第一章、 前言
1.4 光合胞內共生之共生藻生存機制
(LAMP1, lysosome-associated membrane protein 1) 分佈卻極少，且也沒有 Rab7 和 V-ATPass (Vacuolar-type H+ - ATPase，調控囊泡內外離子的進出) 聚集於胞噬小體的膜上。然而又發現到 Mycobacterium 所在的胞噬小體
V-ATPase 和 LAMP1 的分佈。而有些學者另外發現到 salmonella 所在的 胞噬小體不會和溶小體融合在一起，那顯示出 salmonella 於胞噬小體內 允許早期到晚期的這段過程 ，卻阻止 和溶小體融合使自身存活下 來 (Brumell et al., 2001; Buchmeier and Heffron, 1991; Hashim et al., 2000;
Meresse et al., 1999a; Mukherjee, et al., 2002) 。
本實驗室對於胞內共生的研究以 Rab 蛋白爲主。Rab 蛋白是屬於 Ras 4.5~5.4 (MacMicking, et al., 2003; Schaible et al., 1998; Via et al., 1998) 。 當然有去針對共生態的共生藻來偵測其細胞內的pH值，作者使用SNARF
-1 (seminaphtorhodafluor-1)於波長585和640 nm藉由顯色的不同來對應出 相對的pH值。發現到包著共生藻的宿主細胞質pH值約為7.0~7.5之間，而 共生小體內部pH值約為6.0左右 (Venn et al., 2009) 。
1.5 海洋刺胞動物降解共生藻的過程
刺胞動物在攝食過程中，主要是消化外來物質來獲得養分，也會不 小心將共生藻吞食進去。在演化過程中，最終演變成共生小體會居住於 宿主内胚層的消化細胞內。 而多數的 珊瑚礁只允許一種共生藻居 住 (Baker, 2003; Goulet, 2006) ，當然有許多例外。舉例來說，珊瑚可能因為 環境條件的變化和生理需求不斷的改變，而造成互相共生之共生藻的數 目和種類也會隨著變動 (Baker and Romanski, 2007; Buddemeier and Fautin, 1993; Mieog et al., 2007) 。
1.5.1 走往胞噬小體的降解機制
在共生的過程中，雙方會進行挑選的動作來縮小彼此之間合作的夥 伴，而這時候合作的夥伴可能只剩下一種或是少數幾種。在宿主細胞內，
互 利 共 生 的 挑 選 過 程 可 以 分 為 前 吞 噬 (pre-) 和 後 吞 噬 辨 識 (post- phagocytic events) 。有證據顯示，lectin-glycan (凝集素和多醣) 的相互作 用存在於動物和微生物的關係，也是一種刺胞動物和渦鞭毛藻作為前吞 噬識別中非常重要的程序 (Lin et al., 2000; Wood Charlson et al., 2006) 。 後吞噬辨識和挑選，是由共生小體控制宿主細胞囊泡運輸來防止胞噬小
體的成熟化 (Chen, et al., 2004; Chen, et al., 2003; Chen et al., 2005; Fitt 過程導致其消化而造成共生藻的損失 (Pipe and Brown, 1993; Titlyanov et al., 1998) 。在海葵和珊瑚，於冷休克條件下所導致的白化，發現到宿主
1.6 自體吞噬
(Klionsky, 2005; Levine and Kroemer, 2008; Suzuki and Ohsumi, 2007) 。剛開始執行自體吞噬的時候，會新生成一種胞器，稱為 phagophore (isolation substrate，是一種酪氨酸磷酸化蛋白質 (tyrosine-phosphorylated protein) (Asao et al., 1997; Komada et al., 1997) 。在哺乳類動物中參與胞飲小體及 蛋白質的分類篩選 (endosomal/vacuolar protein sorting) 和影響酪氨酸激 酶受體的調控 (downregulation of tyrosine kinase receptor) ，如表皮生長 因子受體 (epidermal growth factor receptors) (Bache et al., 2002; Kanazawa et al., 2003; Lloyd et al., 2002) 。HRS 蛋白分子量是 115 kDa，主要位於細 胞質內早期胞飲小體和多泡體 (multivesicular bodies) 上 (Komada and
Kitamura, 1995; Komada, et al., 1997) 。在許多真核生物也確定有 HRS 同 源性蛋白，例如酵母菌中的 Vps27 蛋白質，是透過胞飲小體來調控囊泡 和胞飲作用運輸 (Piper et al., 1995) ，且有 23 %的胺基酸序列相同於哺乳 類動物的 HRS (Komada, et al., 1997)。果蠅和線蟲的 HRS 蛋白也有 30~35
%的胺基酸序列與哺乳類動物相同 (Komada and Kitamura, 2001) 。 HRS蛋白由幾個不同domains所組成，包括N端的VHS domaine、
FYVE domanis、脯氨酸 (proline) rich domains、兩個coiled-coil domains (CC1和CC2) 和脯氨酸-谷氨酸 (praline-glutamine) rich domains。其中 FYVE domains 可 以 特 異 性 結 合 到 phosphatidylinositol (3)-phosphate (PtdIns(3)P) (Raiborg et al., 2001) 。PtdIns(3)P是一種磷酸脂 (phospholipid) 通 常 出 現 於 膜 上 且 幫 助 蛋 白 質 運 輸 (protein trafficking) ， 研 究 指 出 PtdIns(3)P也出現於自噬小體的膜上 (Simonsen et al., 2004; Simonsen et al., 2001) ，因此PtdIns(3)P和帶有FYVE-domain的HRS之間的相互作用有 可能參與自噬小體的調控過程。研究發現，HRS剔除細胞在營養條件充 足情況下，會導致影響自噬小體成熟化。線蟲有一種HRS同源性的蛋白 質，為CeVPS27 (Class E vacuolar protein-sorting) (Roudier et al., 2005) ， 因此在RNAi干擾之下，CeVPS27嚴重不足而造成後期胞飲小體路徑被擋 住，最後作者推論說，自噬小體的形成，HRS並不是所必須的，可是失 去HRS卻會嚴重影響到自噬小體的成熟化 (Tamai et al., 2007)。
實驗目的
在海洋生物中刺胞動物和共生藻的所建立的共生關係對於海洋生態 給予豐富的生態環境和繁雜的生物多樣性，但是所建立的共生機制並不 是很清楚。想進一步了解，當刺胞動物與共生藻所建立的共生關係一旦 瓦解，會走向哪個路徑。有可能是將共生藻給胞吐出去，還是行胞噬作 用降解共生藻，甚至走往自體吞噬的路徑，使宿主和共生藻從共生態轉 變為白化。在哺乳類動物的研究發現到 HRS 在哺乳類動物調控細胞內胞 飲小體及液泡蛋白質分類篩選 (Lloyd, et al., 2002) ，且參與自體吞噬的 成熟化過程 (Tamai, et al., 2007) 。因此計畫藉由研究 HRS 蛋白來探索海 洋刺胞動物與共生藻之胞内共生關係的分子調控。
第二章、材料與方法
2.1 動物培養
本研究以美麗海葵作為研究胞內共生關係的模式系統，原因是方便 取樣和容易飼養，且和珊瑚的親源關係非常接近。實驗室內飼養的美麗 海葵是從屏東東港水產試驗所取得，養於玻璃水族溫度為 27 度 C 左右，
是用光照時間 14 小時和黑暗時間 10 小時為週期；使用照度為 80~100 m-2s-1的白光及藍光長型燈管。餵食豐年蝦卵，以海水和自來水一比一比 例來飼養，等待 24~36 小時的時間孵化。之後拿起打氣石再靜置半小時，
等待卵殼和豐年蝦幼蟲分離開來就可取出剛孵化的豐年蝦幼蟲來餵給美 麗海葵。以一個星期為基準來更換新鮮的海水，倒掉舊有三分之二的海 水再補給新鮮的海水進去。
2.2 ApLC3 cDNA 部分片段的選殖與序列分析
藉由退化引子聚合酶連鎖反應 (degenerate polymerase chain reaction) 的實驗設計，來選殖到美麗海葵 ApLC3 蛋白質功能區序列中具有高度保 留的小片段序列。
所使用的退化引子如下：
LC3-F1 5’-GATCCCCGTGATCATCGA-3’
LC3-R2 (31 mers) 5’-GGGAGGCGTACACCATGTACARRAANCCRTC-3’
所添加的反應物濃度和條件如下：
裝有 EtBr (Ethidium Bromide) 的容器來進行染色，而染有 EtBr 的瓊膠隨 即送到電泳膠影像分析儀 ( GE imageQuant 300) 。經由 UV 照射來看瓊 膠膠體呈現出核酸片段大小接近預期 210 bp，之後將核酸產物用核酸純 化套組 (PROTECH Gene-Spin TM 1-4-3 DNA Extraction Kit) 來進行純 化。純化完的產物用 TA Cloning 系統( TOPO TA Cloning，invitrogen )來 進行選殖的過程。成功送到 TOPO TA Cloning 專屬的載體 (pCR-TOPO 2.1，invitrogen 附錄二) 上，之後再寄送載體給基龍米克斯公司進行定序 的行列。待公司回寄定序資料去 NCBI 網站上的 GeneBank 資料庫進行 比對確定載體上的鑲嵌進去的序列為相似於 LC3 的基因。
2.3 ApLC3 重組蛋白的建構
為 了 生 產 出 ApLC3 重 組 蛋 白 ， 將 送 到 載 體 (pCR-TOPO 2.1 ， invitrogen) 上 ApLC3 的轉譯區 (coding region) 由 pET100/D-TOPO (附錄 三)(Champion pET Directional TOPO Expression Kits) 這套系統設計出的 引子透過 PCR 方式來放大。再經由膠體純化方式 (DNA extraction) 送到 pET100/D 載體進行表現，來產生 N 端 tag 帶有 6 個 Histidine 胺基酸的 ApLC3 重組蛋白。
所設計的引子如下：
pET100D-LC3-F1 5’- CACCGAGAGAGATCTACCCTTAC -3’
pET100D-LC3-R1 5’- TTCATCTTTTTCTTCTCTGTATA -3’
所添加的反應物濃度和條件如下：
pET100/D vector。從純化好的核酸產物取出 2 μl，此時加入鹽溶液 0.5 μl，
最後再加入配置好的 pET100/D 載體 0.5 μl，反應體積是 3 μl 於室溫下 作 用 5 分 鐘 。 將 ligation 產 物 插 在 冰 上 終 止 反 應 ， 再 來 執 行 轉 形 (transformation) 的動作，將 ligation 產物和 DH5α 勝任細胞混合好於冰上 作 用 5 分 鐘 。 開 啟 水 浴 槽 42 度 C 下 30 秒 來 進 行 熱 休 克 反 應 (Heat-shock)，迅速移動到冰上終止反應。加入 S.O.C (Super Optimal Broth，invitrogen) 200 μl 於 37 度 C 培養箱，轉速 200 rpm 的情況下進行 使用質體純化系統(PROTECH Gene-SpinTM –V2 Miniprep Purification Kit) 來抽取質體，送定序確認其結果。 electron corporation HeλIOSγ ) 測 O.D.600 = 0.6 以上。養好的 500ml 菌液
加入 5 ml 的 0.1 M IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) (最後 IPTG 濃度是 1 mM) ，於 37 度 C 培養箱，轉速 200 rpm，誘導四小時 (控 制組不加 IPTG 也一同培養於相同條件下) 。誘導完後，離心 10000 rpm，
5 分鐘，倒掉上清液後再收集菌塊於 -20 度 C 冰箱保存。冷凍過後的菌 塊加入 6 ml 1x Ni-NTA binding buffers (300 mM, 50 mM sodium phosphate buffer, 10 mM imidazole, pH 8.0) 使之溶解並且混合均勻，於超音波機器 imidazole, 50 mM sodium phosphate buffer, pH 8.0) 將 ApLC3 的重組蛋白 收集下來。
2.4 蛋白質定量
將純化下來蛋白質取出 10 μl，使用 Bio-rad protein assay Reagent (Bradford Protein Concentration Assay)方法來進行蛋白質定量，這是一種 常使用來測量蛋白質濃度的簡易測量方式。這蛋白質染劑是 Coomassie
SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 歸類為膠體電泳的一環，主要是依據蛋白質分子量的不同在電泳跑的過
10 % SDS 100 μl
時間 1~2 小時左右。拔掉齒梳，把凝固好的膠片插入到 SDS-PAGE 的電 泳槽裝置上，倒入 1x running buffer (14.41 g、glycine、3.03 g Tris 和 1 g SDS 溶解於 1 公升的 ddH2O 中) 。將樣品從冰箱拿出等待退冰，以 1 比 1 方 EDTA，0.5 M sucrose，pH7.4 ) 。均質液會加入適當濃度蛋白質分解酶抑 制劑 (Roche) 。使用組織均質機 (Hsiangtia Homogenizer) 來打散海葵打
100,000 g，4 度下，16 小時，分成美麗海葵的膜蛋白和可溶性蛋白 (soluble 到隔夜。加入一抗 rabbit anti-LC3 (MBL polyclonal antibody) 以 1：1000 和 rat anti-ApHRS serum 以 1：5000 (稀釋於 0.05 % Tween-20 於 1x
到膜上，以冷光影分析儀 (Fujifilm, LAS-3000) 來進行偵測。 用一小時。加入一抗 rat anti-ApHRS serum 和 rabbit anti-LC3 稀釋比例為 1：100，作用一個小時。加入 0.1 % Triton X - 100 的 1x PBS 洗三次，五 分鐘/次數。加入二抗 cy3-conjugated goat anti-rat IgG 和 anti-rabbit IgG 以 1：400 稀釋濃度，作用一個小時。加入 0.1% Triton X - 100 的 1x PBS 洗 三次，五分鐘/次數。最後加入 H33258 染核，使用封片膠加入含有細胞 的玻片面，用鑷子輕輕夾起蓋玻片緩慢蓋上於三天內觀察。而觀察細胞 是使用配有 FITC 濾片裝置和數位攝影系統 (EvolutionTM VF COOLED COLOR, MediaCybernatics) 的 Nikon EXLIPSE E400 顯微鏡來觀測。
2.5.1 玻片製備
拿出玻片、兩組玻片夾和三盒玻璃染缸。三盒染缸都加入 70 % 酒 精七分滿，加上 5~6 滴稀鹽酸。玻片分次加到染缸上，每次泡 5 分鐘。
浸泡好放於烘箱 (50 度 C~60 度 C) ，到烘乾為止。烘乾的玻片加入 1 % poly-L-lysine (sigma P8920) ，浸泡一分鐘再放到通風處風乾。
2.5.2 酸固定液的製備
Acetic acid 1
Glycerol 1
Seawater 13
3 ： 3 ： 39 共 45 ml
2.6 DCMU 處理作用
DCMU ( 3- ( 3,4-dichlorophenyl ) -1,1-dimethylurea ) 是光合作用抑制 劑以 DCMU 傷害到美麗海葵和共生藻來進行免疫螢光染色分析。先將濃 度為 0.1 M 的 DCMU 和海水混合稀釋成作用濃度 (4~5 μM) ，把美麗海 葵放置配好的溶液內處理 10 分鐘、30 分鐘、60 分鐘和 120 分鐘時間，
之後將海葵用酸固定液固定之後用 ApHRS 抗體染色，以重複三次來執行 免疫螢光染色分析。
2.7 吞噬作用
先將酵母菌培養於含有 YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) 培養液 的瓊膠平板 (agar plate) ，挑選出單一顆酵母菌的菌落於每一管含有 5 ml 的 YPD 培養液裡面大量培養。培養 2~3 天，把菌管放置到離心機 (KUBOTA 3700) 用 5000rpm 離心五分鐘，倒掉上清液再取出酵母菌的 pellets。利用計數型玻片計算出至少每 μl 要有 107顆酵母菌才能餵食到美 麗海葵的胃腔內進行此實驗。分別以 10 分鐘、30 分鐘、60 分鐘和 120
分鐘這四個不同時間點餵食給海葵，以重複三次來執行免疫螢光染色分
利用 rabbit anti-ApRab5 (Santa Cruz,A-20)、rabbit anti-ApRab7 (Santa Cruz,H-50) 、 mouse anti-ubiquitinylated proteins (Millipore) 、 rabbit anti-ApRab3 (實驗室自製)和 rabbit anti-ApLC3 (MBL) 這五種一抗分別和 rat anti-ApHRS 抗體配對進行 double staining (二重染色法)。海葵對切，
放於酸固定液固定 10 分鐘。打散海葵細胞，並鋪於 poly-L-lysine 玻片在 風乾，使細胞固定在玻片上。加 95 %藥用酒精去色，作用二十分鐘，用
放於酸固定液固定 10 分鐘。打散海葵細胞，並鋪於 poly-L-lysine 玻片在 風乾，使細胞固定在玻片上。加 95 %藥用酒精去色，作用二十分鐘，用