討論 - 探討利用酵母菌進行豆類發酵後的產物對實驗性異位性皮膚炎老鼠模式的免疫調節作用

參考行政院衛生署所公告的「健康食品之輔助調整過敏體質功能評估方法」，

文中提到，所謂降低過敏反應，針對不同過敏型式有各種過敏反應的指標，例如:

降低血清過敏抗體的含量、降低發炎反應、減少過敏反應相關細胞激素或介質的分泌、調節T 細胞分泌細胞激素、降低呼吸阻力等。(行政院衛生署食品衛生處。

2007。健康食品之輔助調整過敏體質功能評估方法)

在實驗中，我們建立了異位性皮膚炎的動物模式，分別去探討引起過敏的兩個階段:(1)誘導期(induction phase)，初次接觸到過敏原，T 細胞在浸潤淋巴結中被激活，對特定的抗原誘發專一性IgE 抗體的產生。(2)作用期(effector phase)，再次接觸到過敏原，T 細胞產生反應，傾向 Th2 的免疫反應，肥大細胞也會釋放組織胺，造成組織發炎，皮膚也會出現症狀。

在異位性皮膚炎誘導期的階段，我們偵測了浸潤淋巴結細胞以抗原 OVA 刺激後分泌細胞激素以及細胞增生的情形。結果顯示，餵食豆類發酵產物(SCLFP)的老鼠，所分泌的細胞激素會傾向Th1 的反應，以及顯著提升抗發炎細胞 IL-10 的量，

在細胞增生指數則是呈現顯著被抑制的結果。另外，在餵食酵母菌(Yeast)的組別中，可以看到所分泌的細胞激素也是傾向Th1 的反應，不同的是，與 Th2 相關的細胞激素IL-13 則是顯著下降的，但對於抗發炎激素 IL-10 的分泌是沒有影響的，

而細胞增生指數則是呈現顯著上升的結果。(圖三、圖四)

我們推測可能是由於餵食豆類發酵產物(SCLFP)後，老鼠浸潤淋巴結細胞誘導分泌抗發炎細胞激素IL-10，加以調控了細胞對於OVA刺激後增生的情形，而由於

餵食酵母菌(Yeast)對於分泌抗發炎激素IL-10沒有影響，所以也無法藉由分泌IL-10 加以調控了細胞對於OVA刺激後增生的情形。

文獻中提到，餵食益生菌可以進一步去調控腸道的平衡，可能是藉由刺激產生Th1的細胞激素去調控抗過敏的效用。(Fuller, 1991; Hessle et al., 1999; Miettinen et al., 1998) 在老鼠實驗中，餵食來自於靈芝的β-聚醣與Sclerotinia sclerotiorum glucan(SSG)，結果顯示，測試老鼠的脾臟細胞發現由ovalbumin所誘導產生的Th1 免疫反應的細胞激素IFN-r是顯示上升的，然而與Th2免疫反應相關的細胞激素IL-4 與IL-5則是呈現下降的。(Lin et al., 2006; Saito et al., 2003; Suzuki et al., 2001)在本實驗的結果，我們同樣看到餵食酵母菌(Yeast)的組別，Th1的免疫反應上升，而Th2 的免應反應下降，然而，在餵食豆類發酵產物(SCLFP)的老鼠同樣提升Th1的免疫反應，卻沒有顯著降低Th2的反應。

在異位性皮膚炎作用期的階段，我們去觀測各組老鼠在皮膚外觀上的差異，

此外，也偵測老鼠血清中OVA 特異性抗體、脾臟細胞及腸繫膜淋巴結細胞以 OVA 刺激後分泌細胞激素以及細胞增生的情形。結果顯示，在皮膚外觀上，我們可以明顯看出Positive 組與 Negative 組在傷口及皮膚發炎的差異，然而，在餵食豆類發酵產物(SCLFP)、餵食酵母菌與餵食二次水的組別在外觀上，都可以看到有紅腫發炎的情形，但難以利用肉眼加以分辨三組的嚴重程度。(圖七)

在偵測老鼠血清中 OVA 特異性抗體的結果，可以看到餵食豆類發酵產物 (SCLFP)的老鼠，抗體與 Th2 相關的 IgE 的結果是顯著下降，而與 Th1 相關的抗體 IgG2a 的表現是顯著上升。(圖六)在分泌細胞激素的結果，我們可以看到在系統性的免疫反應上，不論是脾臟細胞或腸繫膜淋巴結細胞在餵食豆類發酵產物(SCLFP) 後都傾向Th1 的免疫反應，並且顯著提升抗發炎細胞激素 IL-10 的量。(圖八、圖九)餵食豆類發酵產物(SCLFP)老鼠的脾臟細胞以 in vitro OVA 的刺激增生，可以看到細胞增生指數則是呈現顯著被抑制的結果。(圖十)在異位性皮膚炎作用期的階段，我們得到的結果是與異位性皮膚炎誘導期的結果呈現一致的。

Iikura 與 Nagura 從動物實驗中發現，給與食物過敏的老鼠餵食益生物質果寡糖，糞便中的有機酸(如酪酸等)會增加，而且能夠降低血清中 IgE 的濃度，進而改善過敏症狀。(Nagura et al., 2002)除此之外，在餵食果寡糖五周的老鼠中發現，糞便的IgA 與血清中的 IgG 都是顯著上升的，並且在致免後感染沙門氏桿菌的存活率也較高。(Benyacoub et al., 2008) 除此之外，Suzuki et al 也證實測試餵食

Sclerotinia sclerotiorum glucan(SSG)的老鼠脾臟細胞，可以看到 Th1 相關的細胞激素IgG2a 的分泌顯著上升，而 Th2 免疫反應相關的 IgG1 則是顯著下降，這些文獻都支持了益生物質β-聚醣可以誘導 Th1 特異性的免疫反應，進一步去調節與 Th2 之間的免疫平衡的反應。

在異位性皮膚炎動物模式中，餵食豆類發酵產物(SCLFP)的老鼠不論是誘導期或是作用期都可以看到Th1 的免疫反應顯著上升，血清中 Th2 的免疫反應下降，

是與文獻的結果一致。比較特別的是我們看到細胞激素IL-10 顯著上升，細胞對 OVA 的刺激增生指數是顯著下降，是與餵食酵母菌(Yeast)不一樣的結果。

Interleukin-10(IL-10)是ㄧ個抗發炎的細胞激素，在阻止發炎反應與自體免疫制

病上扮演重要的角色。(Hawrylowicz and O'Garra, 2005; Moore et al., 2001; O'Garra et al., 2008)IL-10 可以被主動性免疫(adaptive immune)細胞表現，包含了 Th1、Th2、

Th17、調節性 T 細胞(Treg)等，也可以被先天性免疫(innate immune)細胞表現，包含樹突細胞(dendritic cells)、巨噬細胞(macrophages)、肥大細胞(mast cells)、nature killer cells、eosinophil 與 neutrophils 等。(Saraiva and O'Garra, 2010)(附圖七)IL-10 的產生目前被認為與免疫的耐受性以及調節性T 細胞免疫反應有很大的關係。

(Moore et al., 2001; O'Garra and Vieira, 2004; Roncarolo et al., 2006)

研究指出皮膚上的細菌，尤其是金黃色葡萄球菌，可能與異位性皮膚炎的發生扮演一個相當重要的關係。在先前的實驗中，比較皮膚外觀上的差異，餵食豆類發酵產物(SCLFP)、餵食酵母菌與餵食二次水的組別在外觀上，都可以看到有紅

腫發炎的情形，但難以利用肉眼加以分辨三組的嚴重程度。為了增強免疫反應的差異，在藥劑的部分添加了金黃色葡萄球菌腸毒素B (SEB)。研究指出:有 90%的異位性皮膚炎患者在皮膚損傷的部位發現有金黃色葡萄球菌的聚集(Breuer K, et al.2000 Allergy)，同時也有文獻指出，在這些聚集的金黃色葡萄球菌中，有 65%會產生具有超級抗原特性的腸毒素(Campbell DE, et al.1998 Arch Dis Child)，所以研究推測，這些聚集產生的具有超級抗原特性的腸毒素，可能在異位性皮膚炎的皮膚上扮演促進發炎的角色(Girolomoni G, et al. 2001 J Am Acad Dermatol ，Kyu Han Kim, et al. 2006 J Korean Med Sci)。

老鼠皮膚外觀的結果，在餵食豆類發酵產物(SCLFP)的組別中，我們可以看到相對於餵食二次水的組別，老鼠皮膚紅腫發炎、傷口的出現以及掉毛的情形，都有改善的現象(圖十一)。在組織切片染色(H&E stain)的結果上，我們將表皮增厚的情形加以量化，Negative 的組別皮膚表皮增厚傾向輕度的，餵食豆類發酵產物的組別則傾向輕度與中度，在餵食二次水的組別則傾向表現中度與重度的結果(圖十三)。利用量測各組皮膚上發炎細胞 Eosinophils 浸潤來評估老鼠皮膚發炎的程度，

結果顯示，Eosinophils 細胞浸潤的情形在餵二次水的組別相對於餵食豆類發酵產物(SCLFP)的組別，是有顯著上升的，所以我們可以知道，餵食豆類發酵產物(SCLFP) 可以減緩作用期的異位性皮膚炎動物模式在皮膚損傷的發炎狀況(圖十四)。最後，

整理老鼠每周的體重變化，結果顯示，餵食豆類發酵產物(SCLFP)的老鼠健康狀況是最好的(圖十五)。

文獻指出發炎細胞 Eosinophils 在異位性皮膚炎中扮演重要的角色，Eosinophils 活化後會出現在周邊血液及損傷的皮膚中，在異位性皮膚炎的患者中常可看到 Eosinophils 增加的情形。(Kapp, 1993; Leiferman et al., 1985; Simon et al., 2004)研究指出可能是藉由IL-5 與 GM-CSF 相關的機制，進一步去抑制了 Eosinophils 自我凋亡(apoptosis)，造成在異位性皮膚炎中有累積的情形(Wedi et al., 1999)。CCR3 所引起的免疫路徑對於Eosinophil 在皮膚發炎的部位進行回復(recruitment)是必需的，

以及幫助Eosinophil 進潤到皮膚的部位。(Gombert et al., 2005; Hochstetter et al., 2000) Eosinophils 在異位性皮膚炎造成細胞浸潤的情形，是會使得發炎的情況更加惡化。(Werfel, 2009)

口服耐受性(oral tolerance)對於調控腸道免疫扮演重要的角色，如果口服耐受性失去功能就會引起食物過敏的反應，Chase 在 1946 年提出口服耐受性是指，抗原暴露是先經由口服的路徑接觸，會進一步去活化抑制對抗抗原的免疫反應。

(Chehade and Mayer, 2005)

在動物實驗中，口服耐受性可以經由一次餵食大量抗原(High dose)或是利用持續餵食少量抗原(Low dose)所引起，分別走向不同的路徑。(Friedman and Weiner, 1994)餵食高劑量(High dose)的抗原會引起淋巴細胞對抗原的應變性差(anergy) (Whitacre et al., 1991)或是不反應(deletion)(Chen et al., 1995a)造成淋巴細胞的不反應主要是透過T 細胞的接受器，讓共同刺激訊號(costimulatory signal)產生錯誤 (Appleman and Boussiotis, 2003)，也可以透過細胞激素 IL-2、IL-12 來進行封鎖 (blocked)。(MarTh et al., 1998)餵食低劑量(Low dose)的抗原主要是引起調節性 T 細胞(regulatory T cell)來進行抑制免疫反應的調節，可以分成三種細胞，分別是:(1)Th3 cells:主要是透過分泌 TGF-β 來進行抑制。(2)TR1 cells:主要是透過分泌 IL-10 來進行抑制。(3)CD4+CD25+ cells:可能是藉由細胞表面連接 TGF-β 來進行抑制。(Barone et al., 1995; Chen et al., 1995b; Garside et al., 1995)(附圖四)

在先前的文獻探討中提到，異位性皮膚炎好發生在五歲以下的兒童，有研究推測，異位性皮膚炎的發生是與孩童的口服耐受性(oral tolerance)尚未建立健全所導致，使得孩童對於外來物質容易產生敏感性的免疫反應，當孩童再次經由皮膚接觸到相同的抗原，就會引起異位性皮膚炎的過敏症狀。研究指出患有異位性皮膚炎的孩童，大多伴隨著食物過敏的症狀，當吃到敏感性的食物，會使得皮膚上的過敏症狀變得更加嚴重(Sampson, 2003)。實驗的結果也可以看到，在異位性皮膚

炎的患者腸道的菌叢相較於健康人的腸道，是有較多的金黃色葡萄球菌的分佈，

而明顯有較少的益生菌Bifidobacterium 存在(Watanabe et al., 2003)，所以我們可以知道腸道的失衡可能在引起異位性皮膚炎或是使得病情惡化中扮演重要的角色。

有文獻認為利用提升口服耐受性的能力，可能可以用來治療過敏性的疾病或是自體免疫方面的疾病。(Higgins and Weiner, 1988; Nagler-Anderson et al., 1986;

Nussenblatt et al., 1990; Peron et al., 2009)在 Mucida 所建立的口服耐受性動物實驗中，結果顯示，餵食低劑量抗原蛋白OVA，可以經由 TGF-β 與 FOXP3，進一步去誘導抗原特異性T 細胞產生，利用主動傳輸(adoptive transfer)的實驗證實由口服

在文檔中探討利用酵母菌進行豆類發酵後的產物對實驗性異位性皮膚炎老鼠模式的免疫調節作用 (頁 43-50)