第三章 實驗結果
第四節、 軸突損傷會影響周邊組織中 BMP4 的表現
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第四節、 軸突損傷會影響周邊組織中 BMP4 的表現
在許多文獻研究中發現，當神經受到損傷時周邊系統的衍生因子表現型態會 跟著改變(Ishii, 1989; Friedman et al., 1992; Sendtner et al., 1992; Jiang et al., 2000a)，然而，為了提升在 nerve ligation 實驗中靠近神經末端的遠端處(distal) 堆積的 BMP4 是來自於肌肉或 Schwann cell 所分泌的可能性，我們利用 nerve ligation 實驗進一步分析在坐骨神經受損情況下，肌肉組織、坐骨神經組織以及 腰椎處脊髓組織中 BMP4 mRNA 表現量。結果顯示當軸突受損時肌肉組織中 BMP4 mRNA 表現量會顯著增加，在坐骨神經組織中 BMP4 mRNA 表現量則 會下降，而在腰椎處脊髓組織中則是沒有差異(圖九)，故可知軸突損傷時會影 響周邊系統 BMP4 的表現，使肌肉組織產生更多的 BMP4。
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圖九、Nerve ligation 後 BMP4 在肌肉組織、坐骨神經以及 lumbar spinal cord 中的 mRNA 表現量。將 nerve ligation 後 18-20 小時之成鼠犧牲，取出 soleus muscle (n=5)、坐骨神經(n=5)以及 lumbar spinal cord (n=4) 後萃取 total RNA，
再以 real-time PCR 分析 BMP4 之 mRNA 表現量。同一隻老鼠中未做 nerve ligation 之另一側後肢取得的組織即為對照組。結果顯示，相較於對照組，nerve ligation 後肌肉組織內的 BMP4 mRNA 表現量顯著增加，在坐骨神經中 BMP4 mRNA 表現量則顯著下降，而在 lumbar spinal cord 中 BMP4 mRNA 表現量則 無顯著差異。實驗數值以 mean±SEM 表示，統計結果以 Student’s t-test 統計 方法計算；** 代表 p < 0.01，*** 代表 p < 0.001。
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Glutamate/glycine 誘導之興奮性毒殺作用能使分化成神經之 NG108-15 細胞死 亡 (Oza et al., 2008)，因此，我們以此為模型探討 BMP4 對神經細胞死亡之保 護作用。我們將 50 µM Glutamate/glycine 加入細胞處理 16 小時，此期間稱為 興奮性毒殺時期 (excitotoxciity)，而後以 trypane blue 染色法計數細胞 (圖十 A)。首先，我們探討不同濃度之 BMP4 與神經細胞死亡之間的關係，BMP4 分 別以 2 ng/ml、10 ng/ml 及 50 ng/ml 三種濃度與 Glutamate/glycine 同時處理，結果顯示，相較於 DMEM 之對照組，單獨以 Glutamate/glycine 處理之組別細 胞存活率顯著下降，証實 Glutamate/glycine 的確能夠毒殺分化後之 NG108-15 細胞。然而，同時以 Glutamate/glycine 及 BMP4 處理之組別，BMP4 皆能保 護 NG108-15 細胞免於毒殺死亡 (圖十 C)。另外，我們亦探討單獨處理不同濃 度之 BMP4 對 NG108-15 細胞之存活率的影響，結果顯示在 2 ng/ml、10 ng/ml 及 50 ng/ml 之濃度下，BMP4 本身不會影響細胞的存活率 (圖十 B)。之後的實 驗皆以 10 ng/ml BMP4 作探討，從圖十一中可觀察單獨以 Glutamate/glycine 處理之組別細胞密度較低，同時以 10 ng/ml BMP4 處理之組別則增高細胞密 度。
先前文獻證實 Glutamate/glycine 的興奮性會造成延遲性的細胞死亡(Choi, 1987)，因此我們以 Glutamate/glycine 處理細胞 16 小時（此期間稱為興奮性 毒殺時期， excitotoxicity)，之後再將培養液更換為 condition medium 處理 8 小時 （此 8 小時期間為恢復時期，recovery），我們分別在不同時期加入 BMP4，
最後以 Trypane blue 染色法計數細胞數目(圖十二 A)。結果顯示，單獨在興奮
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性毒殺時期加入 BMP4 處理，與在興奮性毒殺時期以及恢復時期皆以 BMP4 處理皆能保護 NG108-15 神經細胞。
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圖十、已分化 NG108-15 細胞經 Glutamate/glycine 及不同濃度之 BMP4 同時 處 理 16 小 時的細胞存 活表現。 (A)圖示已分化四天之 NG108-15 細胞經 Glutamate/glycine (Glu/gly) 處理 16 小時後，以 Trypane blue 染色法計數細胞 數目之步驟。(B) 分化後的 NG108-15 細胞，以 2 ng/ml、10 ng/ml 及 50 ng/ml 三種濃度之 BMP4 處理 16 小時後分析細胞存活率，與對照組無顯著差異。(C) 分 化後的 NG108-15 細胞，經 Glutamate/glycine (Glu/gly) 與以 2 ng/ml、10 ng/ml 及 50 ng/ml 三種濃度之 BMP4 同時處理 16 小時後分析細胞存活率，相較於 DMEM 對照組，Glu/gly 處理之組別細胞存活率顯著下降。而相較於 Glu/gly 組，
以不同濃度的 BMP4 與 Glu/gly 同時處理之組別細胞存活率皆顯著增加。而相較 於 DMEM 對照組，在處理 Glu/gly 亦同時加入 2 ng/ml 、 10 ng/ml 及 50 ng/ml BMP4 的組別中，細胞存活率沒有顯著差異；n=3-4。實驗數值以 mean±SEM 表示，統計結果以 Student’s t-test 統計方法計算；相較於 DMEM 對照組，***
代表 p < 0.001；相較於 Glu/gly 組，# 代表 p <0.05，### 代表 p < 0.001。
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圖十一、已分化 NG108-15 細胞經 Glutamate/glycine 及 BMP4 (10ng/ml )同 時處理 16 小時候的細胞。(A)已分化 NG108-15 細胞經 DMEM 處理 16 小時後 之細胞圖。(B) 已分化 NG108-15 細胞經 Glutamate/glycine (Glu/gly) 處理 16 小時後之細胞圖，其細胞密度較圖 A 為低。(C) 已分化 NG108-15 細胞經 10 ng/ml BMP4 處理 16 小時後之細胞圖。(D) 已分化 NG108-15 細胞經 Glu/gly 及 10 ng/ml BMP4 同時處理 16 小時後之細胞圖，其細胞密度較圖 B 為高。
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圖十二、BMP4 保護已分化 NG108-15 細胞對抗 Glutamate 誘導之興奮性毒殺 作用。(A)圖示已分化四天之 NG108-15 細胞經 Glutamate/glycine (Glu/gly) 處 理 16 小時，此 16 小時期間稱為興奮性毒殺時期 (excitotoxicity) ，之後將培養 液更換為 condition medium 處理 8 小時，此 8 小時期間為恢復 (recovery) 時期，
加入 BMP4 處理的時間點分別為只在興奮性毒殺時期加入 BMP4 處理(n=5)，或 是在興奮性毒殺時期以及恢復時期皆以 BMP4 處理(n=6)，最後以 Trypane blue 染色法計數細胞數目之步驟。(B)單獨在興奮性毒殺時期加入 BMP4 處理，與在 興奮性毒殺時期以及恢復時期皆以 BMP4 處理皆能保護 NG108-15 神經細胞。
實驗數值以 mean±SEM 表示，統計結果以 Student’s t-test 統計方法計算；相 較於對照組(n=11)，* 代表 p <0.05，*** 代表 p < 0.001；相較於 Glu/gly 組(n=11)，
### 代表 p < 0.001。
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生性 BMPRII homolog 突變果蠅之運動神經元中則可使果蠅生存，並且部分恢復 NMJ 中突觸 (synapse) 的型態及功能(Marques et al., 2002)，另外，在哺乳類 動物的研究中發現當神經受到損傷時，運動神經元中的 BMP2 mRNA 表現量會 增加(Wang et al., 2007b)。過去曾有多篇研究利用 nerve ligation 實驗方法，觀察內生性蛋白質在軸突 內的運輸情形，用以證明其蛋白質對神經元而言是否具有生理功能。在過去研究 中來自許旺細胞及肌肉的 Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)已被 證實為運動神經元的 neurotrophic factor 之一，而在 nerve ligation 實驗發現其 會堆積在打結點近端處位置，顯示其在神經軸突內有順向運輸的現象(Russell et al., 2000)，亦有研究利用 nerve ligation 實驗方法觀察到 BMP6 會堆積在打結點 遠端處的位置，顯示其在軸突內有逆向運輸的情形，且由許旺細胞產生的 BMP6 亦被證實能夠促進運動神經元的存活(Wang et al., 2007a)。另外，在 TGF-beta 2 的研究上發現，許旺細胞以及肌肉皆會表現 TGF-beta 2，而在 nerve ligation 實 驗中觀察到 TGF-beta 2 在打結處的兩端皆有堆積的現象，顯示其在運動神經元
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之軸突內具有雙向運輸的特性(Jiang et al., 2000b)，亦有研究指出在神經撕裂傷 的老鼠身上每天給予 TGF-beta 2 處理，4 週後觀察發現 TGF-beta 2 能夠降低運 動神經元死亡的數目(Jiang et al., 2000a)。而本論文中觀察到 BMP4 會堆積在打 結處的兩端，其運輸方向有順向運輸及逆向運輸(圖八)，其運輸方向與先前研究 發現的 TGF-beta 2 一致(Jiang et al., 2000b)，由這些結果顯示，BMP4 或許與 TGF-beta 2 具有相似生理功能。綜合上述，我們認為周邊肌肉組織及許旺細胞 可能藉由多種因子影響運動神經元各種不同的生理功能。
Muscle-derived factor 對於運動神經元的發育及至成熟穩定非常的重要，曾 有研究發現肌肉發育缺失的老鼠，其 90%的運動神經元會死亡(Oppenheim et al., 1993)，亦有文獻指出在大鼠的肌肉中移植進過度表現 neurotrophin-4 (NT-4) 的 細胞後，會大量增加運動神經末梢的分支 (branching)數目，顯示由肌肉所分泌
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生 (axon regeneration) (Parikh et al., 2011)，且在中樞神經系統損傷後發生去 髓鞘化 (demyelination) 過程中，短時間內給予外源性 (exogenous) BMP4 處 理可以在促進寡突膠前驅細胞 (oligodendrocyte progenitor cells , OPCs)、星狀 膠神經細胞 (astrocyte)以及為神經膠細胞 (microglial) 增生(Sabo et al., 2011)， 態下，BMPRII protein 會表現在神經軸突內(圖一)，BMP4 的 protein 則集中表 現在坐骨神經之許旺細胞上(圖七)，且坐骨神經上能夠偵測到 BMP4 mRNA 表 1990)，然而在神經損傷後的坐骨神經上觀察到內生性 CNTF mRNA 表現量下降，
而由本論文的 nerve ligation 實驗，我們觀察到坐骨神經之 BMP4 mRNA 表現量 有下降的情形(圖九)，另外，由免疫染色實驗我們觀察到 nerve ligation 後的坐 骨神經上 BMP4 則集中在神經軸突內(圖八)。根據上述內容，我們可以知道許旺 細胞在正常的狀態下會產生 BMP4，故 BMP4 是一種 Schwann cell-derived factor，用以維持神經肌肉系統之環境的穩定，而當神經軸突受到損傷時，許旺 細胞所產生的 BMP4 將會被運送進軸突內，參與許旺細胞及運動神經元之間的 機制作用。
過去有研究指出，BMP4 與 CNTF 皆可保護視網膜神經細胞抵抗 NMDA 所
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由本論文之實驗發現，BMP4 可以保護 NG108-15 神經細胞對抗由 glutamate 引 起的毒殺反應。過去曾有研究發現，在卵巢組織培養系統中，加入 BMP4 中和 性抗體抑制掉卵巢內部 BMP4 訊息傳遞路徑，將會促進細胞凋亡反應，然而以 BMP4 處理卵巢組織後則可觀察到其 transforming growth factor-alpha (TGF) mRNA 表現量下降，顯示 BMP4 為卵巢細胞的 survival factor，其可以透過調控 growth factor 而維持組織細胞的穩定(Nilsson and Skinner, 2003)，故 BMP4 也 許可以藉由調控 NG108-15 神經細胞內部 growth factor 的表現而達到神經保護 之效果。另外，曾有文獻指出 glutamate 誘導的興奮性毒殺作用會透過活化 MEK / ERK 訊息路徑促使細胞膜上 AMPA receptor 大量增加，細胞內環境更為興奮 性後引起細胞死亡 (Zhu et al., 2002)，而過去的研究發現 BMP4 在胚胎幹細胞 (embryonic stem cells, ES cells) 內會藉由抑制 ERK/p38 MAPK 訊息路徑達到 細胞自我更新 (self-renewal)，且 p38 MAPK 的抑制劑之功能與處理 BMP4 的 效果相同(Qi et al., 2004)，另外，在大腦缺血性損傷 (cerebral ischemia) 的動 物模型中則發現 p38 MAPK 的抑制劑會降低 glutamate 誘導之細胞死亡反應 (Barone et al., 2001)，所以，BMP4 也許會透過抑制 glutamate 所活化的訊息路 徑以達到保護神經細胞的功能。因此，我們未來可進一步確認 BMP4 保護
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第五章 結論
在本篇論文中以各種不同技術初步證實 BMP4 於神經肌肉系統中具有生理 功能，在正常狀態下，許旺細胞與肌肉皆會產生 BMP4，而由肌肉產生的 BMP4 亦會表現在 NMJ 處，且其 mRNA 及 protein 之表現量皆會受到神經衍生性蛋 白 Agrin 的調控。另外，由 nerve ligation 實驗中發現 BMP4 在神經軸突內有雙 向運輸的現象，當神經受損時，周邊的肌肉組織及神經軸突上的許旺細胞之 BMP4 mRNA 表現量皆受到影響。
此外，我們亦觀察到 BMP4 能夠保護 NG108-15 神經細胞對抗 Glutamate 誘導的興奮性毒殺作用，且在興奮性毒殺時期以及恢復時期皆以 BMP4 處理對
此外，我們亦觀察到 BMP4 能夠保護 NG108-15 神經細胞對抗 Glutamate 誘導的興奮性毒殺作用，且在興奮性毒殺時期以及恢復時期皆以 BMP4 處理對