酸固定液的製備

Acetic acid 1

Glycerol 1

Seawater 13

3 ： 3 ： 39 共 45 ml

2.6 DCMU 處理作用

DCMU ( 3- ( 3,4-dichlorophenyl ) -1,1-dimethylurea ) 是光合作用抑制 劑以 DCMU 傷害到美麗海葵和共生藻來進行免疫螢光染色分析。先將濃 度為 0.1 M 的 DCMU 和海水混合稀釋成作用濃度 (4~5 μM) ，把美麗海 葵放置配好的溶液內處理 10 分鐘、30 分鐘、60 分鐘和 120 分鐘時間，

之後將海葵用酸固定液固定之後用 ApHRS 抗體染色，以重複三次來執行 免疫螢光染色分析。

2.7 吞噬作用

先將酵母菌培養於含有 YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) 培養液 的瓊膠平板 (agar plate) ，挑選出單一顆酵母菌的菌落於每一管含有 5 ml 的 YPD 培養液裡面大量培養。培養 2~3 天，把菌管放置到離心機 (KUBOTA 3700) 用 5000rpm 離心五分鐘，倒掉上清液再取出酵母菌的 pellets。利用計數型玻片計算出至少每 μl 要有 10⁷顆酵母菌才能餵食到美 麗海葵的胃腔內進行此實驗。分別以 10 分鐘、30 分鐘、60 分鐘和 120

分鐘這四個不同時間點餵食給海葵，以重複三次來執行免疫螢光染色分

利用 rabbit anti-ApRab5 (Santa Cruz,A-20)、rabbit anti-ApRab7 (Santa Cruz,H-50) 、 mouse anti-ubiquitinylated proteins (Millipore) 、 rabbit anti-ApRab3 (實驗室自製)和 rabbit anti-ApLC3 (MBL) 這五種一抗分別和 rat anti-ApHRS 抗體配對進行 double staining (二重染色法)。海葵對切，

放於酸固定液固定 10 分鐘。打散海葵細胞，並鋪於 poly-L-lysine 玻片在 風乾，使細胞固定在玻片上。加 95 %藥用酒精去色，作用二十分鐘，用 1x PBS 洗兩次。加入 blocking solution (5 % BSA，1x PBST) 於室溫下作

用一小時。加入一抗 rat anti-ApHRS 以 1：100 和 rabbit anti-ApRab5 以 1：

30，一抗 rat anti-ApHRS 以 1：100 和 rabbit anti-ApRab7 以 1：30，加入 一抗 rat anti-ApHRS 以 1：25 和 mouse anti-ubiquitinylated proteins 以 1：

100，加入一抗 rat anti-ApHRS 以 1：50 和 rabbit anti-ApRab3 以 1：30，

加入一抗 rat anti-ApHRS 以 1：100 和 rabbit anti-ApLC3 以 1：100 各別 這五組於室溫下作用一小時。加入 0.1% Triton X - 100 的 1x PBS 洗三次，

五分鐘/次數。加入二抗 cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG 用 1：600 (標 定 ApRab5) 和 Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG 用 1：400 (標定 ApHRS) ，加入二抗 cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG 用 1：600 (標定 ApRab7) 和 Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG 用 1：400 (標定 ApHRS)，

加入二抗 cy3-conjugated goat anti-mouse IgG 用 1：300 (標定 ubiquitinylated proteins) 和 Dylight 488 goat anti-rat IgG 用 1：200 (標定 ApHRS) ，加入 二抗 cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG 用 1：400 (標定 ApRab3) 和 Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG 用 1： 200 (標定 ApHRS) ，加入二抗 三次，把多餘黏液及蛋白質去除。加入 1 mg/ml Sulfo-NHS-LC-Biotin

reagent (PIERCE) (~2 mM) 會分裝成一管 0.1ml (共有十小管，1.5 ml eppendrof) ，取 0.05 ml 餵食到海葵的胃腔內，放到 4 度 C 冰箱作用 15 分鐘。之後從冰箱把海葵取出來先加入 seawater + 100 mM glycine，等比 例混合海水，洗掉過多的 biotin reagent products 再放到正常水溫的海水，

使海葵身體回溫 30 分鐘。海葵對切，放到酸固定溶液內固定 10 分鐘。

打散海葵細胞，並鋪於 poly-L-lysine 玻片在風乾，使細胞固定在玻片上。

加 95 %藥用酒精去色，作用二十分鐘，用 1x PBS 洗兩次。加入 blocking solution (5 % BSA，1x PBST) 於室溫下作用一小時。加入一抗，比例分 別為 rat anti-ApRab4 以 1:50、rabbit anti-Rab5 (Santa Cruz,A-20) 以 1:50 和 rat anti-ApHRS 以 1:100，於室溫下作用一小時。加入 0.1% Triton X - 100 的 1x PBS 洗三次，五分鐘/次數。加入二抗 cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG 用 1：400 (標定 ApRab5)，cy3- conjugated goat anti-rat IgG 用 1：400 (標定 ApRab4 和 ApHRS) 。同時也加入 Alexa Fluro 488 conjugate avidin (2 mg/ml 加入甘油，分裝成 0.1 ml eppendrof 1.5 ml 內) ，1：2000 (稀釋於 5%

BSA and 0.1%Triton X-100 in 1XPBS) ，於室溫下作用一小時。加入 0.1%

Triton X - 100 的 1x PBS 洗三次，五分鐘/次數。H33258 染核，封片並觀 察。

* 實驗中所使用的藥劑的廠牌與貨號，請參考附錄一。

第三章、結果

3.1 Anti-ApHRS 抗體的專一性測試 (Western blot analysis)

將實驗室先前已選殖的部分 ApHRS cDNA (圖 1.) ，再次選殖到原 核表現載體 pET 中，利用大腸桿菌來大量生產帶有組胺酸標籤的 ApHRS 重組蛋白。利用鎳親合管柱純化好的 ApHRS 重組蛋白，藉由注射實驗送 到大鼠體內，因此得到抗 ApHRS 的抗血清。此抗血清在西方點墨分析中 能與重組 ApHRS 蛋白強烈作用。取出製備好的美麗海葵 total proteins ( 1.77 μg/μl )和 soluble proteins ( 1.35 μg/μl ) 當作測試的樣品。一抗 rat anti-ApHRS 的稀釋條件為 1：5,000，二抗 HRP-conjugated goat anti-rat IgG 的稀釋條件為 1：10,000。結果顯示，在 ApHRS 一抗血清測試之下在美 抗 rat anti-ApHRS 稀釋條件為 1：100 和二抗 cy3-conjugated goat anti-rat IgG 稀釋條件為 1：400。然後將製備好的玻片放到螢光顯微鏡下觀察發 現到，不管是其他的海葵細胞或是和宿主細胞 (含有包著共生藻) ，於細

胞質內都可以觀察到明顯的點狀訊號，並且在宿主細胞內也發現到有一 圈環形的螢光訊號圍繞在共生小體的周圍 (圖 3.) 。為了檢測是否為二抗 抗體非專一性的結合所產生螢光訊號，又執行的二抗控制組實驗。在不 加一抗 rat anti-ApHRS，只加二抗 cy3-conjugated goat anti-rat 的實驗條件 下來觀察。發現到美麗海葵宿主細胞的細胞質和共生小體的周圍都沒有

%。此實驗執行了三次，各個時間點的平均值為，DCMU 處理 0 分鐘是 Stenmark, 2002)，因此也以 anti-ubiquitin 抗體進行二重染色實驗，來觀 察 ApHRS 是否可能參與泛素調控的蛋白質降解作用。

從 ApRab5 和 ApHRS 的二重染色從結果來看，於美麗海葵宿主細胞 內，不管是在細胞質和共生小體周圍都同樣有染上 ApRab5 和 ApHRS 的 免疫螢光訊號，可是當重疊圖片於，卻鮮少發現到 ApRab5 和 ApHRS 的

免疫螢光訊號有同時坐落在一起 (圖 5.) 。ApRab7 和 ApHRS 的二重染 色，情形也類似如此 (圖 6.) 。Ub-proteins 和 ApHRS 的二重染色發現到 Ub-proteins 和 ApHRS 有少部分的訊號同時出現在一個胞器上 (圖 7.) 。 ApRab3 和 ApHRS 的二重染色結果顯示，ApRab3 和 ApHRS 有不少的訊 號出現在同一個胞器上；尤其是共生小體的周圍附近，重疊的現象很明

美麗海葵胃腔表面 apical surface 上有很多蛋白質帶有 primary amine (一級胺) 會和加入 Sulfo-NHS-LC-Biotin reagent 產生反應形成醯胺鍵 (amide bond)。於 4 度 C 下操作 biotin 標定反應後，將海葵放到室溫下回 溫以啟動執行胞飲作用動作，來將 biotin 所標定的表面蛋白送到胞飲小 體 (endocytic vesicles) 。此時將海葵細胞固定並打散舖於玻片上，先加 入一抗分別為 rat anti-ApRab4 (1：50 稀釋) 、rabbit anti-ApRab5 (1：

50 稀釋) 和 rat anti-ApHRS (1：100 稀釋) ，之後再加入二抗 cy3-conjucated goat anti-rabbit IgG 稀釋比為 1：400 (標定 ApRab5) ，cy3-conjucated goat anti-rat IgG 稀釋比為 1：400 (標定 ApRab4 和 ApHRS) ，同時再加入 Alexa Fluro 488 conjugate avidin 稀釋比為 1：2000。這時候 avidin 會和 biotin 有很強的親合力而結合在一起形成 protein-biotin-avidin-A488 複合

物，於螢光顯微鏡下便可加以觀察 cell surface-bound biotin 在細胞回溫 回溫 20 和 30 分鐘後，那些被 biotin-labeled endocytic vesicles 上，有一部 分含有 ApRab5 的免疫螢光訊號 (圖 9.) 。從 biotin-avidin 所標定的蛋白 質和 ApRab4 免疫螢光的結果來看，於回溫 30 分鐘後那些被 biotin-labeled endocytic vesicles 上，少部分含有 ApRab4 的免疫螢光訊號 (圖 10.) 。從 biotin-avidin 所標定蛋白質和 ApHRS 免疫螢光的結果來看，於回溫 30 分 鐘後那些被 biotin-labeled endocytic vesicles 上，幾乎都沒有 ApHRS 的免 疫螢光訊號 (圖 11.) 。從結果得知 ApRab5 和 ApRab4 是坐落於早期時期 的胞飲小體上，可是 ApHRS 卻沒有座落在 biotin-labeled endocytic vesicles 早期胞器上。

3.2.2 ApHRS 出現在不同時期的 yeast-containing phagosomes 的 比例

為 了 探 究 ApHRS 是 否 參 與 胞 噬 小 體 熟 成 作 用 (phagosome maturation) ，因而進行了吞噬作用分析 (phagocytosis assay) 。在進行酵 母菌餵食實驗的初期有觀察到，直接拿酵母菌鋪在 poly-L-lysine 的玻片 上執行 ApHRS 免疫螢光染色，酵母菌本身會有很高的比例出現 ApHRS

螢光訊號 (結果未顯示) 。這表示 rat anti-ApHRS 抗血清中含有某些抗 體，會和我們所使用的酵母菌結合。因此先執行移除酵母菌反應性抗體 (depletion of yeast-reacting antibodies) ，把酵母菌和 rat anti-ApHRS 抗血 清混合作用一段時間，讓處理後的抗血清幾乎不會再辨識到酵母菌，而

17 %， 60 分鐘為 27 %和 120 分鐘為 47 %。以整體趨勢來說，餵食酵母 合進行降解。而微小管結合蛋白 microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3) 則是另一個參與自噬作用的蛋白。剛合成的 LC3 會出現於細胞

現其胺基酸序列與人類 LC3 蛋白有高度同源性，接下來應該進行 5’與 3’

cDNA 末端快速擴增技術 (Rapid ampilification of cDNA end) ，但由於時 間不足，故尚未將其 LC3 全長 cDNA 選殖出來。因此在美麗海葵 cDNA 1：1,000，二抗 HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG 的稀釋條件為 1：

10,000。結果顯示，在一抗 rabbit anti-LC3 測試之下對美麗海葵 LC3 重組 蛋白有很強烈的訊號表現 (10~17 kDa 之間)。在 HeLa 總蛋白中也測到明

顯的訊號產生 (10~17 kDa 之間)，可是在美麗海葵 total proteins 和 soluble proteins，於預期大小的位置上，只有偵測到非常微弱的 LC3 蛋白質訊號 (圖 17.) 。

3.5. ApHRS 與 ApLC3 的共分佈分析

有文獻指出，在哺乳類細胞中，HRS 會坐落於標有 LC3 的自噬小體

上 (Tamai, et al., 2007) ，接著下來想進行二重染色之免疫螢光技術，看 看美麗海葵的 HRS 和 LC3 這兩個蛋白質有沒有出現在同一個胞器或是共 生小體的膜上。將海葵組織打散舖於玻片上，加入一抗 rat anti-ApHRS 稀釋條件為 1：100 和 rabbit anti-LC3 稀釋條件為 1：100 (MBL) ，再加 入二抗 cy3-conjucated goat anti-rabbit IgG 稀釋比為 1：700 (標定 ApLC3) 和 Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG 稀釋比為 1：200 (標定 ApHRS) 。 然後將製備好的玻片，使用共軛焦顯微鏡觀察結果。於美麗海葵的宿主細 胞中，很明顯發現到於共生小體周圍和細胞質的部分，都有染上 ApLC3 和 ApHRS 的免疫螢光訊號，並且在共生小體的膜上有不少訊號重疊在一 起的現象 (圖 18.) 。因此 ApHRS 和 ApLC3 這兩個蛋白很可能共同坐落 於共生小體膜上或是其他的胞器上，但還是需要更進一步研究和探討。

第四章、討論

在海洋刺胞動物與其共生藻之間的胞內關係之建立與維持，對於珊 瑚礁生態是非常重要的。然而，我們對於胞內共生的分子機制卻完全不 清楚。由於哺乳類 HRS 參與了細胞內蛋白質運輸的調控，並且可能參與 了自噬小體成熟化 (autophagosome maturation) 的過程。本研究希望探討 HRS 蛋白在美麗海葵與共生藻彼此之間胞內共生中參與的情形。

4.2 DCMU 藥劑破壞美麗海葵與共生藻的共生關係

會分佈上去。不過這實驗改成用酵母菌，相對於微珠來相比的話，同樣 餵食酵母菌比餵食微珠會有較高的進食率 (結果未顯示) ，且在顯微底下 看消化細胞的細胞質內包著酵母菌的胞噬小體也比包著微珠來得容易觀 察 。 於 結 果 和 材 料 方 法 中 有 說 到 ， 先 執 行 移 除 酵 母 菌 反 應 性 抗 體 (depletion of yeast-reacting antibodies) ，然而經過處理的一抗血清只會專 一性的認到消化細胞內包著酵母菌的胞噬小體膜上 ApHRS，而幾乎完全

4.4 ApHRS 的免疫訊號與 biotin-labeled endocytic vesicles 關係

於之前 DCMU 和酵母菌餵食的實驗，發現到 ApHRS 似乎有別於哺

到 ApHRS、ApRab4 和 ApRab5 會不會同時出現於 biotin-avidin 所標定的 囊泡上。而 ApRab4 和 ApRab5 蛋白與 biotin-avidin 所標定的早期囊泡上 有部份重疊，當然更加了 ApRab4 和 ApRab5 出現於早期的時間點。可是

過程 (Raiborg and Stenmark, 2002)，和出現於標有 LC3 的自噬小體上 (Tamai, et al., 2007) 也想了解美麗海葵的 HRS 蛋白會不會也有相同的功 能，在二重免疫螢光結果發現到 HRS 和 Ub-proteins 於海葵細胞上在細胞 質和共生小體膜上沒有很明確座落於一起，但是與 ApLC3 在共生小體周

過程 (Raiborg and Stenmark, 2002)，和出現於標有 LC3 的自噬小體上 (Tamai, et al., 2007) 也想了解美麗海葵的 HRS 蛋白會不會也有相同的功 能，在二重免疫螢光結果發現到 HRS 和 Ub-proteins 於海葵細胞上在細胞 質和共生小體膜上沒有很明確座落於一起，但是與 ApLC3 在共生小體周