動物培養

第二章、材料與方法

2.1 動物培養

本研究以美麗海葵作為研究胞內共生關係的模式系統，原因是方便取樣和容易飼養，且和珊瑚的親源關係非常接近。實驗室內飼養的美麗海葵是從屏東東港水產試驗所取得，養於玻璃水族溫度為 27 度 C 左右，

是用光照時間 14 小時和黑暗時間 10 小時為週期；使用照度為 80~100 m^-2s^-1的白光及藍光長型燈管。餵食豐年蝦卵，以海水和自來水一比一比例來飼養，等待 24~36 小時的時間孵化。之後拿起打氣石再靜置半小時，

等待卵殼和豐年蝦幼蟲分離開來就可取出剛孵化的豐年蝦幼蟲來餵給美麗海葵。以一個星期為基準來更換新鮮的海水，倒掉舊有三分之二的海水再補給新鮮的海水進去。

2.2 ApLC3 cDNA 部分片段的選殖與序列分析

藉由退化引子聚合酶連鎖反應 (degenerate polymerase chain reaction) 的實驗設計，來選殖到美麗海葵 ApLC3 蛋白質功能區序列中具有高度保留的小片段序列。

所使用的退化引子如下：

LC3-F1 5’-GATCCCCGTGATCATCGA-3’

LC3-R2 (31 mers) 5’-GGGAGGCGTACACCATGTACARRAANCCRTC-3’

所添加的反應物濃度和條件如下：

裝有 EtBr (Ethidium Bromide) 的容器來進行染色，而染有 EtBr 的瓊膠隨即送到電泳膠影像分析儀 ( GE imageQuant 300) 。經由 UV 照射來看瓊膠膠體呈現出核酸片段大小接近預期 210 bp，之後將核酸產物用核酸純化套組 (PROTECH Gene-Spin ^TM 1-4-3 DNA Extraction Kit) 來進行純化。純化完的產物用 TA Cloning 系統( TOPO TA Cloning，invitrogen )來進行選殖的過程。成功送到 TOPO TA Cloning 專屬的載體 (pCR-TOPO 2.1，invitrogen 附錄二) 上，之後再寄送載體給基龍米克斯公司進行定序的行列。待公司回寄定序資料去 NCBI 網站上的 GeneBank 資料庫進行比對確定載體上的鑲嵌進去的序列為相似於 LC3 的基因。

2.3 ApLC3 重組蛋白的建構

為了生產出 ApLC3 重組蛋白，將送到載體 (pCR-TOPO 2.1 ， invitrogen) 上 ApLC3 的轉譯區 (coding region) 由 pET100/D-TOPO (附錄三)(Champion pET Directional TOPO Expression Kits) 這套系統設計出的引子透過 PCR 方式來放大。再經由膠體純化方式 (DNA extraction) 送到 pET100/D 載體進行表現，來產生 N 端 tag 帶有 6 個 Histidine 胺基酸的 ApLC3 重組蛋白。

所設計的引子如下：

pET100D-LC3-F1 5’- CACCGAGAGAGATCTACCCTTAC -3’

pET100D-LC3-R1 5’- TTCATCTTTTTCTTCTCTGTATA -3’

所添加的反應物濃度和條件如下：

pET100/D vector。從純化好的核酸產物取出 2 μl，此時加入鹽溶液 0.5 μl，

最後再加入配置好的 pET100/D 載體 0.5 μl，反應體積是 3 μl 於室溫下作用 5 分鐘。將 ligation 產物插在冰上終止反應，再來執行轉形 (transformation) 的動作，將 ligation 產物和 DH5α 勝任細胞混合好於冰上作用 5 分鐘。開啟水浴槽 42 度 C 下 30 秒來進行熱休克反應 (Heat-shock)，迅速移動到冰上終止反應。加入 S.O.C (Super Optimal Broth，invitrogen) 200 μl 於 37 度 C 培養箱，轉速 200 rpm 的情況下進行使用質體純化系統(PROTECH Gene-Spin^TM –V² Miniprep Purification Kit) 來抽取質體，送定序確認其結果。 electron corporation HeλIOSγ ) 測 O.D.600 = 0.6 以上。養好的 500ml 菌液

加入 5 ml 的 0.1 M IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) (最後 IPTG 濃度是 1 mM) ，於 37 度 C 培養箱，轉速 200 rpm，誘導四小時 (控制組不加 IPTG 也一同培養於相同條件下) 。誘導完後，離心 10000 rpm，

5 分鐘，倒掉上清液後再收集菌塊於 -20 度 C 冰箱保存。冷凍過後的菌塊加入 6 ml 1x Ni-NTA binding buffers (300 mM, 50 mM sodium phosphate buffer, 10 mM imidazole, pH 8.0) 使之溶解並且混合均勻，於超音波機器 imidazole, 50 mM sodium phosphate buffer, pH 8.0) 將 ApLC3 的重組蛋白收集下來。

2.4 蛋白質定量

將純化下來蛋白質取出 10 μl，使用 Bio-rad protein assay Reagent (Bradford Protein Concentration Assay)方法來進行蛋白質定量，這是一種常使用來測量蛋白質濃度的簡易測量方式。這蛋白質染劑是 Coomassie

SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 歸類為膠體電泳的一環，主要是依據蛋白質分子量的不同在電泳跑的過

10 % SDS 100 μl

時間 1~2 小時左右。拔掉齒梳，把凝固好的膠片插入到 SDS-PAGE 的電泳槽裝置上，倒入 1x running buffer (14.41 g、glycine、3.03 g Tris 和 1 g SDS 溶解於 1 公升的 ddH₂O 中) 。將樣品從冰箱拿出等待退冰，以 1 比 1 方 EDTA，0.5 M sucrose，pH7.4 ) 。均質液會加入適當濃度蛋白質分解酶抑制劑 (Roche) 。使用組織均質機 (Hsiangtia Homogenizer) 來打散海葵打

100,000 g，4 度下，16 小時，分成美麗海葵的膜蛋白和可溶性蛋白 (soluble 到隔夜。加入一抗 rabbit anti-LC3 (MBL polyclonal antibody) 以 1：1000 和 rat anti-ApHRS serum 以 1：5000 (稀釋於 0.05 % Tween-20 於 1x

到膜上，以冷光影分析儀 (Fujifilm, LAS-3000) 來進行偵測。用一小時。加入一抗 rat anti-ApHRS serum 和 rabbit anti-LC3 稀釋比例為 1：100，作用一個小時。加入 0.1 % Triton X - 100 的 1x PBS 洗三次，五分鐘/次數。加入二抗 cy3-conjugated goat anti-rat IgG 和 anti-rabbit IgG 以 1：400 稀釋濃度，作用一個小時。加入 0.1% Triton X - 100 的 1x PBS 洗三次，五分鐘/次數。最後加入 H33258 染核，使用封片膠加入含有細胞的玻片面，用鑷子輕輕夾起蓋玻片緩慢蓋上於三天內觀察。而觀察細胞是使用配有 FITC 濾片裝置和數位攝影系統 (Evolution^TMVF COOLED COLOR, MediaCybernatics) 的 Nikon EXLIPSE E400 顯微鏡來觀測。

2.5.1 玻片製備

拿出玻片、兩組玻片夾和三盒玻璃染缸。三盒染缸都加入 70 % 酒精七分滿，加上 5~6 滴稀鹽酸。玻片分次加到染缸上，每次泡 5 分鐘。

浸泡好放於烘箱 (50 度 C~60 度 C) ，到烘乾為止。烘乾的玻片加入 1 % poly-L-lysine (sigma P8920) ，浸泡一分鐘再放到通風處風乾。

2.5.2 酸固定液的製備

Acetic acid 1

Glycerol 1

Seawater 13

3 ： 3 ： 39 共 45 ml

2.6 DCMU 處理作用

DCMU ( 3- ( 3,4-dichlorophenyl ) -1,1-dimethylurea ) 是光合作用抑制劑以 DCMU 傷害到美麗海葵和共生藻來進行免疫螢光染色分析。先將濃度為 0.1 M 的 DCMU 和海水混合稀釋成作用濃度 (4~5 μM) ，把美麗海葵放置配好的溶液內處理 10 分鐘、30 分鐘、60 分鐘和 120 分鐘時間，

之後將海葵用酸固定液固定之後用 ApHRS 抗體染色，以重複三次來執行免疫螢光染色分析。

2.7 吞噬作用

先將酵母菌培養於含有 YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) 培養液的瓊膠平板 (agar plate) ，挑選出單一顆酵母菌的菌落於每一管含有 5 ml 的 YPD 培養液裡面大量培養。培養 2~3 天，把菌管放置到離心機 (KUBOTA 3700) 用 5000rpm 離心五分鐘，倒掉上清液再取出酵母菌的 pellets。利用計數型玻片計算出至少每 μl 要有 10⁷顆酵母菌才能餵食到美麗海葵的胃腔內進行此實驗。分別以 10 分鐘、30 分鐘、60 分鐘和 120

分鐘這四個不同時間點餵食給海葵，以重複三次來執行免疫螢光染色分

利用 rabbit anti-ApRab5 (Santa Cruz,A-20)、rabbit anti-ApRab7 (Santa Cruz,H-50) 、 mouse anti-ubiquitinylated proteins (Millipore) 、 rabbit anti-ApRab3 (實驗室自製)和 rabbit anti-ApLC3 (MBL) 這五種一抗分別和 rat anti-ApHRS 抗體配對進行 double staining (二重染色法)。海葵對切，

放於酸固定液固定 10 分鐘。打散海葵細胞，並鋪於 poly-L-lysine 玻片在風乾，使細胞固定在玻片上。加 95 %藥用酒精去色，作用二十分鐘，用 1x PBS 洗兩次。加入 blocking solution (5 % BSA，1x PBST) 於室溫下作

用一小時。加入一抗 rat anti-ApHRS 以 1：100 和 rabbit anti-ApRab5 以 1：

30，一抗 rat anti-ApHRS 以 1：100 和 rabbit anti-ApRab7 以 1：30，加入一抗 rat anti-ApHRS 以 1：25 和 mouse anti-ubiquitinylated proteins 以 1：

100，加入一抗 rat anti-ApHRS 以 1：50 和 rabbit anti-ApRab3 以 1：30，

加入一抗 rat anti-ApHRS 以 1：100 和 rabbit anti-ApLC3 以 1：100 各別這五組於室溫下作用一小時。加入 0.1% Triton X - 100 的 1x PBS 洗三次，

五分鐘/次數。加入二抗 cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG 用 1：600 (標定 ApRab5) 和 Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG 用 1：400 (標定 ApHRS) ，加入二抗 cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG 用 1：600 (標定 ApRab7) 和 Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG 用 1：400 (標定 ApHRS)，

加入二抗 cy3-conjugated goat anti-mouse IgG 用 1：300 (標定 ubiquitinylated proteins) 和 Dylight 488 goat anti-rat IgG 用 1：200 (標定 ApHRS) ，加入二抗 cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG 用 1：400 (標定 ApRab3) 和 Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG 用 1： 200 (標定 ApHRS) ，加入二抗三次，把多餘黏液及蛋白質去除。加入 1 mg/ml Sulfo-NHS-LC-Biotin

reagent (PIERCE) (~2 mM) 會分裝成一管 0.1ml (共有十小管，1.5 ml eppendrof) ，取 0.05 ml 餵食到海葵的胃腔內，放到 4 度 C 冰箱作用 15 分鐘。之後從冰箱把海葵取出來先加入 seawater + 100 mM glycine，等比例混合海水，洗掉過多的 biotin reagent products 再放到正常水溫的海水，

使海葵身體回溫 30 分鐘。海葵對切，放到酸固定溶液內固定 10 分鐘。

打散海葵細胞，並鋪於 poly-L-lysine 玻片在風乾，使細胞固定在玻片上。

加 95 %藥用酒精去色，作用二十分鐘，用 1x PBS 洗兩次。加入 blocking solution (5 % BSA，1x PBST) 於室溫下作用一小時。加入一抗，比例分別為 rat anti-ApRab4 以 1:50、rabbit anti-Rab5 (Santa Cruz,A-20) 以 1:50 和 rat anti-ApHRS 以 1:100，於室溫下作用一小時。加入 0.1% Triton X - 100 的 1x PBS 洗三次，五分鐘/次數。加入二抗 cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG 用 1：400 (標定 ApRab5)，cy3- conjugated goat anti-rat IgG 用 1：400 (標定 ApRab4 和 ApHRS) 。同時也加入 Alexa Fluro 488 conjugate avidin (2 mg/ml 加入甘油，分裝成 0.1 ml eppendrof 1.5 ml 內) ，1：2000 (稀釋於 5%

BSA and 0.1%Triton X-100 in 1XPBS) ，於室溫下作用一小時。加入 0.1%

Triton X - 100 的 1x PBS 洗三次，五分鐘/次數。H33258 染核，封片並觀察。

* 實驗中所使用的藥劑的廠牌與貨號，請參考附錄一。

第三章、結果

3.1 Anti-ApHRS 抗體的專一性測試 (Western blot analysis)

將實驗室先前已選殖的部分 ApHRS cDNA (圖 1.) ，再次選殖到原核表現載體 pET 中，利用大腸桿菌來大量生產帶有組胺酸標籤的 ApHRS 重組蛋白。利用鎳親合管柱純化好的 ApHRS 重組蛋白，藉由注射實驗送到大鼠體內，因此得到抗 ApHRS 的抗血清。此抗血清在西方點墨分析中能與重組 ApHRS 蛋白強烈作用。取出製備好的美麗海葵 total proteins ( 1.77 μg/μl )和 soluble proteins ( 1.35 μg/μl ) 當作測試的樣品。一抗 rat anti-ApHRS 的稀釋條件為 1：5,000，二抗 HRP-conjugated goat anti-rat IgG 的稀釋條件為 1：10,000。結果顯示，在 ApHRS 一抗血清測試之下在美抗 rat anti-ApHRS 稀釋條件為 1：100 和二抗 cy3-conjugated goat anti-rat IgG 稀釋條件為 1：400。然後將製備好的玻片放到螢光顯微鏡下觀察發現到，不管是其他的海葵細胞或是和宿主細胞 (含有包著共生藻) ，於細

胞質內都可以觀察到明顯的點狀訊號，並且在宿主細胞內也發現到有一圈環形的螢光訊號圍繞在共生小體的周圍 (圖 3.) 。為了檢測是否為二抗抗體非專一性的結合所產生螢光訊號，又執行的二抗控制組實驗。在不加一抗 rat anti-ApHRS，只加二抗 cy3-conjugated goat anti-rat 的實驗條件下來觀察。發現到美麗海葵宿主細胞的細胞質和共生小體的周圍都沒有

%。此實驗執行了三次，各個時間點的平均值為，DCMU 處理 0 分鐘是 Stenmark, 2002)，因此也以 anti-ubiquitin 抗體進行二重染色實驗，來觀察 ApHRS 是否可能參與泛素調控的蛋白質降解作用。

從 ApRab5 和 ApHRS 的二重染色從結果來看，於美麗海葵宿主細胞內，不管是在細胞質和共生小體周圍都同樣有染上 ApRab5 和 ApHRS 的免疫螢光訊號，可是當重疊圖片於，卻鮮少發現到 ApRab5 和 ApHRS 的

免疫螢光訊號有同時坐落在一起 (圖 5.) 。ApRab7 和 ApHRS 的二重染色，情形也類似如此 (圖 6.) 。Ub-proteins 和 ApHRS 的二重染色發現到 Ub-proteins 和 ApHRS 有少部分的訊號同時出現在一個胞器上 (圖 7.) 。 ApRab3 和 ApHRS 的二重染色結果顯示，ApRab3 和 ApHRS 有不少的訊號出現在同一個胞器上；尤其是共生小體的周圍附近，重疊的現象很明

美麗海葵胃腔表面 apical surface 上有很多蛋白質帶有 primary amine (一級胺) 會和加入 Sulfo-NHS-LC-Biotin reagent 產生反應形成醯胺鍵 (amide bond)。於 4 度 C 下操作 biotin 標定反應後，將海葵放到室溫下回溫以啟動執行胞飲作用動作，來將 biotin 所標定的表面蛋白送到胞飲小體 (endocytic vesicles) 。此時將海葵細胞固定並打散舖於玻片上，先加入一抗分別為 rat anti-ApRab4 (1：50 稀釋) 、rabbit anti-ApRab5 (1：

50 稀釋) 和 rat anti-ApHRS (1：100 稀釋) ，之後再加入二抗 cy3-conjucated

在文檔中美麗海葵 HRS 蛋白在胞內共生所扮演的角色之研究 (頁 29-0)

第二章、 材料與方法