE、IgG1、IgA、IgG2a 的表現。

(1)參照ELISA套組(BeThyl; Laboratory, Montgomery, Texas, USA)說明書。以 coating buffer (0.05 M carbonate-bicarbonate, pH 9.6)稀釋OVA，最終濃度為 20μg/ml ， 各 取100 μl/well 加入96孔 微 定 量 盤(96-well plate, Nunc, Roskild, Denmark)中，置於4℃作用隔夜。

(2)隔天以一倍PBST (PBS buffer, 0.05 % Tween 20)清洗三次，以除去未結合之蛋白 質，再加入200 μl/well blocking buffer (50 mM Tris, 0.14 M NaCl, 1 % BSA, pH 8.0)，室溫作用2個小時，以阻隔非特異性之結合位置，再以一倍PBST清洗三 次後，加入100 μl/well以sample diluent (50 mM Tris, 0.14 M NaCl, 1 % BSA, 0.05

% Tween 20, pH 8.0)稀釋過的檢體，置於4℃作用隔夜。

(3)隔天以一倍PBST清洗三次後，加入100 μl/well以sample diluent 1：10000至 1:50000稀釋之HRP conjugated detect antibody，於室溫下作用2個小時，接著再 以一倍PBST清洗三次後，加入100 μl/well TMB呈色劑(Clinical)，避光靜置10~20 分鐘呈色，以100 μl/well 2 M H

2SO

4終止反應後，在波長450 nm下判讀吸光值。

第十一節 老鼠脾臟(Spleen)、腸繫膜淋巴結(Mesenteric lymph node)、

浸潤淋巴結(Draing lymph node)細胞培養及刺激的方法

細胞培養

(1)在老鼠犧牲時取脾臟、腸繫膜淋巴結以及浸潤淋巴結，將取出的脾臟放入裝有 10ml 之一倍 HBSS medium 10 公分培養皿中，將腸繫膜淋巴結取出後放入裝有 0.5ml cRPMI medium 的 24 孔盤中，將浸潤淋巴結取出後放入裝有 2 ml cRPMI medium 的 6 孔盤中，藉由將淋巴結移至加有新鮮 cRPMI 的圓孔洗去表面血液。

(2)以兩片滅菌後的磨砂玻片進行脾臟的研磨，而以滅菌後針筒的尾端進行腸繫膜 淋巴結的研磨，利用滅菌後針筒的尾端壓出浸潤淋巴結的細胞再以兩片滅菌後 的磨砂玻片加以研磨。

(3)將細胞磨出後，以鑷子將茶包袋以漏斗樣方式置於15 mL 離心管管口上，以 pipet 將 tissue cell mixure sup.吸起，緩慢滴入茶包袋中，使 sup.過濾並流入 15 mL 離心管中，加以濾去大塊組織。

(4)離心，1500 rpm，5 mim，室溫下，stop wiThout brakes。

(5)去除上清液(pellet 為紅色加白色)，輕拍打散細胞後，在脾臟的部分加入 10 ml 冰的含8.3% NH4Cl 及 1% KHCO3 之紅血球分解緩衝液(RBC lysis buffer); 腸 繫膜淋巴結不需加紅血球分解緩衝液，而浸潤淋巴結則加2ml 紅血球分解緩衝 液。

(6)離心，1500 rpm，5 mim，室溫下，stop wiThout brakes。

(7)去除上清液(pellet 為白色)，輕拍打散細胞，在加入 1ml 含有 10%胎牛血清(fetal calf serum,FCS)，1%HEPES，1%L-glutamine，1% Penicillin/Streptomycin 之 cRPMI 1640 細胞培養液(complete RPMI, cRPMI)。

(8)將打散後的細胞懸浮於 cRPMI 中，混合均勻，並取少許細胞液計算細胞數目。

(9)於 96 well culture plate 中種入 1x10⁶個細胞/well；多餘之細胞則丟棄不使用。

刺激的方法

(1) 在脾臟、腸繫膜淋巴結的部分，將同一隻老鼠的細胞分成三個刺激條件，並且 做三重覆的處理，分別是:

(a)控制組:每個 well 種入細胞後不做任何處理。

(b)OVA 組:每個 well 加入濃度為 50ug/ml 的 OVA 進行刺激。

(c)Concanavalin A (ConA; Sigma, St.Louis, MO.T 細胞分裂素)組:當作 proliferation 的 positive control，每個 well 加入濃度為 2ug/ml。

(2) 在浸潤淋巴結的部分則將同組老鼠的細胞放在一起，以組為單位同樣做三個條 件的刺激，且做三至五個重覆的處理，條件如上述。

(3) 培養於 37°C，5% CO2 之細胞培養箱。培養48 小時後，每孔收取 0.15ml 細胞 培養液，用於細胞激素的測定。

第十二節 細胞增生(cell proliferation)的偵測

參考 Humen et al.發表的實驗方法。(Humen et al., 2005)

(1)在培養48 小時後，每孔收取 0.15ml 細胞培養液，用於細胞激素的測定。

同時加回0.15ml 含有 isotopes:[meThyl-³H] Thymidine (PerkinElmer, Boston, Massachusetts, USA) 培養液，濃度為 1uci/well。在不同刺激的組別同樣加入如 上的刺激濃度(OVA 組: 加入濃度為 50ug/ml 的 OVA 進行刺激。ConA 組: 加 入濃度為2ug/ml)。

(2)一起培養16~22 小時後，使用細胞收集器(Unifilter harvester, PerkinElmer)將細 胞收至96 孔濾紙盤(unifilter-96 GF/C)，風乾兩天，盤底貼上膠膜(BackSeal)，

並加入25ul/well 閃爍液(Microscint-20, Packard, Meriden, Connecticut, USA)，貼 上封膜(TopSeal)後送入計數儀器(TopCount, PerkinElmer)進行放射記數。

第十三節 細胞激素(cytokine)的偵測

(1)參照ELISA套組(DuoSet ELISA; R&D Systems, Minneapolis, Minneaota, USA)說明書。將cytokine capture antibody以一倍的PBS(PH7.2)加以稀釋 後 ， 各 取100 μl/well 加 入 96 孔 微 定 量 盤 (96-well plate, Nunc, Roskild, Denmark)中，置於4℃作用隔夜。

(2)隔天以一倍PBST (PBS buffer, 0.05 % Tween 20)清洗三次，以除去未結合之 蛋白質，再加入200 μl/well reagent diluent (1%BSA於一倍的PBS中)，於室 溫下作用兩個小時，以阻隔非特異性之結合位置，再以一倍PBST (PBS buffer, 0.05 % Tween 20)清洗三次後，加入以reagent diluent 連續稀釋兩倍 的標準品，以及稀釋過的細胞培養液(100ul/well)，置於4℃作用隔夜。

(3)隔天以一倍PBST (PBS buffer, 0.05 % Tween 20)清洗三次後，加入以一倍的 PBS稀釋後的抗小鼠細胞激素的單株抗體(detection antibody)，於室溫下作 用兩個小時，以一倍PBST (PBS buffer, 0.05 % Tween 20)清洗三次後，加入 稀釋200倍之strepavidin-HRP，室溫下避光作用20分鐘。接著以一倍PBST

(PBS buffer, 0.05 % Tween 20)清洗三次後，加入四甲基聯苯胺(TMB ，3,3 5,5- tetrameThyl benzidine)呈色(100ul/well)，避光靜置，直到呈現藍色後，

視顏色深淺情況加入2 M H

2SO

4終止反應，在波長450 nm下判讀吸光值，

再扣除波長550nm所測的背景值。以標準品濃度做標準曲線，將各樣品吸 光值代入標準曲線計算各抗體濃度。

第十四節 組織化學染色(H&E stain)

在老鼠犧牲時取下皮膚，以福馬林浸泡 4 個小時以上，利用 PBS 加以清洗組 織後，以石蠟進行包埋，之後將組織切成4-5μm 大小的標本。

(1) 加標本浸入 xyline 中，進行脫蠟的動作。

(2) 在依次浸入 100-70%的酒精中，進行回水的動作。

(3) 浸入 Haematoxylin(紫色)中約 90 秒，用流水清洗後，在浸入胺水中，在以清水 清洗後，放入Eosin(紅色)中約 40 秒。

(4) 最後放入 100%酒精中，加以洗乾淨以及退色，等組織風乾後，進行封片。

第十五節 組織化學染色表皮厚度加以量化

在 200 倍視野的顯微鏡下利用尺標刻度來進行表皮增厚的量化，分別是以: (輕 度) Mild :10μm~20μm，(中度) Moderate :20μm~50μm，(重度)Severe : > 50μm 來做 為皮膚發炎程度的區分。

第十六節 組織化學染色發炎細胞 Eosinphils 的計數

利用量測各組皮膚上發炎細胞 Eosinophils 浸潤來評估老鼠皮膚發炎的程度。

主要是計數四個顯微鏡下400 倍的視野中 Eosinophils 的細胞個數後再平均所顯示 的結果。

第十七節 統計分析

本研究中實驗結果皆以平均值(Mean)與標準差(Standard Deviation)表示，利用 Student’s t-test 比較實驗結果中各項數據之間的差異，並且以 P<0.05 作為達到統計 學上的顯著差異的界定標準。*代表統計學上 P 值<0.05，**代表 P 值<0.001，***

代表統計學上P 值<0.0001。