第三章、 結果
3.5 ApHRS 與ApLC3 的共分佈分析
有文獻指出，在哺乳類細胞中，HRS 會坐落於標有 LC3 的自噬小體
上 (Tamai, et al., 2007) ，接著下來想進行二重染色之免疫螢光技術，看 看美麗海葵的 HRS 和 LC3 這兩個蛋白質有沒有出現在同一個胞器或是共 生小體的膜上。將海葵組織打散舖於玻片上，加入一抗 rat anti-ApHRS 稀釋條件為 1：100 和 rabbit anti-LC3 稀釋條件為 1：100 (MBL) ，再加 入二抗 cy3-conjucated goat anti-rabbit IgG 稀釋比為 1：700 (標定 ApLC3) 和 Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG 稀釋比為 1：200 (標定 ApHRS) 。 然後將製備好的玻片，使用共軛焦顯微鏡觀察結果。於美麗海葵的宿主細 胞中，很明顯發現到於共生小體周圍和細胞質的部分，都有染上 ApLC3 和 ApHRS 的免疫螢光訊號，並且在共生小體的膜上有不少訊號重疊在一 起的現象 (圖 18.) 。因此 ApHRS 和 ApLC3 這兩個蛋白很可能共同坐落 於共生小體膜上或是其他的胞器上，但還是需要更進一步研究和探討。
第四章、討論
在海洋刺胞動物與其共生藻之間的胞內關係之建立與維持，對於珊 瑚礁生態是非常重要的。然而，我們對於胞內共生的分子機制卻完全不 清楚。由於哺乳類 HRS 參與了細胞內蛋白質運輸的調控，並且可能參與 了自噬小體成熟化 (autophagosome maturation) 的過程。本研究希望探討 HRS 蛋白在美麗海葵與共生藻彼此之間胞內共生中參與的情形。
4.2 DCMU 藥劑破壞美麗海葵與共生藻的共生關係
會分佈上去。不過這實驗改成用酵母菌，相對於微珠來相比的話，同樣 餵食酵母菌比餵食微珠會有較高的進食率 (結果未顯示) ，且在顯微底下 看消化細胞的細胞質內包著酵母菌的胞噬小體也比包著微珠來得容易觀 察 。 於 結 果 和 材 料 方 法 中 有 說 到 ， 先 執 行 移 除 酵 母 菌 反 應 性 抗 體 (depletion of yeast-reacting antibodies) ，然而經過處理的一抗血清只會專 一性的認到消化細胞內包著酵母菌的胞噬小體膜上 ApHRS，而幾乎完全
4.4 ApHRS 的免疫訊號與 biotin-labeled endocytic vesicles 關係
於之前 DCMU 和酵母菌餵食的實驗，發現到 ApHRS 似乎有別於哺
到 ApHRS、ApRab4 和 ApRab5 會不會同時出現於 biotin-avidin 所標定的 囊泡上。而 ApRab4 和 ApRab5 蛋白與 biotin-avidin 所標定的早期囊泡上 有部份重疊，當然更加了 ApRab4 和 ApRab5 出現於早期的時間點。可是
過程 (Raiborg and Stenmark, 2002)，和出現於標有 LC3 的自噬小體上 (Tamai, et al., 2007) 也想了解美麗海葵的 HRS 蛋白會不會也有相同的功 能，在二重免疫螢光結果發現到 HRS 和 Ub-proteins 於海葵細胞上在細胞 質和共生小體膜上沒有很明確座落於一起，但是與 ApLC3 在共生小體周 圍有明顯的螢光訊號重疊在一起。整合結果得知，以美麗海葵細胞所研 究的結果來看 ApHRS 出現於胞吐小體和標有 ApLC3 的共生小體。推測 美麗海葵的 HRS 蛋白有可能參與胞吐作用和自體吞噬的過程。
4.6 總結
對於美麗海葵 HRS 蛋白本研究進行了多項實驗，確定參與在美麗海 葵共生關係中的調控。雖未能直接證實 ApHRS 蛋白在美麗海葵細胞中扮 演決定性的角色，但透過美麗海葵細胞系統中得知 ApHRS 與 ApRab3，
ApHRS 和 ApLC3 蛋白質分佈有很高的重疊性，前者有可能對於共生小 體膜上蛋白胞外運輸有關係而後者可能對於受到白化而破壞共生關係促 使進行自體吞噬的機制有關。預計在之後應該要想辦法選殖出美麗海葵 全長的序列，於哺乳類系統上執行功能性分析，去針對這兩個執著點來 下手。進一步了解 ApHRS 對於美麗海葵與共生藻之間的扮演的角色為 何，然後推演到珊瑚白化與共生之間的關連性是如何維持與崩解。
第五章 圖表
K T S S S S D N D L P A E Y L N 243 CCTCTAGCACGTTCCTGGCCATCACCATCAGATGGAATTTCCAATG 1045 P L A R S W P S P S D G I S N 302 GTTCATCAAGCTTAAGCAGCAAATTGTATTCACCAGCTACATATGA 1091 G S S S L S S K L Y S P A T Y D 318 TGAAGAGCCTGAAACTGCAGATATGGACCCTGATCTTGCAAGATA 1136 E E P E T A D M D P D L A R Y 333 CTTGAATCGTTCATACTGGGAAGATAGACATGAACAGCAGTCATAC 1182 L N R S Y W E D R H E Q Q S Y 348 CCTCCTCCATTTGCNCCAGAACAATTAGTGAGTGATGGTCCAGCN 1227 P P P F A P E Q L V S D G P A 363 CCTTATAGCAATCACGCAGAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
P Y S N H A E E K K K K K K K AAAAAAAA K K
圖 1.
ApHRS 的部分 cDNA 序列和預測的胺基酸序列。轉譯起始密碼子 用粗體表示。55kDa 43kDa 34kDa 26kDa
17kDa 10kDa SP TP
圖 2.
藉由西方點墨法來分析 ApHRS 於美麗海葵蛋白質樣品的表現情 形。使用一抗 rat anti-ApHRS (1：5,000 稀釋比) 和二抗 HRP-conjugated goat anti-rat IgG (1：10,000 稀釋比)來偵測 ApHRS 蛋白質。SP，是指美 麗海葵 soluble proteins (1.35 μg/μl)；TP，指美麗海葵 total proteins (1.77 μg/μl) 。跑於 14 % SDS-PAGE，詳細步驟見材料方法。N
N ApHRS 實驗組
A. B. C.
ApHRS 二抗控制組
D. E. F.
圖 3.
美麗海葵 HRS 蛋白(ApHRS)胞內分佈的免疫螢光染色分析。實驗組使用一抗 rat anti-ApHRS (1：100 稀釋比) 和二抗 cy3-conjugated goat anti-rat IgG (1：400 稀釋比)來標定美麗海葵細胞內生性的 ApHRS (A,B,C)。而控制組不使用一抗 rat anti-ApHRS 且只加二抗 cy3-conjugated goat anti-rat IgG (1：400 稀釋比)來執行此實驗(D,E,F)。箭號，是指共生 小體的膜。N，是指宿主細胞的核。A 和 D，是指明視野下拍攝。B 和 E，
是指 UV 光下拍攝。C 和 F，是指綠光下拍攝。Bar：10 μm。
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0 10 30 60 120
DCMU處理時間(分鐘) ApHRS免疫螢光訊號之共生小體的 比例
圖 4.
DCMU 處理與共生小體染上 ApHRS 免疫螢光訊號的比例分析。使 用一抗 rat anti-ApHRS (1：150 稀釋比)，而二抗 cy3-conjugated goat anti-rat IgG (1：400 稀釋比)來辨識美麗海葵細胞內生性的 ApHRS。橫軸是 DCMU 處理時間(濃度為 4~5 μM)，有五個時間點(0，10，30，60 和 120 分鐘)，縱軸是具有 ApHRS 免疫螢光訊號的共生小體的比例。
ApHRS (A) ApRab5 (B) Merge (C)
ApHRS (D) ApRab5 (E) Merge (F)
圖 5.
以二重免疫螢光染色法分析美麗海葵宿主細胞內的 ApHRS 和 ApRab5 分佈情形。同時加入一抗 rat anti-ApHRS (1：100 稀釋比) 和 rabbit anti-ApRab5 (1：30 稀釋比) ，再加入二抗 cy3-conjucated goat anti-rabbit IgG 用 1：600 (標定 ApRab5) 和 Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG 用 1：400 (標定 ApHRS) 來標定美麗海葵細胞內生性的 ApHRS。A 和 D，是染 ApHRS。B 和 E，是染 ApRab5。C 和 F，是 merge 的圖。Bar：10 μm。
ApHRS (A) ApRab7 (B) Merge (C)
ApHRS (D) ApRab7 (E) Merge (F)
圖 6.
藉由二重免疫螢光染色法來分析美麗海葵宿主細胞內的 ApHRS 和 ApRab7 分佈情形。同時加入一抗 rat anti-ApHRS (1：100 稀釋比) 和 rabbit anti-ApRab7 (1：30 稀釋比) ，再加入二抗 cy3-conjucated goat anti-rabbit IgG 用 1：600 (標定 ApRab7) 和 Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG 用 1：400 (標定 ApHRS) 來標定美麗海葵細胞內生性的 ApHRS。箭 號，是指 ApHRS 和 ApRab7 同時坐落在一起。A 和 D，是染 ApHRS。B 和 E，是染 ApRab7。C 和 F，是 merge 的圖。Bar：10 μm。ApHRS (A) Ub-proteins (B) Merge (C)
ApHRS (D) Ub-proteins (E) Merge (F)
圖 7.
藉由二重免疫螢光染色法來分析美麗海葵宿主細胞內的 ApHRS 和 Ub-proteins 分佈情形。同時加入一抗 rat anti-ApHRS (1：25 稀釋比) 和 mouse anti-Ub-proteins (1：100 稀釋比)，再加入二抗 cy3-conjucated goat anti-mouse IgG 用 1：300 (標定 Ub-proteins) 和 Dylight 488 donkey anti-rat IgG 用 1：200 (標定 ApHRS) 來標定美麗海葵細胞內生性的 ApHRS。箭 號，是指 ApHRS 和 Ub-proteins 同時坐落在一起。A 和 D，是染 ApHRS。B 和 E，是染 Ub-proteins。C 和 F，是 merge 的圖。Bar：10 μm。
ApHRS (A) ApRab3 (B) Merge (C)
ApHRS (D) ApRab3 (E) Merge (F)
圖 8.
藉由二重免疫螢光染色法來分析美麗海葵宿主細胞內的 ApHRS 和 ApRab3 分佈情形。同時加入一抗 rat anti-ApHRS (1：50 稀釋比) 和 rabbit anti-ApRab3 (1：30 稀釋比) ，再加入二抗 cy3-conjucated goat anti-rabbit IgG 用 1：400 (標定 ApRab3) 和 Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG 用 1：200 (標定 ApHRS) 來標定美麗海葵細胞內生性的 ApHRS。箭號，是指
ApHRS 和 ApRab3 同時坐落在一起。A 和 D，是染 ApHRS。B 和 E，是 染 ApRab3。C 和 F，是 merge 的圖。Bar：10 μm。
ApRab5 (A) biotin-avidin (B) Merge (C)
ApRab5 (D) biotin-avidin (E) Merge (F)
圖 9.
藉由 cell surface-bound biotin 螢光染色法來分析美麗海葵宿主細胞 內的 biotin-avidin 所標定蛋白質和 ApRab5 分佈情形。加入一抗 rabbit anti-Rab5 以 1：50，加入二抗 cy3-conjucated goat anti-rabbit IgG 用 1：400 (標定 ApRab5) ，再加入 Alexa Fluro 488 conjugate avidin 以 1：2000 的 稀釋比。箭號，是指 biotin-avidin 所標定的蛋白質和 ApRab5 同時坐落在 一起。A 和 D，是染 ApRab5。B 和 E，是染 biotin-avidin。C 和 F，是merge 的圖。A，B 和 C，是回溫 20 分鐘；D，E 和 F 是回溫 30 分鐘。
Bar：10 μm。
ApRab4 (A) biotin-avidin (B) Merge (C)
圖 10.
藉由 cell surface-bound biotin 螢光染色法來分析美麗海葵宿主細 胞內的 biotin-avidin 所標定蛋白質和 ApRab4 分佈情形。加入一抗 rat anti-ApRab4 以 1：50，加入二抗 cy3-conjucated goat anti-rat IgG 用 1：400 (標定 ApRab4) ，再加入 Alexa Fluro 488 conjugate avidin 以 1：2000 的 稀釋比。箭號，是指 biotin-avidin 所標定的蛋白質和 ApRab4 同時坐落在 一起。A，是染 ApRab4。B，是染 biotin-avidin。C，是 merge 的圖。A，B 和 C，是回溫 30 分鐘。Bar：10 μm。
ApHRS (A) biotin-avidin (B) Merge (C)
圖 11.
藉由 cell surface-bound biotin 螢光染色法來分析美麗海葵宿主細 胞內的 biotin-avidin 所標定蛋白質和 ApHRS 分佈情形。加入一抗 rat anti-ApHRS 以 1：100，加入二抗 cy3-conjucated goat anti-rat IgG 用 1：400 (標定 ApHRS) ，再加入 Alexa Fluro 488 conjugate avidin 以 1：2000 的稀 釋比。箭號，是指 biotin-avidin 所標定的蛋白質和 ApHRS 同時坐落在一起。A，是染 ApHRS。B，是染 biotin-avidin。C，是 merge 的圖。A，B 和 C，是回溫 30 分鐘。Bar：10 μm。
N
N 游離的酵母菌
(A) (B) (C)
已吞噬酵母菌的消化細胞
(D) (E) (F)
已吞噬酵母菌的共生藻宿主細胞
(H) (I) (J)
圖 12.
藉由酵母菌餵食實驗之免疫螢光染色法來觀察美麗海葵細胞內生 性 ApHRS 分佈情形。使用一抗 rat anti-ApHRS 以 1：50 (ApHRS depletion 完後的抗體) 和二抗 cy3-conjugated goat anti-rat IgG 以 1：400 來染色。N：是指消化細胞(E)和宿主細胞(I)的核。箭頭：是指圍繞在共生小體和 酵母菌的膜。A，D 和 H，是明視野下的細胞。B，E 和 I，是用 H33258 染核之圖。C、F 和 J，是指 ApHRS 的紅色訊號。Bar：10 μm。
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
10 30 60 120
酵母菌餵食時間點 (分鐘) ApHRS在吞噬小體上的分佈(%)
圖 13.
利用酵母菌餵食來執行吞噬作用經由免疫螢光染色法來觀察美麗 海葵細胞內生性的 ApHRS，在消化細胞內包著酵母菌的胞噬小體膜上分 佈趨勢圖表。橫軸是酵母菌餵食的時間長度 (10，30，60 和 120 分鐘) ， 縱軸是帶有 ApHRS 免疫螢光訊號的胞噬小體的百分比。2000 bp 1650 bp 1000 bp 850 bp 650 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp
圖 14.
從美麗海葵 cDNA library 選殖出來的部分 LC3 序列之 PCR 產物。圖 15.
美麗海葵與其他物種的 LC3 蛋白之多重序列比對親源分析圖。結果顯示 ApLC3 蛋白質序列與人類 LC3 蛋白質序列有 72 %相同。黑色 區塊表示物種之間具有相同胺基酸序列，灰色區塊表示物種之間有相似 的胺基酸。所選擇各物種 LC3 蛋白的 GenBank accession number 為 Human (NP_115903) ， Human (NP_073729) ， Human (NP_001004343) ， Rat (NP_955794) ，Mouse (NP_080011) ，Frog (NP_001079866) ，Zebrafish (NP_999904) 和 Nematostella (XP_001635124) 。
Amino Acid Substitutions (x100) GenBank accession number 為 Human (NP_115903) ， Human (NP_073729) ， Human (NP_001004343) ， Rat (NP_955794) ， Mouse (NP_080011) ， Frog (NP_001079866) ， Zebrafish (NP_999904) 和 Nematostella (XP_001635124) ，建構之樹狀親源關係圖。
72kDa 55kDa 43kDa 34kDa 26kDa
17kDa 10kDa HeLa rLC3 SP TP
圖 17.
藉由西方點墨法來分析 ApLC3 於美麗海葵蛋白質樣品的表現情 形。使用一抗 rat anti-ApHRS (1：5,000 稀釋比) 和二抗 HRP-conjugated goat anti-rat IgG (1：10,000 稀釋比) 來偵測 ApHRS 蛋白質。HeLa，是指 HeLa 細胞總蛋白 (正控制) ；rLC3，是指美麗海葵的 ApLC3 重組蛋白 (1.63 μg/ul ) ；SP，是指美麗海葵 soluble proteins ( 1.35 μg/μl ) ；TP，指 美麗海葵 total proteins ( 1.77 μg/μl ) 。不同分子量的蛋白質以 14 % SDS-PAGE 加以分離，詳細步驟見材料方法。N N
ApLC3 (A) ApHRS (B) Merge (C)
(D) (E)
圖 18.
以二重免疫螢光染色法分析美麗海葵宿主細胞內的 ApHRS 和 ApLC3 分佈情形。同時加入一抗 rat anti-ApHRS (1：100 稀釋比) 和 rabbit anti-LC3 (1：100 稀釋比) ，再加入二抗 cy3-conjucated goat anti-rabbit IgG 用 1：700 (標定 ApLC3) 和 Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG 用 1：200 (標定 ApHRS) 來標定美麗海葵細胞內生性的 ApHRS。A，是染 ApLC3。B，是染 ApHRS。C，是 merge 的圖。D，是用 H33258 染核之圖。E，是 明視野下的細胞。Bar：10 μm。
第六章、參考文獻
Amer, A.O. and Swanson, M.S., (2002) A phagosome of one's own: a microbial guide to life in the macrophage. Current opinion in
microbiology. 5, 56-61.
Asao, H., Sasaki, Y., Arita, T., Tanaka, N., Endo, K., Kasai, H., Takeshita, T., Endo, Y., Fujita, T. and Sugamura, K., (1997) Hrs is associated with STAM, a signal-transducing adaptor molecule. Journal of Biological
Chemistry. 272, 32785.
Bache, K.G., Raiborg, C., Mehlum, A., Madshus, I.H. and Stenmark, H., (2002) Phosphorylation of Hrs downstream of the epidermal growth factor receptor. European Journal of Biochemistry. 269, 3881-3887.
Baker, A.C., (2003) Flexibility and specificity in coral-algal symbiosis:
diversity, ecology, and biogeography of Symbiodinium. Annual Review
of Ecology, Evolution, and Systematics, 661-689.
Baker, A.C. and Romanski, A.M., (2007) Multiple symbiotic partnerships are common in scleractinian corals, but not in octocorals: Comment on Goulet (2006). Marine ecology progress series. 335, 237-242.
Banin, E., Khare, S.K., Naider, F. and Rosenberg, E., (2001) Proline-rich peptide from the coral pathogen Vibrio shiloi that inhibits
photosynthesis of zooxanthellae.
Applied and environmental microbiology. 67, 1536.
Boya, P., Gonzalez-Polo, R.A., Casares, N., Perfettini, J.L., Dessen, P., Larochette, N., Metivier, D., Meley, D., Souquere, S. and Yoshimori, T., (2005) Inhibition of macroautophagy triggers apoptosis. Molecular and
cellular biology. 25, 1025.
Brumell, J.H., Tang, P., Mills, S.D. and Finlay, B.B., (2001) Characterization of Salmonella Induced Filaments (Sifs) Reveals a Delayed Interaction Between Salmonella Containing Vacuoles and Late Endocytic Compartments. Traffic. 2, 643-653.
Buchmeier, N.A. and Heffron, F., (1991) Inhibition of macrophage phagosome-lysosome fusion by Salmonella typhimurium. Infection and
immunity. 59, 2232.
Buddemeier, R.W. and Fautin, D.G., (1993) Coral bleaching as an adaptive mechanism. Bioscience. 43, 320-326.
Cecile, S., Philippe, G., Emeline, D., Denis, A. and Paola, F., (2009)
Cecile, S., Philippe, G., Emeline, D., Denis, A. and Paola, F., (2009)