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美麗海葵 HRS 蛋白在胞內共生所扮演的角色之研究

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Academic year: 2021

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(1)國立高雄大學生物科技研究所 碩士論文. 美麗海葵 HRS 蛋白在胞內共生所扮演的角色之研究 Involvement of ApHRS in Aiptasia-symbiodinium endosymbiosis. 研究生:黃柏翔 撰 指導教授:黃永森 博士 陳鳴泉 博士. 中華民國 100 年 7 月.

(2) 致謝 在這漫長的日子中,讓我經歷了刻苦銘心的研究之路。終於,完成 了碩士論文。首先誠摯的感謝指導教授陳鳴泉老師和黃永森老師,對於 海洋生物領域上不時的指點並給予學生莫大的幫助。還要感謝各位口試 委員劉永超老師、林重宏老師和鄭至玉老師提供了良好的建議與指正, 使論文可以更加完善。謝謝系上老師,讓我在碩士課程和求學添加了不 少色彩。也謝謝系辦美純姊,熱心協助學業上的相關事務。. 在這幾年實驗室的生活中,有歡笑也有苦樂,對我來說是一段難忘 的過程和回憶。首先要感謝明昌、柏青學長和雅繐學姊對於實驗上不厭 其煩的教導。接下來感謝小朋友、銘燦、志成、昕燏、玉雯、怡靜、承 祐、景淳、坤銅、健脩、螃蟹,家宏和碩士班各位同學的互相扶持和勉 勵。. 最後要感謝家人的默默支持和鼓勵,讓我在求學之路可以無所牽掛, 得以完成碩士學位。還有親朋好友的鼎力相助,你們字字句句的鼓舞也 是支撐我的原動力之一。. 謹以此文獻給我的師長、家人、同學及好友們,感恩及祝福你們!.

(3) 目錄 目錄...................................................................................................................I 圖目錄............................................................................................................IV 附錄目錄........................................................................................................VI 中文摘要...........................................................................................................1 英文摘要...........................................................................................................3 第一章、前言...................................................................................................5 1.1 光合胞內共生的定義….............................................................................5 1.1.1 光合胞內共生普遍發生於海洋生物中……….....................................5 1.1.2 光合胞內共生對珊瑚礁生態系的重要性.............................................6 1.1.3 光合胞內共生對珊瑚宿主的利益..........................................................6 1.1.4 光合胞內共生對共生藻的利益.............................................................6 1.2 光合胞內共生的建立................................................................................7 1.2.1 胞內微生物的生存機制........................……………………………….8 1.2.2 光合胞內共生的維持.............................................................................9 1.2.3 光合胞內共生之共生藻的生長與增殖……………………………...11 1.3 光合胞內共生崩解的因素……………………………………………..11 1.3.1 光合胞內共生崩解的機制…………………………………………...12 1.4 光合胞內共生之共生藻生存機制…………….…………………...…..13 1.4.1 胞噬小體和共生小體之間的差異…………………………………...14 1.5 海洋刺胞動物降解共生藻的過程………………………………...…...15 1.5.1 走往胞噬小體的降解機制..……………………………………….....15. I.

(4) 1.5.2 走往自噬小體的降解機制…………………………………………..16 1.6 自體吞噬………………………………………………………………..17 1.6.1 自體吞噬中參與的蛋白質和機制……………………………………17 1.7 HRS 在自體吞噬中的角色................................………………………..18 實驗目的…………………………………………………………………….20 第二章、材料與方法……………………………………………………….21 2.1 動物培養………………………………………………………………. 21 2.2 ApLC3 cDNA 部分片段的選殖與序列分析…………………………...21 2.3 ApLC3 重組蛋白的建構……………………………………………….23 2.3.1 ApLC3 重組蛋白的表現與純化……………………………………..25 2.4 蛋白質定量……………………………………………………………. 26 2.4.1十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳................................................27 2.4.2 西方點墨法……………………………………………………………29 2.5 免疫螢光染色…………………………………………………………...31 2.5.1 玻片製備……………………………………………………………...31 2.5.2 酸固定液的製備……………………………………………………...32 2.6 DCMU 處理作用………………………………………………………..32 2.7 吞噬作用………………………………………………………………..32 2.8 移除酵母菌反應性抗體之酵母菌餵食實驗…………………………..33 2.9 二重染色………………………………...……………………………...33 2.10 以 biotin 標定海葵內胚層細胞表面………………………………….34 第三章、結果………………………………………………………………..36. II.

(5) 3.1 Anti-ApHRS抗體的專一性測試(Western blot analysis)…………….....36 3.1.1海葵細胞的免疫螢光染色(共生小體染上的百分比)………………..36 3.1.2海葵細胞的免疫螢光染色(DCMU處理的結果)…………………….37 3.2 ApHRS的二重染色分析…………………………………......................38 3.2.1 以 biotin 標定海葵內胚層細胞表面的實驗分析……..........................39 3.2.2 ApHRS出現在不同時期的yeast-containing phagosomes的比例.......40 3.3 ApLC3 的分子選殖….…………………………...……………………..42 3.4 ApLC3 重組蛋白的西方點墨法………….…...………………….……43 3.5 ApHRS 與ApLC3 的共分佈分析……………………………………...44 第四章、討論…………………………………………….………………….45 4.1 美麗海葵 ApHRS 在海葵細胞分佈的情形……………………….……45 4.2 DCMU 藥劑破壞美麗海葵與共生藻的共生關係……………………..46 4.3 ApHRS 蛋白與胞噬作用的關係………………………………….…….46 4.4 ApHRS 的免疫訊號與 biotin-labeled endocytic vesicles 關係................47 4.5 使用二重免疫螢光染色來得知ApHRS可能扮演的角色.....................48 4.6 總結..........................................................................................................49 第五章、圖表.................................................................................................50 第六章、參考文獻.........................................................................................74 附錄.................................................................................................................88. III.

(6) 圖目錄 圖 1. ApHRS 的部分 cDNA 序列和預測的胺基酸序列……………………50 圖 2. 藉由西方點墨法來分析 ApHRS 於美麗海葵蛋白質樣品的表現情 形…………………………………………………………………………….52 圖 3. 美 麗 海 葵 HRS 蛋 白 (ApHRS) 胞 內 分 佈 的 免 疫 螢 光 染 色 分 析.....................................................................................................................53 圖 4. DCMU 處 理 與 共 生 小 體 染 上 ApHRS 免 疫 螢 光 訊 號 的 比 例 分 析.....................................................................................................................54 圖 5.以二重免疫螢光染色法分析美麗海葵宿主細胞內的 ApHRS 和 ApRab5 分佈情形…………………………………………………………...55 圖 6. 藉由二重免疫螢光染色法來分析美麗海葵宿主細胞內的 ApHRS 和 ApRab7 分佈情形…………………………………………………………...56 圖 7. 藉由二重免疫螢光染色法來分析美麗海葵宿主細胞內的 ApHRS 和 Ub-proteins 分佈情形……………………………………………………….57 圖 8. 藉由二重免疫螢光染色法來分析美麗海葵宿主細胞內的 ApHRS 和 ApRab3 分佈情形…………………………………………………………...58 圖 9. 藉由 cell surface-bound biotin 螢光染色法來分析美麗海葵宿主細胞 內的 biotin-avidin 所標定蛋白質和 ApRab5 分佈情形…………………….60 圖 10. 藉由 cell surface-bound biotin 螢光染色法來分析美麗海葵宿主細胞 內的 biotin-avidin 所標定蛋白質和 ApRab4 分佈情形……………………62 圖 11. 藉由 cell surface-bound biotin 螢光染色法來分析美麗海葵宿主細胞 內的 biotin-avidin 所標定蛋白質和 ApHRS 分佈情形…………………….63 IV.

(7) 圖 12. 藉由酵母菌餵食實驗之免疫螢光染色法來觀察美麗海葵細胞內生 性 ApHRS 分佈情形………………………………………………………...65 圖 13. 利用酵母菌餵食來執行吞噬作用經由免疫螢光染色法來觀察美麗 海葵細胞內生性的 ApHRS,在消化細胞內包著酵母菌的胞噬小體膜上分 佈趨勢圖表………………………………………………………………….67 圖 14. 從美麗海葵 cDNA library 選殖出來的部分 LC3 序列之 PCR 產 物.....................................................................................................................68 圖 15. 美麗海葵與其他物種的 LC3 蛋白之多重序列比對親源分析圖.....69 圖 16. ApLC3 樹狀親源關係圖……………………………………………70 圖 17. 藉由西方點墨法來分析 ApLC3 於美麗海葵蛋白質樣品的表現情 形.....................................................................................................................71 圖 18. 以二重免疫螢光染色法分析美麗海葵宿主細胞內的 ApHRS 和 ApLC3 分佈情形……………………………………………………………72. V.

(8) 附錄目錄 附錄一、藥劑之廠牌和貨號...………………………………………………88 附錄二、pCR-TOPO 2.1 載體示意圖……………………………………..90 附錄三、pET100/D-TOPO 載體示意圖……………………………………91 附錄四、Rab蛋白於細胞內的路徑圖……………………………………...92. VI.

(9) 美麗海葵 HRS 蛋白在胞內共生所扮演的角色之研究 指導教授:黃永森 博士 1、陳鳴泉 2 博士 1 2. 國立高雄大學 生物科技所. 國立高雄海洋科技大學 海洋生物技術系 學生:黃柏翔 國立高雄大學 生物科技所 摘要. 海洋刺胞動物與胞內共生之渦鞭毛藻建立出豐腴和多樣性的珊瑚礁 生態系。然而,我們對於此共生關係及參與其中的分子機制卻不是很清 楚。文獻指出,哺乳類 HRS (hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate) 參與了細胞內蛋白質運輸的調控,並且可能參與了自噬 小體成熟化 (autophagosome maturation) 的過程。本研究因此希望探討 HRS 蛋白在海洋刺胞動物與渦鞭毛藻胞內共生參與的情形。免疫螢光染 色分析的結果顯示,大多數美麗海葵宿主細胞內的共生小體含有 ApHRS 免疫螢光訊號。以 DCMU ( 3- ( 3,4-dichlorophenyl ) -1,1-dimethylurea ) 光 合作用抑制劑處理海葵,導致 ApHRS + 共生小體的比例大幅減少。吞噬 作用 (phagocytosis test) 結果顯示,包著酵母菌的胞噬小體 (phagosome) 上帶有 ApHRS 免疫螢光訊號,而餵食 120 分鐘之後的胞噬小體,此比例 高於餵食 60 分鐘之後的。進一步選殖了美麗海葵同源性蛋白 LC3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3,自噬小體標記蛋白)。在胺 基酸序列上,ApLC3 與人類 LC3 有 72 %的相似性。二重免疫染色實驗 發 現 , ApHRS 和 ApLC3 常 同 時 座 落 在 相 同 的 共 生 小 體 微 膜 區. 1.

(10) (symbiosome membrane microdomains) 上。根據以上實驗結果,ApHRS 和 ApLC3 很可能參與美麗海葵和共生藻所建立胞內共生的調控。. 關鍵字:胞內共生、共生小體、自噬小體成熟化、HRS、LC3. 2.

(11) Involvement of ApHRS in Aiptasia-symbiodinium endosymbiosis Advisor(s):Dr. Yung-Sen Huanga and Dr. Ming-Chyuan Chenb a. Institute of Biotechnology. National University of Kaohsiung b. Department of Marine Biotechnology. National Kaohsiung Institute of Marine Technology Student: Po-Hsiang Huang Institute of Biotechnology National University of Kaohsiung Abstract The intracellular association of symbiotic dinoflagellates (zooxanthellae) with marine cnidarians is the foundation of the highly productive and diversified coral reef ecosystems. However, the responsible molecular mechanism for its establishment and maintenance is still poorly known. Literature shows that HRS regulates intracellular protein sorting and may play an important role in autophagosomal maturation. The current study aimed to investigate the role of HRS protein in the endosymbiosis between the sea anemone Aiptasia pulchella and zooxanthellae. Immunostaining analysis showed that ApHRS immunoreactivities were associated with the majority of symbiosomes. DCMU treatment of the sea anemone resulted in great reduction in the percentage of ApHRS + symbiosomes within 30 min.. 3.

(12) However, this percentage rose again when DCMU treatment was prolonged to 120 min. Phagocytosis assay showed that phagosomes containing yeasts were highly decorated with ApHRS-positive immunosignals, with higher preference toward the 120 minutes-old phagosomes than 60 minutes-old phagosomes. A partial cDNA for ApLC3 protein, the sea anemone homologue of LC3 proteins, which is 72 % identical to human LC3 protein, was. cloned. and. employed. as. an. autophagosome. marker.. Double immunostaining showed that ApLC3 was located to ApHRS-positive symbiosome membrane. Overall, the present study supported that ApHRS is involved in the regulation of Aiptaisia-microalgal endosymbiosis.. Keywords: Endosymbiosis, Symbiosome, autophagosome maturation, HRS, LC3. 4.

(13) 第一章、前言 1.1 光合胞內共生的定義 共生 (symbiosis) 的定義是兩種不同的生物彼此生活在一起,而共生 的關係可分為片利共生,互利共生和寄生等。在片利共生和互利共生的 情況下,前者中有一方或後者中雙方皆受益,可是在寄生的狀態下則是 一方受益而另一方則受害的關係 (Stat et al., 2008) 。在互利共生最有名 的例子是,在海洋中刺胞動物 (cnidarians) 與蟲黃藻 (zooxanthellae) 兩 者共生所形成的珊瑚礁生態環境。由於他們共生行為十分特殊,是蟲黃 藻存活在刺胞動物的消化細胞中,又稱為胞內共生 (endosymbiosis) 。當 共生生物是能行光合作用的藻類或細菌時,此共生關係便是光合胞內共 生。. 1.1.1 光合胞內共生普遍發生於海洋生物中 在 海 洋 生 物 中 , 行 胞 內 共 生 的 物 種 包 括 (1) 扁 形 動 物 門 (Platyhelminthes) 中渦蟲 (Turbellaria) 的共生生物為扁藻 (Ttraselmis)。 (2) 軟 體 動 物 門 (Mollusca) 中 和 腹 足 綱 (Gastropoda) 和 雙 殼 綱 (Bivalvia) 的共生生物是屬於 Symbiodinium 屬中的蟲黃藻。 (3) 脊索動 物門中的海鞘 (Ascidiacea) 是和原球藻 (Prochloron) 共生生活。 (4) 多 孔 動 物 門 (Porifera) 為 原 始 的 多 細 胞 生 物 , 也 可 稱 為 海 綿 動 物 門 (Spongia) ,一般稱為海綿 (Sponge) ,而和海綿共生的生物為藍綠藻 (Cyanobacteria) (Venn et al., 2008)。 (5) 刺胞動物門中的許多生物例如:. 5.

(14) 珊瑚,海葵,水母和水螅這幾種類型的生物。其中前三種海洋生物的共 生藻是屬於渦鞭毛藻 (Dinoflagellata) Symbiodinium 屬的蟲黃藻,而後者 生 活 於 淡 水 中 水 螅 的 共 生 藻 是 屬 於 綠 球 藻 (Chlorella). (Wang and. Douglas, 1998) 。. 1.1.2 光合胞內共生對珊瑚礁生態系的重要性 基於刺胞動物和行光合作用的渦鞭毛藻行互利共生的關係,所建立 的珊瑚礁是世界上海洋生態系統中孕育海洋生物的棲息地 (Coffroth, 2005) ,其特色是具有高等級的生物多樣性、生態複雜性和高初級生產 力,並有著重要的美學和商業價值,特別是在漁業,旅遊業和水族觀賞 方面 (Vidal-Dupiol et al., 2009) 。. 1.1.3 光合胞內共生對珊瑚宿主的利益 可是環繞於珊瑚礁周圍的水域是非常貧瘠而無法給予珊瑚和共生藻 成長所需的基本養分,此時渦鞭毛藻扮演提供宿主養分和維持生理狀態 中重要的角色。例如,光合作用中所固定碳通常是以甘油和其他簡單的 分子形式存在,方便於共生藻運送的速度和數量來滿足宿主呼吸所要的 需求。此外,對於造礁珊瑚,其物理結構的骨架也是靠著共生藻的存在 率而提升碳酸鈣沉積的效率 (Coffroth, 2005) 。. 1.1.4 光合胞內共生對共生藻的利益 刺胞動物會藉由消化道內胚層細胞來庇護行光合作用的單細胞藻. 6.

(15) 類,而這種共生藻是是屬於渦鞭毛藻 (Dinoflagellata) Symbiodinium 屬, 通常也被稱為蟲黃藻。而他們兩者所建立被認為是一種互利共生,共生 藻靠著光合作用活性讓宿主刺胞動物產生有機碳。相對的宿主提供共生 藻一個保護的場所避免被植物捕食者獵食,和補充所缺乏的無機碳、無 機磷和無機氮等營養鹽 (Cecile et al., 2009) 。. 1.2 光合胞內共生的建立 一般而言,細胞會藉由攝食的行為來捕抓胞外的物質。這物質有可 能是病原體、細菌或細胞彼此之間分泌的微細分子等。此時細胞膜會開 始內凹或是向外的方式伸出偽足抓取到胞外顆粒分子,經由細胞內所產 生的囊泡來運送到特定位置。然而運送過程中會有大大小小不同類型的 囊泡來進行融合,或是釋放消化酵素來將胞外分子給分解。這些反反覆 覆看似複雜性所連貫在一起的動作就是稱為胞飲作用 (endocytosis) 。一 般而言,可以從胞外分子的顆粒大小來作為區分。當分子小於0.25 μm, 如蛋白質等,此於細胞膜會開始內凹形成一個類似口袋的形狀讓細小分 子進入到凹陷處,最後會會慢慢地包裹起來直徑約為 (0.1~0.25 μm) 的小 泡稱為胞飲液泡 (pinosome) 。當胞外分子是大於5 μm,如細胞碎片和微 生 物 等 進 入 到 細 胞 內 會 形 成 大 於 0.25 μm 的 囊 泡 稱 為 胞 噬 小 體 (phagosome) ,而整個動作則稱為胞噬作用 (phagocytosis) 。而endocytic pathway過程中進入到細胞體內不管是胞飲液泡或是胞噬小體都是屬於 早期階段 (5~10分鐘) ,而這個早期胞飲小體 (early endosome) 的pH質 是弱酸性的。隨著時間慢慢拉長到30分鐘左右,早期囊泡會和運送囊泡. 7.

(16) 互相融合形成後期胞飲小體 (late endosome) 。之後會和含有消化酵素的 溶小體 (lysosome) 融合,靠著水解酵素來分解胞外物質來獲得養分 (Mellman, 1996; Mukherjee et al., 1997) 。. 1.2.1 胞內微生物的生存機制 對於在胞內微生物研究中,這些微生物包括細菌、原生動物、真菌 和藻類在消化細胞內生存和宿主維持共生的狀態,進入到細胞內必然會 遭受到酵素的攻擊而被消化殆盡。有可能演化成在吞噬溶酶體 (phagolysosome) 中存活;有可能在未成熟的胞噬小體中存活並且持續繁 殖;有可能把胞噬小體的膜溶解掉,逃脫出來而在細胞質內生長 (Heinzen et al., 1996) 。由於這些方法使共生菌可以存活在宿主細胞內不被消化攻 擊,但在某些情況下可能是共生菌的生長速度快以致於很難被宿主給消 化掉 (Hohman et al., 1982) 。而這些對抗胞内消化的機制可分為三種: (1) 影響正常胞噬小體之成熟。又分為兩種形式,第一種是使包著微生物的 囊泡停留在早期的階段 (early-stage) 無法進入到下一階段。第二種是停 留在晚期的階段 (late-stage) ,無法和溶小體進行融合。 (2) 逃離胞噬小 體在細胞質生存。 (3) 當晚期囊泡和溶小體融合之後,會抵抗或是讓水 解酵素失活而得以生存 (Amer and Swanson, 2002; Hohman, et al., 1982; Mukherjee et al., 2002; Scott et al., 2003) 。. 當共生藻進入到刺胞動物的細胞內,被吞噬進去之後,不被消化細 胞給分解,而所衍生出的存活機制又是如何呢?根據研究發現,被吞噬. 8.

(17) 進去到宿主細胞內的共生藻存活在胞噬小體,可是這個胞噬小體很特 別,它停留在一個階段而所包著共生藻和宿主維持一種互利共生的關 係,又稱為共生小體 (symbiosome) 。因此想觀察包著共生藻的胞噬小體 是否與溶小體進行融合的動作,先餵食已死和活的共生藻之後使用鐵蛋 白 (ferritin) 來標定溶小體來觀察其結果。發現包著活共生藻的胞噬小體 的內部沒有出現鐵蛋白的訊號,但是包著已死共生藻的胞噬小體的內部 有鐵蛋白的訊號。從結果得知,活著的共生藻當被吞噬進去到宿主細胞 內在胞噬小體中可能抵抗溶小體的融合而得以存活。由這些前人的研究 可以推測出包著存活共生藻於胞噬小體內會影響正常吞噬作用,干擾胞 噬小體的成熟化避免形成後期的型態,甚至和溶小體進行融合,而使共 生藻可以在宿主細胞內存活下來 (Fitt and Trench, 1983; Hohman, et al., 1982) 。. 1.2.2 光合胞內共生的維持 共生藻主要是利用宿主所釋放的代謝廢物來作為營養來源,來提供 共生藻生長所需的二氧化碳、氮鹽和磷酸鹽。因為這些無機營養物質溶 解在珊瑚礁環境中含量很低,所以必須透過這種方式來提供所需的養 分。在刺胞動物體內行共生狀態彼此共存在低營養的情況下,必須藉由 攝食動作來分解和消化胞外分子來補充雙方之間所需的養分和成長。而 當刺胞動物無法提供外援食物的時候,此時共生藻慢慢出現營養不足的 現象 (1) 共生藻的細胞分裂明顯下降 (2) 葉綠素 a 含量逐漸降低 (3) 碳 和氮的比值會增加 (4) 共生藻在刺胞動物所含的群族數會大量下滑. 9.

(18) (Cook et al., 1988) 。 當珊瑚或是其他動物因為外在因素失去共生藻時,會使體內大量累 積的氨 (ammonia)。正常來說共生藻會吸收宿主所釋放的氨轉換成胺基 酸,再送回去給宿主利用。不管是由共生藻光合作用所產生或是攝食分 解所獲得,都會促進宿主吸收氨的能力和降低從胺基酸轉變成氨的產 生,這些過程有對於動物本身來維持氮的恆定。 利用放射性追蹤劑來標定碳源,發現共生藻執行光合作用的時候會 釋放甘油和有機酸。而共生藻行光合作用所產生的碳之化合物有助於動 物行呼吸作用所需的碳源。氮循環比較具有生化複雜性,因為涉及宿主 和共生藻之間營養物質的轉換。首先,宿主會產生含氮廢物會轉送到共 生藻,之後共生藻會將含氮廢物轉換成有用氮之化合物再送回去給宿主 使用。刺胞動物是眾所皆知對於氨有很高的產率,因為呼吸作用會大量 將胺基酸進行脫氨的化學反應以至於釋放大量的氨,而共生藻本身又可 以吸收氨。藻類共生作用產物主要都是非含氮化合物,但還是有少量的 胺基酸被釋放。共生藻和刺胞動物的共生關係中對於氮利用之假說:(1) 藻類回收宿主所產生的含氮廢物,例如氨。(2) 而有機氮化合物,例如必 須胺基酸就會送回到宿主所使用 (Wang and Douglas, 1998) 。 珊瑚有自營性和異營性,在貧瘠的海水中靠著共生藻行光合作用的 產物給予珊瑚宿主本身。然而,許多研究也證實異營性的珊瑚亦非常活 躍,靠著捕抓海水中的浮游生物進行固碳作用形成碳酸鈣來建構本身的 骨架。除了這樣碳的補充之外,攝食對於造礁珊瑚本身也是非常重要的, 因為氮和磷這些營養物質不能直接從共生藻行光合作用所獲得。必須靠. 10.

(19) 著捕抓浮游生物,或是吸收胞外物質和溶解之後分解化合物所獲得。共 生藻回收宿主產生廢物而獲得所需的磷。有些造礁珊瑚會攝食浮游生 物,經由一連串的反應產生一些顆粒狀態的磷來滿足它們對於骨架的維 持和生長。共生藻會將光合作用產生的碳水化合物傳送到珊瑚宿主本身 是為最主要的碳來源之一 (Houlbreque and Ferrier Pages, 2009) 。. 1.2.3 光合胞內共生之共生藻的生長與增殖 共生藻行光合作用所合成的有機碳會送到珊瑚宿主,給予宿主所需 的碳和能量。對於它們而言,共生藻受到珊瑚良好的保護同時又吸收宿 主攝食之後所產生二氧化碳 (CO2) 和氨 (NH4+) 。藉由共生藻和刺胞動 物宿主一來一往的互助關係,在這樣的共生調條件下雖然可以提供宿主 本身大量生長和繁殖的利益(特別是對於珊瑚宿主有益的共生藻)。相對 於共生藻在這樣的共生條件下受到珊瑚宿主的庇護,在共生狀態時候倍 增時間需要花上70~100天左右,顯然慢於離體培養的共生藻只需要大約 三天時間。其實,共生藻也可不依賴宿主本身來確保生存的持久性,例 如,地衣中的共生藻在非共生狀態比共生時更能快速生長,而硫化菌本 身於非共生也能生存和大量繁衍。在ㄧ個大環境中提供藻類和刺胞動物 共生在一起,有些選擇彼此互動來維持其胞內共生的延續,而有些則不 互動來排斥共生行為。這完全取決於他們的競爭能力,也基於如此才會 演變成多樣化的生態和不同的生存方式 (Wooldridge, 2010) 。. 1.3 光合胞內共生崩解的因素. 11.

(20) 白化的定義簡而言之就是珊瑚宿主和共生藻之間的共生關係被破 壞,因為失去大量的共生藻或是共生藻的本身藻色素被降解,而這些共 生藻物種具有葉綠素 a 和 C2,再加上各種類胡蘿蔔素,特別是甲藻素是 屬於棕色,除非宿主本身的動物組織含有大量色素存在,不然會呈現出 透明組織或是白色的碳酸鈣骨架形式存活。白化的跡象包括有宿主體型 變小、所分泌的黏液減少和有性生殖被抑制。如果不將白化的情形給扭 轉回來,珊瑚勢必會走向死亡的邊緣。在過去的幾年發現,導致珊瑚白 化可能受到環境和疾病的影響。以疾病的影響來說,因為感染的過程中 導致組織損傷或是生理功能改變,而以環境來說可能是受到惡劣環境擾 動產生一種壓力的反應。這些因素可能是鹽度的變化 (低鹽度) 、海水溫 度起伏變化,受到細菌的感染、可見光 (輻射) 和汙染沉積物等 (Douglas, 2003; Rosenberg et al., 2008; Weis, 2008) 。. 1.3.1 光合胞內共生崩解的機制 這些崩解的機制分為 (1) 海水溫度提升和光照太過強烈,會對於共 生藻本身的葉綠體光合系統II的D1蛋白質造成損傷或是含量減少,以及 中斷卡爾文循環因而影響到光合作用中的固碳作用 (Jones et al., 1998; Warner et al., 1999) 。 (2). Vibrio shiloi 這種病原菌會釋放出毒素,來抑. 制共生藻的光合作用 (Banin et al., 2001) 。 (3) 因為某些蛋白質的磷酸 化造成宿主細胞的型態變化,而促使共生藻被迫脫離宿主細胞 (Sawyer and Muscatine, 2001) 。 (4) 使宿主細胞壞死和進入到細胞死亡的路徑而 造成細胞裂解 (Dunn et al., 2002) 。. 12.

(21) 1.4 光合胞內共生之共生藻生存機制 在寄生微生物的研究發現,當微生物入侵到細胞內被胞噬小體給包 覆住之後。微生物為了生存下來會干擾胞噬小體,避免胞噬小體行成熟 化的過程中且阻止和溶小體進行融合的現象發生。而這樣的機制可分為: (1) 被胞噬小體所包裹的微生物滯留於早期胞飲小體的階段。研究人 員發現被胞噬小體所包裹的活的 Mycobacterium tuberculosis 上有早期階 段 的標 定 蛋 白 (Rab5 和 運 鐵 蛋白 受 器 ), 可 是 後 期階 段 的 標定 蛋 白 (LAMP1, lysosome-associated membrane protein 1) 分佈卻極少,且也沒有 Rab7 和 V-ATPass (Vacuolar-type H+ - ATPase,調控囊泡內外離子的進出) 聚集於胞噬小體的膜上。然而又發現到 Mycobacterium 所在的胞噬小體 pH 值為 6.3~6.5 左右,比一般的胞噬小體的略高些。因此可以推測出這 一類的寄生型微生物可能是讓自己本身所在的胞噬小體滯留於一個早期 階段,而得以生存下去 (Roberts et al., 1999; Scott, et al., 2003) 。 (2) 被胞噬小體所包裹的寄生型微生物滯留於後期胞飲小體的階 段。學者發現到 salmonella typhimurium 被胞噬小體給包著的膜上,於早 期階段時間點有 Rab5 和運鐵蛋白受器,再延後時間點觀察到有 Rab7、 V-ATPase 和 LAMP1 的分佈。而有些學者另外發現到 salmonella 所在的 胞噬小體不會和溶小體融合在一起,那顯示出 salmonella 於胞噬小體內 允許早期到晚期的這段過程 ,卻阻止 和溶小體融合使自身存活下 來 (Brumell et al., 2001; Buchmeier and Heffron, 1991; Hashim et al., 2000; Meresse et al., 1999a; Mukherjee, et al., 2002) 。. 13.

(22) 本實驗室對於胞內共生的研究以 Rab 蛋白爲主。Rab 蛋白是屬於 Ras 超家族小分子 GTP 結合蛋白,至少有 60 種 Rab 基因存在於人類的基因 組中,且從酵母菌到人類都可以發現到 Rab 蛋白存在(Stenmark and Olkkonen, 2001)。Rab 蛋白功能為調控囊泡運輸、控制蛋白質的出芽 (budding)、運送和融合等,且各個 Rab 蛋白調節胞內囊泡運送的路徑也 是不同的(附錄四) (Stenmark and Olkkonen, 2001) 。本實驗室的研究指 出,美麗海葵的 ApRab5 和 ApRab7 這兩種蛋白質和哺乳類動物中的 Rab5 和 Rab7 一樣,對於包著非活著顆粒的胞噬小體這些 Rab 蛋白會依時間點 分佈於膜上。執行餵食實驗於早期階段,發現包著共生藻的胞噬小體上 有 ApRab5 存在,而晚期階段則發現標定蛋白 ApRab7 分佈很少。使用 DCMU 光合抑制劑,卻發現隨著時間處理時間愈久,反而是 ApRab7 在 胞噬小體上的分佈比 ApRab5 發現的多。推測可能是留住 ApRab5 而排除 ApRab7 來維持共生藻和宿主海葵所建立的共生關係 (Chen et al., 2004; Chen et al., 2003) 。. 1.4.1. 胞噬小體和共生小體之間的差異 以結核桿菌 (Mycobacterium tuberculosis) 為例子來說,被胞噬小體 包住的結核桿菌,為了存活下來會抑制胞噬小體的成熟化和溶小體進行 融合,此時結核桿菌所在的胞噬小體pH值約為6.2~6.4 (MacMicking et al., 2003; Sturgill-Koszycki et al., 1994) 。而正常成熟化的胞噬小體pH值為 4.5~5.4 (MacMicking, et al., 2003; Schaible et al., 1998; Via et al., 1998) 。 當然有去針對共生態的共生藻來偵測其細胞內的pH值,作者使用SNARF. 14.

(23) -1 (seminaphtorhodafluor-1)於波長585和640 nm藉由顯色的不同來對應出 相對的pH值。發現到包著共生藻的宿主細胞質pH值約為7.0~7.5之間,而 共生小體內部pH值約為6.0左右 (Venn et al., 2009) 。. 1.5 海洋刺胞動物降解共生藻的過程 刺胞動物在攝食過程中,主要是消化外來物質來獲得養分,也會不 小心將共生藻吞食進去。在演化過程中,最終演變成共生小體會居住於 宿主内胚層的消化細胞內。 而多數的 珊瑚礁只允許一種共生藻居 住 (Baker, 2003; Goulet, 2006) ,當然有許多例外。舉例來說,珊瑚可能因為 環境條件的變化和生理需求不斷的改變,而造成互相共生之共生藻的數 目和種類也會隨著變動 (Baker and Romanski, 2007; Buddemeier and Fautin, 1993; Mieog et al., 2007) 。. 1.5.1 走往胞噬小體的降解機制 在共生的過程中,雙方會進行挑選的動作來縮小彼此之間合作的夥 伴,而這時候合作的夥伴可能只剩下一種或是少數幾種。在宿主細胞內, 互 利 共 生 的 挑 選 過 程 可 以 分 為 前 吞 噬 (pre-) 和 後 吞 噬 辨 識 (postphagocytic events) 。有證據顯示,lectin-glycan (凝集素和多醣) 的相互作 用存在於動物和微生物的關係,也是一種刺胞動物和渦鞭毛藻作為前吞 噬識別中非常重要的程序 (Lin et al., 2000; Wood Charlson et al., 2006) 。 後吞噬辨識和挑選,是由共生小體控制宿主細胞囊泡運輸來防止胞噬小. 15.

(24) 體的成熟化 (Chen, et al., 2004; Chen, et al., 2003; Chen et al., 2005; Fitt and Trench, 1983; Scott, et al., 2003) 。. 1.5.2 走往自噬小體的降解機制 在最近幾年全球大規模珊瑚死亡的事件中,珊瑚白化被認為是主要 驅動過程,可是對於刺胞動物是如何發生白化和經由哪些機制而導致白 化仍是不清楚的。進一步的發現在非造礁類的刺胞動物中,伴隨著吞噬 過程導致其消化而造成共生藻的損失 (Pipe and Brown, 1993; Titlyanov et al., 1998) 。在海葵和珊瑚,於冷休克條件下所導致的白化,發現到宿主 藉由胞吐作用 (exocytosis) 將共生藻給釋出,或是將含有共生小體的宿 主細胞也一併胞吐出來 (Gates et al., 1992; Steen and Muscatine, 1987) 。 最近在研究珊瑚白化可能受到調控,而其中以 Rab 蛋白家族在美麗海葵 (Aiptasia pulchella) 調控共生研究給了第一條線索。研究顯示共生藻在正 常情況下會從胞噬小體積極排除掉 ApRab11 ,然而在壓力過程中所導致 共生藻的降解,ApRab11 和 ApRab7 會出現在包著死亡或喪失功能的共 生藻的胞噬小體上 (Chen, et al., 2003; Chen, et al., 2005) 。在刺胞動物中 發生白化所啟動的自噬機制 (autophagy) ,其中 Rab11 和 Rab7 是自噬活 化被認定的標誌。在微生物入侵到細胞內,也是利用同樣的自噬機制來 消化躲藏吞噬溶酶體的病原體,而自噬機制過程中也包括 Rab 蛋白參與 (Levine, 2005) 。在壓力過程中,刺胞動物透過共生小體上的囊泡從養分 交換轉換成消化機制來降解共生藻,使原本保持的共生狀態被破壞而導 致自噬機制被活化,最終形成了白化的現象 (Downs et al., 2009) 。. 16.

(25) 1.6 自體吞噬 自體吞噬 (autophagy) 在演化上是屬於高度保守的路徑 (Boya et al., 2005),在生物多樣化的情況下,從酵母菌到哺乳類動物都可以觀察的 到。它對於細胞來說是一個非常重要的過程,主要是蛋白質、胞器、細 胞質內的物質和入侵到細胞內之病原菌的清除和降解 (Gozuacik and Kimchi, 2004; Koul et al., 2004) 。誘導自體吞噬的原因是細胞所需的營養 不足、細胞組織缺氧 (Cuervo, 2004) 和受微生物感染 (Meresse et al., 1999b) ,也證實自體吞噬在細胞中的重要功能包括細胞分化,組織重 構,生長控制和細胞防禦入侵 (Cuervo, 2004) 。在細胞防禦入侵中,舉 例來說,自體吞噬在巨噬細胞中扮演控制分枝桿菌的角色 (Gutierrez et al., 2004) 。在自體吞噬剛開始啟動時會先確認和鎖定目標,然後從內質網 和高基氏體形成有如囊泡型態的小膜結構,此時小膜會延伸拉長並整個 包覆目標而形成雙膜結構的自噬小體 (autophagosome) ,之後和細胞質 內的溶小體 (lysosome) 進行融合形成自溶小體 (autolysosome) ,再靠著 溶小體內所含的水解酵素來溶解和降解目標物 (Cuervo, 2004; Gozuacik and Kimchi, 2004) 。. 1.6.1 自體吞噬中參與的蛋白質和機制 自體吞噬的分子機制中包含多種 Atg (Autophagy-related protein) 蛋 白質從酵母菌到哺乳類動物都有,其中大部分都是在酵母菌中發現到的 (Klionsky, 2005; Levine and Kroemer, 2008; Suzuki and Ohsumi, 2007) 。剛. 17.

(26) 開始執行自體吞噬的時候,會新生成一種胞器,稱為 phagophore (isolation membrane,隔離膜) 。隔離膜會環繞於要降解的胞器周圍,此時隔離膜 會開始進行延伸和彎曲這兩個動作,緊密包裹住目標物與細胞質隔絕開 來。而在這個階段,Atg 會以蛋白質和蛋白質或蛋白質和脂質所形成的複 合物來參與。首先 Atg5 會和 Atg12 共價鍵連接,以 Atg5-Atg12 來和 Atg16 形成複合體接在隔離膜,再來 Atg8 (LC3)會轉換成 LC3-I (cytosolic),而 LC3-I 的 C 端 會 接 上 phosphatidyl-ethanolamine (PE) 形 成 LC3-II (membrane bound),然後鑲嵌在隔離膜上。隔離膜會開始緊緊關閉起來, 形成雙層膜結構的自噬小體 (autophagosome) 。於成熟的階段中,會和 胞飲小體或是溶小體進行融合。融合之後形成自溶小體由溶小體所攜帶 的水解酵素,將包覆物質完全溶解掉 (Deretic, 2008)。. 1.7 HRS 在自體吞噬中的角色 HRS 全 名 是 hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate,是一種酪氨酸磷酸化蛋白質 (tyrosine-phosphorylated protein) (Asao et al., 1997; Komada et al., 1997) 。在哺乳類動物中參與胞飲小體及 蛋白質的分類篩選 (endosomal/vacuolar protein sorting) 和影響酪氨酸激 酶受體的調控 (downregulation of tyrosine kinase receptor) ,如表皮生長 因子受體 (epidermal growth factor receptors) (Bache et al., 2002; Kanazawa et al., 2003; Lloyd et al., 2002) 。HRS 蛋白分子量是 115 kDa,主要位於細 胞質內早期胞飲小體和多泡體 (multivesicular bodies) 上 (Komada and. 18.

(27) Kitamura, 1995; Komada, et al., 1997) 。在許多真核生物也確定有 HRS 同 源性蛋白,例如酵母菌中的 Vps27 蛋白質,是透過胞飲小體來調控囊泡 和胞飲作用運輸 (Piper et al., 1995) ,且有 23 %的胺基酸序列相同於哺乳 類動物的 HRS (Komada, et al., 1997)。果蠅和線蟲的 HRS 蛋白也有 30~35 %的胺基酸序列與哺乳類動物相同 (Komada and Kitamura, 2001) 。 HRS蛋白由幾個不同domains所組成,包括N端的VHS domaine、 FYVE domanis、脯氨酸 (proline) rich domains、兩個coiled-coil domains (CC1和CC2) 和脯氨酸-谷氨酸 (praline-glutamine) rich domains。其中 FYVE domains 可 以 特 異 性 結 合 到 phosphatidylinositol (3)-phosphate (PtdIns(3)P) (Raiborg et al., 2001) 。PtdIns(3)P是一種磷酸脂 (phospholipid) 通 常 出 現 於 膜 上 且 幫 助 蛋 白 質 運 輸 (protein trafficking) , 研 究 指 出 PtdIns(3)P也出現於自噬小體的膜上 (Simonsen et al., 2004; Simonsen et al., 2001) ,因此PtdIns(3)P和帶有FYVE-domain的HRS之間的相互作用有 可能參與自噬小體的調控過程。研究發現,HRS剔除細胞在營養條件充 足情況下,會導致影響自噬小體成熟化。線蟲有一種HRS同源性的蛋白 質,為CeVPS27 (Class E vacuolar protein-sorting) (Roudier et al., 2005) , 因此在RNAi干擾之下,CeVPS27嚴重不足而造成後期胞飲小體路徑被擋 住,最後作者推論說,自噬小體的形成,HRS並不是所必須的,可是失 去HRS卻會嚴重影響到自噬小體的成熟化 (Tamai et al., 2007)。. 19.

(28) 實驗目的. 在海洋生物中刺胞動物和共生藻的所建立的共生關係對於海洋生態 給予豐富的生態環境和繁雜的生物多樣性,但是所建立的共生機制並不 是很清楚。想進一步了解,當刺胞動物與共生藻所建立的共生關係一旦 瓦解,會走向哪個路徑。有可能是將共生藻給胞吐出去,還是行胞噬作 用降解共生藻,甚至走往自體吞噬的路徑,使宿主和共生藻從共生態轉 變為白化。在哺乳類動物的研究發現到 HRS 在哺乳類動物調控細胞內胞 飲小體及液泡蛋白質分類篩選 (Lloyd, et al., 2002) ,且參與自體吞噬的 成熟化過程 (Tamai, et al., 2007) 。因此計畫藉由研究 HRS 蛋白來探索海 洋刺胞動物與共生藻之胞内共生關係的分子調控。. 20.

(29) 第二章、材料與方法 2.1 動物培養 本研究以美麗海葵作為研究胞內共生關係的模式系統,原因是方便 取樣和容易飼養,且和珊瑚的親源關係非常接近。實驗室內飼養的美麗 海葵是從屏東東港水產試驗所取得,養於玻璃水族溫度為 27 度 C 左右, 是用光照時間 14 小時和黑暗時間 10 小時為週期;使用照度為 80~100 m-2s-1 的白光及藍光長型燈管。餵食豐年蝦卵,以海水和自來水一比一比 例來飼養,等待 24~36 小時的時間孵化。之後拿起打氣石再靜置半小時, 等待卵殼和豐年蝦幼蟲分離開來就可取出剛孵化的豐年蝦幼蟲來餵給美 麗海葵。以一個星期為基準來更換新鮮的海水,倒掉舊有三分之二的海 水再補給新鮮的海水進去。. 2.2 ApLC3 cDNA 部分片段的選殖與序列分析 藉由退化引子聚合酶連鎖反應 (degenerate polymerase chain reaction) 的實驗設計,來選殖到美麗海葵 ApLC3 蛋白質功能區序列中具有高度保 留的小片段序列。. 所使用的退化引子如下: LC3-F1 5’-GATCCCCGTGATCATCGA-3’ LC3-R2 (31 mers) 5’-GGGAGGCGTACACCATGTACARRAANCCRTC-3’. 21.

(30) 所添加的反應物濃度和條件如下: cDNA. 1 μl. ddH2O. 15.4 μl. Protaq 10x buffer. 2 μl. 2.5mM invitrogen dNTP. 1 μl. LC3-F1 primer (10μm). 0.25 μl. LC3-R2 primer (10um). 0.25 μl. Taq Plus DNA polymerases (5u/μL). 0.1 μl. --------------------------------------------------------------------20 μl. 所進行的 PCR 反應如下: 94 度 C. 2 分鐘. 94 度 C. 30 秒. 55 度 C. 30 秒. 72 度 C. 1.5 分鐘. 72 度 C. 5 分鐘. 4度C. ∞. 50 次循環. 藉由 PCR 儀器 (TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice,TP600) ,進行 PCR 反 應 , 反 應 完 成 後 的 PCR 產 物 由 瓊 膠 電 泳 (Agarose gel electrophoresis) 來進行分析。這期間過程中會將電泳跑完的瓊膠放入到. 22.

(31) 裝有 EtBr (Ethidium Bromide) 的容器來進行染色,而染有 EtBr 的瓊膠隨 即送到電泳膠影像分析儀 ( GE imageQuant 300) 。經由 UV 照射來看瓊 膠膠體呈現出核酸片段大小接近預期 210 bp,之後將核酸產物用核酸純 化套組 (PROTECH Gene-Spin. TM. 1-4-3 DNA Extraction Kit) 來進行純. 化。純化完的產物用 TA Cloning 系統( TOPO TA Cloning,invitrogen )來 進行選殖的過程。成功送到 TOPO TA Cloning 專屬的載體 (pCR-TOPO 2.1,invitrogen 附錄二) 上,之後再寄送載體給基龍米克斯公司進行定序 的行列。待公司回寄定序資料去 NCBI 網站上的 GeneBank 資料庫進行 比對確定載體上的鑲嵌進去的序列為相似於 LC3 的基因。. 2.3 ApLC3 重組蛋白的建構 為 了 生 產 出 ApLC3 重 組 蛋 白 , 將 送 到 載 體 (pCR-TOPO 2.1 , invitrogen) 上 ApLC3 的轉譯區 (coding region) 由 pET100/D-TOPO (附錄 三)(Champion pET Directional TOPO Expression Kits) 這套系統設計出的 引子透過 PCR 方式來放大。再經由膠體純化方式 (DNA extraction) 送到 pET100/D 載體進行表現,來產生 N 端 tag 帶有 6 個 Histidine 胺基酸的 ApLC3 重組蛋白。. 所設計的引子如下: pET100D-LC3-F1 5’- CACCGAGAGAGATCTACCCTTAC -3’ pET100D-LC3-R1 5’- TTCATCTTTTTCTTCTCTGTATA -3’. 23.

(32) 所添加的反應物濃度和條件如下: 模板 DNA. 2 μl. ddH2O. 29.5 μl. F518 5x phusion HF buffer. 10 μl. 2.5 mM invitrogen dNTP. 4 μl. pET100D-LC3 F1 primer (10 μM). 2 μl. pET100D-LC3 R1 primer (10 μM). 2 μl. F530S Phusion DNA polymerases. (2 u/µl). 0.5 μl. -----------------------------------------------------------------50 μl. 所進行的 PCR 反應如下: 98 度 C. 30 秒. 98 度 C. 10 秒. 55 度 C. 30 秒. 72 度 C. 30 秒. 72 度 C. 10 分鐘. 4度C. ∞. 35 次循環. 以載體 (pCR2.1-TOPO) 當作模板再針對表現載體 (pET100/D) 設 計出的引子,由 PCR 反應放大之後,利用核酸純化套組把載體和預期大 小核酸產物分離開,接著將純化好的核酸產物進行 ligation 的實驗送入. 24.

(33) pET100/D vector。從純化好的核酸產物取出 2 μl,此時加入鹽溶液 0.5 μl, 最後再加入配置好的 pET100/D 載體 0.5 μl,反應體積是 3 μl 於室溫下 作 用 5 分 鐘 。 將 ligation 產 物 插 在 冰 上 終 止 反 應 , 再 來 執 行 轉 形 (transformation) 的動作,將 ligation 產物和 DH5α 勝任細胞混合好於冰上 作 用 5 分 鐘 。 開 啟 水 浴 槽 42 度 C 下 30 秒 來 進 行 熱 休 克 反 應 (Heat-shock),迅速移動到冰上終止反應。加入 S.O.C (Super Optimal Broth,invitrogen) 200 μl 於 37 度 C 培養箱,轉速 200 rpm 的情況下進行 一小時的培養。最後於無菌操作台 (laminar flow) 下,把 LBA 培養基加 入震盪培養完後的勝任細胞,接著使用 L 型玻璃棒進行塗盤的動作。最 後將 LBA 培養基放於 37 度 C 培養 12~16 小時的時間,於隔天使用 colony PCR 技術確定是否為正接的序列 。檢測確定為正接的菌落送到液態 LBA (Luria broth ampicillin) 培養基於 37 度 C 培養箱培養 12~16 小時,於隔天 使用質體純化系統(PROTECH Gene-SpinTM –V2 Miniprep Purification Kit) 來抽取質體,送定序確認其結果。. 2.3.1 ApLC3 重組蛋白的表現與純化 將塞有 ApLC3 部分序列的 pET100/D 質體和 C43 (DE3) 勝任細胞進 行轉形的動作。隔天從長滿菌落的 LBA 菌落上挑選,養在含有液態 LBA 培養基的 5 ml 菌管內,放於 37 度 C 培養箱 12~16 小時,轉速 200 rpm。 拿取 400ml 的液態 LBA 培養基再加入 20 ml 隔天培養好的菌液 (稀釋 20 倍) ,於 37 度 C 培養箱震盪培養 2 小時,之後於分光光度儀 ( Thermo electron corporation HeλIOSγ ) 測 O.D.600 = 0.6 以上。養好的 500ml 菌液. 25.

(34) 加入 5 ml 的 0.1 M IPTG. (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) (最後. IPTG 濃度是 1 mM) ,於 37 度 C 培養箱,轉速 200 rpm,誘導四小時 (控 制組不加 IPTG 也一同培養於相同條件下) 。誘導完後,離心 10000 rpm, 5 分鐘,倒掉上清液後再收集菌塊於 -20 度 C 冰箱保存。冷凍過後的菌 塊加入 6 ml 1x Ni-NTA binding buffers (300 mM, 50 mM sodium phosphate buffer, 10 mM imidazole, pH 8.0) 使之溶解並且混合均勻,於超音波機器 進行破菌。破菌完後,於 4 度 C 離心 10000 rpm,30 分鐘。 在離心過程中,取出 2 ml resin 加入 8 ml 1x Ni-NTA binding buffer (1 比 4 的比例),vortex 混合好插在冰上靜置一段時間讓 resin 可以沉澱下 來,接下來就小心的倒掉上清液體。拿出 20 ml 針管再加裝 0.45 μm filters 把 4 度 C 離心好的上清液通過濾膜打到裝有 resin 的 15 ml 離心管。Vortex 混合好,將離心管與保冰袋綁在一起,於 4 度 C 作用 1 小時。鎳管柱架 備好之後,將離心管內的液體加入到管柱內,隨著重力和時間慢慢地滴 出 , 此 時 收 集 下 來 的 第 一 管 標 記 為 flow-thruogh , 保 留 下 來 可 以 跑 SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳) 做分析。加入 1x Ni-NTA washing buffer (300 mM NaCl, 50 mM imidazole, 20 mM sodium phosphate buffer, pH 8.0) ,洗滌五次 (3 ml/次) 將雜質和親合力較弱的蛋 白質給沖洗掉,再加入 1 ml 的 Elution buffer (300 mM NaCl, 250 mM imidazole, 50 mM sodium phosphate buffer, pH 8.0) 將 ApLC3 的重組蛋白 收集下來。. 2.4 蛋白質定量. 26.

(35) 將純化下來蛋白質取出 10 μl,使用 Bio-rad protein assay Reagent (Bradford Protein Concentration Assay)方法來進行蛋白質定量,這是一種 常使用來測量蛋白質濃度的簡易測量方式。這蛋白質染劑是 Coomassie G-250 dye 與蛋白質互相結合會呈現藍色色澤,於波長 595 nm 可測得蛋 白質的吸光殖。首先在分光光度儀先設定波長 595 nm,進入到 standards 區依據 BSA (bovine serum albumin) 的濃度依序輸入:0 、5、10、15、 20 和 25 μg/mL 這六組數據,最後設定” y = ax + b ” y = 波長 595 nm 而 x =蛋白質濃度的標準曲線下去推算重組蛋白質含量。. 2.4.1 十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 歸類為膠體電泳的一環,主要是依據蛋白質分子量的不同在電泳跑的過 程中,隨著時間而慢慢分離開來是一種常用的蛋白質分析技術。在製備 SDS-PAGE 首先拿出專用的凝膠玻璃厚的兩片、薄的兩片噴灑 95 %酒精 使用拭鏡紙擦拭乾淨。將厚、薄的玻璃片用綠色的玻璃夾板固定住,移 動到架膠器上之後再於架膠器的放上堵漏海綿。於厚和薄的玻璃片中間 縫隙處加入 RO 水,補滿之後觀察是否底部會有漏水的情況。把水倒掉 之後用濾紙吸乾,開始置備 14 % 下層膠 (separating gel)。. 14 % 下層膠成分如下: ddH2O. 3.7 ml. 1.5M Tris (pH8.8). 2.5 ml. 27.

(36) 10 % SDS. 100 μl. 40% acryl-bisacryamide. 3.5 ml. 10 % ammonium persulphate. 100 μl. TEMED. 4 μl. ---------------------------------------------------10 ml 最後要加入 TEMED 的時候,要先將其他藥品於試管內混合均勻在 加入 TEMED。以免造成凝膠過程中由於藥品沒有充分混好而造成失敗。 之後將配置好未凝固的下層膠倒入玻璃片的隙縫中,再加入壓膠劑 (正 丁醇)促使膠面平整不會有參差不齊的感覺。等待凝固時間 1~2 小時左 右,用 RO 水把正丁醇給沖洗掉,就可以來配置 5 % 上層膠 (stacking gel) 。 5 % 上層膠成分如下: ddH2O 1.5M Tris (pH8.8) 10 % SDS 40% acryl-bisacryamide. 1.445 ml 250 μl 20 μl 255 μl. 10 % ammonium persulphate. 20 μl. TEMED. 2 μl. ---------------------------------------------------2 ml 將配置好未凝固的上層膠倒入下層膠的上方並插入齒梳,等待凝固. 28.

(37) 時間 1~2 小時左右。拔掉齒梳,把凝固好的膠片插入到 SDS-PAGE 的電 泳槽裝置上,倒入 1x running buffer (14.41 g、glycine、3.03 g Tris 和 1 g SDS 溶解於 1 公升的 ddH2O 中) 。將樣品從冰箱拿出等待退冰,以 1 比 1 方 式加入 2 倍的 SDS loading dye 充分混合好,拿到沸水區煮沸 5 分鐘,再 放到離心機高轉速離心 14000rpm,5 分鐘。從膠片凹陷處加入適量的樣 品,組裝 SDS-PAGE 電泳槽儀器。設定 150 伏特,時間為 70 分鐘左右。 剛開始起跑可以注意是否有沒有氣泡產生,無的話可能沒有通電。再來 就是看染劑有沒有從凹陷處往上跑的情形,有的話可能是正負電極插成 反向的結果。等待染劑跑到 SDS-PAGE 底部之外,就可關掉電源。裝置 卸除之後,小心翼翼把膠片從兩片玻璃片中打開並取出膠片來進行轉印 動作。. 2.4.2 西方點墨法 取出 1~2 隻海葵先用擦手紙吸乾大部分的黏液和海水,加入海葵體 積 2~3 倍預冷的均質液 ( Homogenization buffer,40 mM Tris,10 mM EDTA,0.5 M sucrose,pH7.4 ) 。均質液會加入適當濃度蛋白質分解酶抑 制劑 (Roche) 。使用組織均質機 (Hsiangtia Homogenizer) 來打散海葵打 五秒停三秒,當海葵細胞液體呈現成棕色狀態就可以停,全程步驟都在 冰上操作。將海葵細胞液於轉速 1000 g、4 度 C 下離心 1 分鐘,留下上 清液重複三次以上的離心動作。之後提高轉速到 2000 g、4 度 C 下離心 5 分鐘,不斷地重複此步驟來完全去除細胞碎片和共生藻,就可以得到美 麗海葵的總蛋白 (total proteins) 。美麗海葵的總蛋白經由超高速離心. 29.

(38) 100,000 g,4 度下,16 小時,分成美麗海葵的膜蛋白和可溶性蛋白 (soluble proteins) 。分別拿出美麗海葵總蛋白 (20μg) 、可溶性蛋白 (20μg) 和 ApLC3 重組蛋白 (20μg) ,來進行蛋白質電泳分析 (14 % SDS-PAGE, 150 伏特和 70 分鐘) 。 SDS-PAGE 進行時,可以先去準備 4 度 C 預冷的 1x transfer buffer (2.9 g glycine,5.8 g Tris,0.37 g SDS 和 200 ml 甲醇,補 RO 水到一公升) 。 然後可以去裁剪和膠片大小一樣的 PVDF 膜 (Millipore) ,浸泡在甲醇清 洗掉膜上的油脂。當膠片跑完之後可以和 PVDF 膜一同放到 1x transfer buffer 潤洗 15 分鐘,將海綿墊、濾紙、膠片和 PVDF 膜一同泡在含有 1x transfer buffer 容器內,使用鑷子依序堆疊起來再用夾板固定住之後放到 架槽上。此時使用全濕式轉漬系統 (BIO-RAD) 進行轉印過程中要注意 電壓正極和負極的方向,最後打開電源設定機器 200 mA,時間 60 分鐘。 轉印過後的 PVDF 膜放入 block solution (5 %. non-fat milk,0.05 %. Tween-20 和 1x TBS) 於室溫下作用 1~2 小時,再放到 4 度 C 冰箱作用 到隔夜。加入一抗 rabbit anti-LC3 (MBL polyclonal antibody) 以 1:1000 和 rat anti-ApHRS serum 以 1:5000 (稀釋於 0.05 % Tween-20 於 1x TBS),作用一小時。以 1x washing buffer (0.05 % Tween-20 於 1x TBS) 洗 5 次,10 分鐘/次數。加入二抗 HRP-conjugated goat anti-rat 和 goat anti-rabbit 用 1:10000 (稀釋液 0.05 % Tween-20 於 1x TBS 中) ,作用 一小時。以 1x washing buffer (0.05 % Tween-20 於 1x TBS) 洗 5 次,10 分 鐘 / 次 數 。 加 入 化 學 冷 光 顯 影 劑 (chemiluminescent HRP substrate solution,Millipore) 有兩大罐,取出適合的量一比一比例混合好之後加. 30.

(39) 到膜上,以冷光影分析儀 (Fujifilm, LAS-3000) 來進行偵測。. 2.5 免疫螢光染色 將美麗海葵使用解剖刀對切一半,放置到調配好的酸固定液來固定 海葵 10 分鐘。打散內胚層細胞,並鋪於玻片在風乾,使細胞固定在 poly-L-lysine 玻片上。(多鋪一片作為控制組,控制組這片玻片只加二抗 抗體) 加 95 %藥用酒精來去色,作用十五分鐘,並用 1x PBS 洗三次,五 分鐘/次數。加入 blocking solution (5 % BSA 的 1x PBST) 於室溫之下作 用一小時。加入一抗 rat anti-ApHRS serum 和 rabbit anti-LC3 稀釋比例為 1:100,作用一個小時。加入 0.1 % Triton X - 100 的 1x PBS 洗三次,五 分鐘/次數。加入二抗 cy3-conjugated goat anti-rat IgG 和 anti-rabbit IgG. 以. 1:400 稀釋濃度,作用一個小時。加入 0.1% Triton X - 100 的 1x PBS 洗 三次,五分鐘/次數。最後加入 H33258 染核,使用封片膠加入含有細胞 的玻片面,用鑷子輕輕夾起蓋玻片緩慢蓋上於三天內觀察。而觀察細胞 是使用配有 FITC 濾片裝置和數位攝影系統 (EvolutionTM VF COOLED COLOR, MediaCybernatics) 的 Nikon EXLIPSE E400 顯微鏡來觀測。. 2.5.1 玻片製備 拿出玻片、兩組玻片夾和三盒玻璃染缸。三盒染缸都加入 70 % 酒 精七分滿,加上 5~6 滴稀鹽酸。玻片分次加到染缸上,每次泡 5 分鐘。 浸泡好放於烘箱 (50 度 C~60 度 C) ,到烘乾為止。烘乾的玻片加入 1 % poly-L-lysine (sigma P8920) ,浸泡一分鐘再放到通風處風乾。. 31.

(40) 2.5.2 酸固定液的製備 Acetic acid. 1. Glycerol. 1. Seawater. 13 3. : 3. :. 39. 共 45 ml. 2.6 DCMU 處理作用 DCMU ( 3- ( 3,4-dichlorophenyl ) -1,1-dimethylurea ) 是光合作用抑制 劑以 DCMU 傷害到美麗海葵和共生藻來進行免疫螢光染色分析。先將濃 度為 0.1 M 的 DCMU 和海水混合稀釋成作用濃度 (4~5 μM) ,把美麗海 葵放置配好的溶液內處理 10 分鐘、30 分鐘、60 分鐘和 120 分鐘時間, 之後將海葵用酸固定液固定之後用 ApHRS 抗體染色,以重複三次來執行 免疫螢光染色分析。. 2.7 吞噬作用 先將酵母菌培養於含有 YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) 培養液 的瓊膠平板 (agar plate) ,挑選出單一顆酵母菌的菌落於每一管含有 5 ml 的 YPD 培養液裡面大量培養。培養 2~3 天,把菌管放置到離心機 (KUBOTA 3700) 用 5000rpm 離心五分鐘,倒掉上清液再取出酵母菌的 pellets。利用計數型玻片計算出至少每 μl 要有 107 顆酵母菌才能餵食到美 麗海葵的胃腔內進行此實驗。分別以 10 分鐘、30 分鐘、60 分鐘和 120. 32.

(41) 分鐘這四個不同時間點餵食給海葵,以重複三次來執行免疫螢光染色分 析。. 2.8 移除酵母菌反應性抗體之酵母菌餵食實驗 把培養好的酵母菌用 5000 rpm,離心 5 分鐘。去上清液留下酵母菌 的 pellets。一管 5 ml 會取得 100 μl pellets 用酸固定液固定 10 分鐘,離心 3 分鐘,5000 rpm。去上清液,留下 pellets。用 1x PBS 清洗三次,同樣 也是離心 3 分鐘,5000 rpm。去上清液,留下 pellets 重複三次。將 blocking solution 500 μl 分別加到兩管中,常溫下作用一小時。一管以 1:25 抗體 稀釋比 (rat anti-ApHRS serum) 加進去,常溫下作用一小時。將有加入抗 體的混合液離心 5000 rpm,3 分鐘。取出含有抗體上清液 500 μl,加到另 一管有 blocking solution + yeast pellets 混合好於 4 度 C 冰箱作用反應到 隔天。後半段同樣以重複三次來執行酵母菌餵食實驗之免疫螢光染色法。. 2.9 二重染色法 利用 rabbit anti-ApRab5 (Santa Cruz,A-20)、rabbit anti-ApRab7 (Santa Cruz,H-50) 、 mouse anti-ubiquitinylated proteins (Millipore) 、 rabbit anti-ApRab3 (實驗室自製)和 rabbit anti-ApLC3 (MBL) 這五種一抗分別和 rat anti-ApHRS 抗體配對進行 double staining (二重染色法)。海葵對切, 放於酸固定液固定 10 分鐘。打散海葵細胞,並鋪於 poly-L-lysine 玻片在 風乾,使細胞固定在玻片上。加 95 %藥用酒精去色,作用二十分鐘,用 1x PBS 洗兩次。加入 blocking solution (5 % BSA,1x PBST) 於室溫下作. 33.

(42) 用一小時。加入一抗 rat anti-ApHRS 以 1:100 和 rabbit anti-ApRab5 以 1: 30,一抗 rat anti-ApHRS 以 1:100 和 rabbit anti-ApRab7 以 1:30,加入 一抗 rat anti-ApHRS 以 1:25 和 mouse anti-ubiquitinylated proteins 以 1: 100,加入一抗 rat anti-ApHRS 以 1:50 和 rabbit anti-ApRab3 以 1:30, 加入一抗 rat anti-ApHRS 以 1:100 和 rabbit anti-ApLC3 以 1:100 各別 這五組於室溫下作用一小時。加入 0.1% Triton X - 100 的 1x PBS 洗三次, 五分鐘/次數。加入二抗 cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG 用 1:600 (標 定 ApRab5) 和 Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG 用 1:400 (標定 ApHRS) ,加入二抗 cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG 用 1:600 (標定 ApRab7) 和 Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG 用 1:400 (標定 ApHRS), 加入二抗 cy3-conjugated goat anti-mouse IgG 用 1:300 (標定 ubiquitinylated proteins) 和 Dylight 488 goat anti-rat IgG 用 1:200 (標定 ApHRS) ,加入 二抗 cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG 用 1:400 (標定 ApRab3) 和 Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG 用 1: 200 (標定 ApHRS),加入二抗 cy3-conjugated goat anti-rabbit cy3 IgG 用 1:400 (標定 ApLC3) 和 Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG 用 1:200 (標定 ApHRS)各別這五組於室溫 下作用一小時。用 0.1% Triton X - 100 的 1x PBS 洗三次,五分鐘/次數。 H33258 染色,封片並觀察。. 2.10 以 biotin 標定海葵內胚層細胞表面 取出海葵等到完全展開,加入海水 (4 度 C , pH 8.0) 於胃腔之中清洗 三次,把多餘黏液及蛋白質去除。加入 1 mg/ml Sulfo-NHS-LC-Biotin. 34.

(43) reagent (PIERCE) (~2 mM) 會分裝成一管 0.1ml (共有十小管,1.5 ml eppendrof) ,取 0.05 ml 餵食到海葵的胃腔內,放到 4 度 C 冰箱作用 15 分鐘。之後從冰箱把海葵取出來先加入 seawater + 100 mM glycine,等比 例混合海水,洗掉過多的 biotin reagent products 再放到正常水溫的海水, 使海葵身體回溫 30 分鐘。海葵對切,放到酸固定溶液內固定 10 分鐘。 打散海葵細胞,並鋪於 poly-L-lysine 玻片在風乾,使細胞固定在玻片上。 加 95 %藥用酒精去色,作用二十分鐘,用 1x PBS 洗兩次。加入 blocking solution (5 % BSA,1x PBST) 於室溫下作用一小時。加入一抗,比例分 別為 rat anti-ApRab4 以 1:50、rabbit anti-Rab5 (Santa Cruz,A-20) 以 1:50 和 rat anti-ApHRS 以 1:100,於室溫下作用一小時。加入 0.1% Triton X - 100 的 1x PBS 洗三次,五分鐘/次數。加入二抗 cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG 用 1:400 (標定 ApRab5),cy3- conjugated goat anti-rat IgG 用 1:400 (標定 ApRab4 和 ApHRS) 。同時也加入 Alexa Fluro 488 conjugate avidin (2 mg/ml 加入甘油,分裝成 0.1 ml eppendrof 1.5 ml 內) ,1:2000 (稀釋於 5% BSA and 0.1%Triton X-100 in 1XPBS) ,於室溫下作用一小時。加入 0.1% Triton X - 100 的 1x PBS 洗三次,五分鐘/次數。H33258 染核,封片並觀 察。 * 實驗中所使用的藥劑的廠牌與貨號,請參考附錄一。. 35.

(44) 第三章、結果 3.1 Anti-ApHRS 抗體的專一性測試 (Western blot analysis) 將實驗室先前已選殖的部分 ApHRS cDNA (圖 1.) ,再次選殖到原 核表現載體 pET 中,利用大腸桿菌來大量生產帶有組胺酸標籤的 ApHRS 重組蛋白。利用鎳親合管柱純化好的 ApHRS 重組蛋白,藉由注射實驗送 到大鼠體內,因此得到抗 ApHRS 的抗血清。此抗血清在西方點墨分析中 能與重組 ApHRS 蛋白強烈作用。取出製備好的美麗海葵 total proteins ( 1.77 μg/μl )和 soluble proteins ( 1.35 μg/μl ) 當作測試的樣品。一抗 rat anti-ApHRS 的稀釋條件為 1:5,000,二抗 HRP-conjugated goat anti-rat IgG 的稀釋條件為 1:10,000。結果顯示,在 ApHRS 一抗血清測試之下在美 麗海葵 total proteins 和 soluble proteins 偵測到 17 kDa 和 28 kDa 左右兩條 蛋白質訊號 (圖 2.) 。由於已知的各物種的 HRS 蛋白大小介於 49.7~97 kDa 之間,此結果並不符合預期,這可能是由於 ApHRS 蛋白極易遭到降 解的緣故。. 3.1.1 海葵細胞的免疫螢光染色 (共生小體染上的百分比) 為了探討 ApHRS 是否與在美麗海葵及共生藻的胞內共生關聯性,利 用免疫螢光染色技術來進行分析。將海葵組織打散舖於玻片上,加入一 抗 rat anti-ApHRS 稀釋條件為 1:100 和二抗 cy3-conjugated goat anti-rat IgG 稀釋條件為 1:400。然後將製備好的玻片放到螢光顯微鏡下觀察發 現到,不管是其他的海葵細胞或是和宿主細胞 (含有包著共生藻) ,於細. 36.

(45) 胞質內都可以觀察到明顯的點狀訊號,並且在宿主細胞內也發現到有一 圈環形的螢光訊號圍繞在共生小體的周圍 (圖 3.) 。為了檢測是否為二抗 抗體非專一性的結合所產生螢光訊號,又執行的二抗控制組實驗。在不 加一抗 rat anti-ApHRS,只加二抗 cy3-conjugated goat anti-rat 的實驗條件 下來觀察。發現到美麗海葵宿主細胞的細胞質和共生小體的周圍都沒有 訊號產生(圖 3.) 。因此,前述於海葵細胞內所觀察到的螢光訊號 (包括 點狀螢光訊號和圍繞共生小體的環狀螢光訊號) ,確實來自 anti-ApHRS 抗血清與特定海葵蛋白質作用的結果。在上述之免疫螢光染色條件下, 平均約有 45 %的共生小體被 anti-ApHRS 抗血清所染上。此結果暗示 ApHRS 有可能參與海葵-渦鞭毛藻胞內共生的調控。. 3.1.2 海葵細胞的免疫螢光染色 (DCMU 處理的結果) 為了探索共生渦鞭毛藻在 anti-ApHRS 抗血清標記共生小體上的角 色,使用 DCMU 藥劑 ( 3- ( 3,4-dichlorophenyl ) -1,1-dimethylurea ) 來處 理美麗海葵。DCMU 是一種光合作用抑制劑,會破壞葉綠體光合系統 II 的正常功能,而導致自由基的產生與累積進而傷害共生藻,而破壞共生 藻和美麗海葵所建立的共生關係。 依據不同時間點加入 DCMU,藉著使用免疫螢光染色來觀察包著共 生藻的共生小體上,ApHRS 免疫螢光訊號的出現比例的趨勢會是如何 (圖 4.) 。於 0 分鐘 (未加 DCMU) ,具有 ApHRS 免疫螢光訊號的共生小 體的比例有 44 %,然而隨著處理時間點到 30 分鐘和 60 分鐘,此比例下 降了一半 (22 %) 。若處理延長到 120 分鐘的時候,此比例又回升到 35. 37.

(46) %。此實驗執行了三次,各個時間點的平均值為,DCMU 處理 0 分鐘是 44 %,30 分鐘為 31 %,30 分鐘為 23 %,60 分鐘為 24 %和 120 分鐘為 35 %。以整體趨勢來說, ApHRS 於早期時間點會分佈於共生小體上, 之後加入 DCMU 藥效發揮作用而傷害到共生藻本體時於中期和晚期這間 段有一半以上的 ApHRS 離開共生小體身上,最後在晚期後半段時間又跑 回來共生小體的膜上。此結果顯示共生渦鞭毛藻在 anti-ApHRS 抗血清標 記共生小體上的角色為控制 ApHRS 於早期和晚期時間點上去共生小體 的膜上。. 3.2 ApHRS 的二重染色分析 藉由免疫螢光染色法觀察到美麗海葵細胞內確實有內生性 ApHRS, 接下來想了解 ApHRS 會坐落於美麗海葵細胞內的哪些胞器上。使用實驗 室先前研究過的 Rab 蛋白 (包括 ApRab5、ApRab7、和 ApRab3) 當作胞 器 marker,來和 ApHRS 執行二重免疫螢光染色實驗。ApRab3 於先前實 驗 室 發 現 它 會 出 現 於 胞 吐 作 用 (exocytosis) 的 過 程 中 (Hong et al., 2009a),所以也作為一種胞器 marker。另外文獻指出,在哺乳類細胞中, HRS 會參與泛素 (Ubiquitin, Ub) 標定的蛋白質降解的過程 (Raiborg and Stenmark, 2002),因此也以 anti-ubiquitin 抗體進行二重染色實驗,來觀 察 ApHRS 是否可能參與泛素調控的蛋白質降解作用。 從 ApRab5 和 ApHRS 的二重染色從結果來看,於美麗海葵宿主細胞 內,不管是在細胞質和共生小體周圍都同樣有染上 ApRab5 和 ApHRS 的 免疫螢光訊號,可是當重疊圖片於,卻鮮少發現到 ApRab5 和 ApHRS 的. 38.

(47) 免疫螢光訊號有同時坐落在一起 (圖 5.) 。ApRab7 和 ApHRS 的二重染 色,情形也類似如此 (圖 6.) 。Ub-proteins 和 ApHRS 的二重染色發現到 Ub-proteins 和 ApHRS 有少部分的訊號同時出現在一個胞器上 (圖 7.) 。 ApRab3 和 ApHRS 的二重染色結果顯示,ApRab3 和 ApHRS 有不少的訊 號出現在同一個胞器上;尤其是共生小體的周圍附近,重疊的現象很明 顯 (圖 8.) 。由此可知 ApHRS 和 ApRab5,ApHRS 和 ApRab7,ApHRS 和 ApRab3 於共生小體膜上和細胞質內的胞器多少都有共分佈的情形, 但是 ApHRS 和 ApRab3 共分佈的情形最為明顯。此分佈顯示有可能 ApHRS 坐落於 ApRab3 所在胞器上。. 3.2.1 以 biotin 標定海葵內胚層細胞表面的實驗分析 美麗海葵胃腔表面 apical surface 上有很多蛋白質帶有 primary amine (一級胺) 會和加入 Sulfo-NHS-LC-Biotin reagent 產生反應形成醯胺鍵 (amide bond)。於 4 度 C 下操作 biotin 標定反應後,將海葵放到室溫下回 溫以啟動執行胞飲作用動作,來將 biotin 所標定的表面蛋白送到胞飲小 體 (endocytic vesicles) 。此時將海葵細胞固定並打散舖於玻片上,先加 入一抗分別為 rat anti-ApRab4. (1:50 稀釋) 、rabbit anti-ApRab5. (1:. 50 稀釋) 和 rat anti-ApHRS (1:100 稀釋) ,之後再加入二抗 cy3-conjucated goat anti-rabbit IgG 稀釋比為 1:400 anti-rat IgG 稀釋比為 1:400. (標定 ApRab5) ,cy3-conjucated goat. (標定 ApRab4 和 ApHRS) ,同時再加入. Alexa Fluro 488 conjugate avidin 稀釋比為 1:2000。這時候 avidin 會和 biotin 有很強的親合力而結合在一起形成 protein-biotin-avidin-A488 複合. 39.

(48) 物,於螢光顯微鏡下便可加以觀察 cell surface-bound biotin 在細胞回溫 後,經由胞飲作用進入細胞內部後,是否和 ApRab5,ApRab4 或 ApHRS 的免疫訊號座落於相同的胞飲小體上。因為 ApRab5 和 ApRab4 會出現早 期的胞飲小體上 (Chen, et al., 2004; Hong et al., 2009b) ,可作為辨識 biotin-labeled endocytic vesicles 是否為早期胞器的依據。 從 biotin-avidin 所標定的蛋白質和 ApRab5 免疫螢光的結果來看,於 回溫 20 和 30 分鐘後,那些被 biotin-labeled endocytic vesicles 上,有一部 分含有 ApRab5 的免疫螢光訊號 (圖 9.) 。從 biotin-avidin 所標定的蛋白 質和 ApRab4 免疫螢光的結果來看,於回溫 30 分鐘後那些被 biotin-labeled endocytic vesicles 上,少部分含有 ApRab4 的免疫螢光訊號 (圖 10.) 。從 biotin-avidin 所標定蛋白質和 ApHRS 免疫螢光的結果來看,於回溫 30 分 鐘後那些被 biotin-labeled endocytic vesicles 上,幾乎都沒有 ApHRS 的免 疫螢光訊號 (圖 11.) 。從結果得知 ApRab5 和 ApRab4 是坐落於早期時期 的胞飲小體上,可是 ApHRS 卻沒有座落在 biotin-labeled endocytic vesicles 早期胞器上。. 3.2.2 ApHRS 出現在不同時期的 yeast-containing phagosomes 的 比例 為 了 探 究 ApHRS 是 否 參 與 胞 噬 小 體 熟 成 作 用 (phagosome maturation) ,因而進行了吞噬作用分析 (phagocytosis assay) 。在進行酵 母菌餵食實驗的初期有觀察到,直接拿酵母菌鋪在 poly-L-lysine 的玻片 上執行 ApHRS 免疫螢光染色,酵母菌本身會有很高的比例出現 ApHRS. 40.

(49) 螢光訊號 (結果未顯示) 。這表示 rat anti-ApHRS 抗血清中含有某些抗 體,會和我們所使用的酵母菌結合。因此先執行移除酵母菌反應性抗體 (depletion of yeast-reacting antibodies) ,把酵母菌和 rat anti-ApHRS 抗血 清混合作用一段時間,讓處理後的抗血清幾乎不會再辨識到酵母菌,而 只會專一性認到 ApHRS 蛋白質。再將移除酵母菌反應性抗體後的 rat anti-ApHRS 抗血清拿來進行海葵細胞的免疫螢光染色實驗,經過處理的 一抗血清只會專一性的認到 消化細胞 內包著酵母菌的胞噬小體膜 上 ApHRS,而幾乎完全不會辨識到酵母菌本體上。 實驗結果發現,只染酵母菌的話,很明顯於游離的酵母菌周圍沒有 很明亮的 ApHRS 螢光訊號 (圖 12.) 。而染包著酵母菌的海葵消化細胞, 在細胞質的部分有看到點狀螢光訊號,而且在包著酵母菌的胞噬小體外 圍有一圈明亮的訊號 (圖 12.) 。然而包著共生藻的宿主細胞也發現到細 胞質內有一顆酵母菌於其中,且在共生小體和包著酵母菌的胞噬小體周 圍也發現到 ApHRS 螢光訊號的分佈。那些沒有被細胞吞食的酵母菌,經 由免疫螢光染色發現到,酵母菌周圍沒有點狀訊號分佈的情形 (圖 12 H、I、J) 。 依據不同時間點餵食酵母菌來進行吞噬作用分析,然後利用免疫螢 光染色來觀察包著酵母菌的胞噬小體膜上具有 ApHRS 免疫螢光訊號的 比例 (圖 13.) 。在餵食 10 分鐘後,胞噬小體上的 ApHRS 的分佈比例有 44 %,然而隨著餵食時間延長到 30 分鐘,此比例下降到 17 %。之後再 於 120 分鐘再餵食酵母菌發現到,此比例又回升到 47 %。此實驗執行了 三次,各個時間點的平均值為,酵母菌餵食 10 分鐘是 44 %,30 分鐘為. 41.

參考文獻

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