免疫染色法 (immunostaining)

第四節、 Muscle denervation

本實驗過程亦用 Isoflurane 氣體麻醉機 (Matrx™ VIP 3000 Calibrated Vaporizer, Midmark Corp.) 持續麻醉成鼠。剔除成鼠後肢右大腿處的皮毛，劃 開股二頭肌 (biceps femoris) 的前緣讓坐骨神經 (sciatic nerve) 顯露出來，並 小心地將坐骨神經與其他組織分開，將坐骨神經剪斷 1~2 公分長度後縫合傷口 (Okada et al., 2006; Macpherson et al., 2011)，於手術七天後以二氧化碳犧牲 手術後的老鼠取出肌肉組織 (soleus musle) 以進行組織染色實驗。沒有剪斷坐 骨神經的左後肢即為 control 組別。

第五節、 免疫染色法 (immunostaining)

一、 免疫組織染色法 (immunohistochemistry) (一) 組織包埋與切片 玻片 (Thermo, SCIENTIFIC, 25x75x1 mm) 上，靜置一段時間讓組織切片水氣 晾乾後，即可進行組織染色。

(二) 組織染色

利用強力膠可貼附在玻璃及易撕除的特性，在組織玻片上畫出強力膠圈圍住 組織，在強力膠圍住的組織區域內加入 4%或 1% 固定液 (paraformaldehyde, PFA)，將其置於 4℃冰箱中反應 30 分鐘後取出，移除掉固定液，用 0.1M Glycine/0.01M Phosphate Buffered Saline (PBS) 洗兩次各 5 分鐘，接著使用

‧ 國

立 政 治 大 學

‧

Na tiona

l Ch engchi University

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0.01M PBS 洗兩次，每次 5 分鐘，之後移除廢液，加入 Donkey serum (1: 30, abcam) 在室溫下進行 blocking 作用，減少抗體非專一性的結合，反應 20 分 鐘後移除，而後加入初級抗體置於 4℃冰箱中反應 overnight。初級抗體包含 Rabbit polyclonal to BMP4 ( 1 µg/ml, abcam)、anti-human BMPRII antibody (15 µg/ml, R&D)、anti-neurofilament200 IgG (1 µg/ml, sigma)、以及 rabbit polyclonal to S100 beta (1:100, abcam)等。 Donkey serum 以 0.01M PBS 稀 釋，初級抗體則以 0.01% Bovine serum albumin (BSA) / 0.2% Tween20 / 0.01M PBS 溶液稀釋成所需濃度，兩者溶液在使用前須經過 10000 rpm 轉速，

離心 2 分鐘。第二天移除初級抗體之後，先以 0.1% Tween20 / 0.01M PBS 洗 六次各 2 分鐘，洗去殘留的初級抗體，移除清洗液之後加入二級抗體反應 1 小 時，二級抗體包含 biotinylated donkey anti-rabbit IgG (1:200, amersham) 及 biotinylated donkey anti-goat IgG (1:100, abcam)。接著用 0.5% Tween20 / 0.01M PBS 洗三次各 5 分鐘，洗去多餘的二級抗體後以 0.01M PBS 清洗 1 分 鐘，而後利用 0.3% H2O2/methanol 混合液反應 10 分鐘去除內生性 peroxidase，

過程中需注意避免 0.3% H₂O2/methanol 混合液揮發掉，反應完後立即以 0.01M PBS 清洗三次各 1 分鐘，移除掉清洗液後加入 strepavidin-biotinylated-HRP 溶 液反應 1 小時將訊息放大，反應完後以 0.01M PBS 清洗三次各 2 分鐘，再以 0.1M acetate buffer (pH= 5.2) 清 洗 3 分 鐘 ， 而 後 使 用 3-Amino-9-ethyl-carbazole (AEC)呈色劑反應約 12 分鐘，當有適量紅色呈色時 立即移除呈色劑並以 ddH2O 清洗終止呈色反應，接著拭去玻片上多餘水分，滴 一些 90% glycerol / 10% PBS 配製而成的封片液 (mounting medium)並蓋上 蓋玻片，最後塗上指甲油完成封片。玻片完成後利用顯微鏡 (Zeiss, Imager D2) 觀察，同時利用 CCD 相機 (AxioCam ICc3) 拍照存檔。

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將做過 muscle denervation 實驗之成鼠用二氧化碳犧牲後取下 soleus muscle 置於解剖盤上拉直用針固定，之後利用 2%固定液在 4℃冰箱中反應 1 小時，反應完後立即以 0.1M Glycine/0.01M PBS 清洗兩次各 5 分鐘，再以 0.01M PBS rinse 一次，而後於解剖顯微鏡下解剖組織，去除掉除了肌肉以外 的組織並用鑷子將肌肉撕成條狀，放入 chicken serum 中在室溫下進行 blocking 作用，反應 20 分鐘後移除，而後加入初級抗體置於 4℃冰箱中反應 overnight。

初級抗體包含 Rabbit polyclonal to BMP4 ( 4 µg/ml, abcam) 及 Rabbit monoclonal to synaptophysin (1:100, abcam) 。第二天移除初級抗體後以 0.01M PBS 清洗三次，每次 20 分鐘，而後加入二級抗體 Alexa Fluor 488 chicken anti-rabbit IgG (1:250, invitrogen) 以 及 Tetramethylrhodamine--bungarotoxin (100nM, Molecular probes) 於室溫下 反應 2 小時，再以 0.1M PBS 清洗三次各 20 分鐘，最後將條狀的肌肉組織置 blocking 反應 20 分鐘，反應完後移除 chicken serum，接著加入初級抗體 Rabbit

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polyclonal to BMP4 ( 0.5 µg/ml, abcam)置於 4℃冰箱中處理 overnight，第二 天先以 0.1% Tween20 / 0.01M PBS 洗六次各 2 分鐘後，加入二級抗體 Alexa Fluor 488 chicken anti-rabbit IgG (1:1000, invitrogen) 以 及 Tetramethylrhodamine--bungarotoxin (100nM, Molecular probes) 置於 4℃

冰箱中反應 overnight，第三天實驗先以 0.5% Tween20 / 0.01M PBS 洗三次各 5 分鐘，洗去多餘的二級抗體後以 0.01M PBS 清洗兩次各 5 分鐘，最後用鑷子 將 6 孔盤中之蓋玻片取出，細胞面朝下放在載玻片上以封片液及指甲油完成封 片後立即用螢光顯微鏡 (Delta Vision imaging system, Applied precision) 觀 察並拍照存檔。

(二) 螢光定量

在螢光顯微鏡 (Delta Vision imaging system, Applied precision) 下以 60X 物鏡觀察，在每一片染色後的玻片上隨機取樣 20 條以上之成熟 C2C12 肌小管，