第一章 緒論
第三節、 運動神經元的發育與周邊系統之間的關係
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2010)，這些觀察提供了一些證據支持肌肉所分泌的 Gbb 是一種 retrograde signal 能夠調控運動神經元軸突末梢突觸的生長且影響 NMJ 的形成。
第三節、 運動神經元的發育與周邊系統之間的關係
在神經新生 (neurogenesis) 時期，神經元會先過度增生而之後有一部分的 神經元會被消除。以老鼠腰椎處脊髓 (lumbar spinal cord)中的 lateral motor column 為例，在老鼠胚胎時期第 13 天 (E13) 約有 4000 到 5000 個運動神經 元，但當老鼠出生之後只有不到 50%的運動神經元存活下來(Oppenheim et al., 2001)。這樣大量細胞死亡的現象在神經系統發育的過程中相當常見，有研究指 出，運動神經元這樣自然發生細胞死亡是由於周邊系統的影響(Hamburger, 1958)。例如，在雞胚胎中摘除掉 limb buds 之後會導致運動神經元及感覺神經 元大量死亡，相反地，將額外的 limb buds 移植進雞胚胎中則可發現這些神經 元將會大量增生。
第四節、 Peripheral-derived neurotrophic factor
1960 年，Montalcini 及 Cohen 等人發現了 nerve growth factor (NGF)，證 實了 Hamburger 於 1958 年由實驗結果所提出的看法，在神經元發育的過程中 會發生計畫性的細胞死亡 (programmed cell death, PCD) 又稱細胞凋亡 (apoptosis) ，這些神經元需要來自目標組織細胞 (例如肌肉) 所分泌的訊號因 子才得以生存。而 Puves 於 1988 年提出了 neurotrophic hypothesis，透過計 算健康的神經元與死亡的神經元可了解到，細胞凋亡的時期在特定的神經細胞 族群中增加 neurotrophic factors (NTFs) 或是移除 NTFs，對於神經元的存活 影響很大，NTFs 可以促進神經細胞的存活(Gould and Enomoto, 2009)。NTFs 的來源及種類非常多，例如：
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一、 muscle-derived signal
由缺乏 limb buds 的動物實驗中可以發現在神經元細胞發生計畫性細胞死亡 的過程中，肌肉可以調控運動神經元的存活。曾有研究分析 wingless 基因發生 突變的雞胚胎，發現脊髓中 lateral motor column 區域的運動神經元存活數目與 wing bud muscle 的數量成比例(Lanser and Fallon, 1987)，亦有研究發現當老 鼠的肌肉發育缺失時，會導致 90%的運動神經元死亡(Oppenheim et al., 1993)。
然而，當 limb muscle 數量趨近為零時仍有存活的運動神經元，顯示除了肌肉 之外還有其他組織細胞會影響運動神經元的生存。
二、 Schwann cell-derived signal
由上述的內容可知肌肉對運動神經元的生存非常的重要，但也有研究發現許 旺細胞 (Schwann cell) 在運動神經元的存活上亦扮演了重要的角色。ErbB3 為 neuregulin receptor，ErbB3 null mutant 的老鼠無法生成許旺細胞，實驗發 現與正常老鼠相較，運動神經元的數目在 E18 時減少了約 79% (Riethmacher et al., 1997)，顯示許旺細胞跟肌肉一樣都對運動神經元的生存相當重要。在過去 研究中發現，發育中的許旺細胞會製造多種的 neurotrophic factor，例如 glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) 以及 TGF等。所以，ErbB3 null mutant 的老鼠因為不能生成許旺細胞而無法提供給運動神經元需要的 NTFs。
第五節、 BMP superfamily
骨形成蛋白 (bone morphogenetic proteins, BMPs) 最早被發現其可以誘導 細胞分化形成骨頭，故命名為骨形成蛋白(Wozney et al., 1988)。BMPs 是 TGF
superfamily 中最為龐大的一群蛋白質，至今已發現超過 20 種 BMPs。就如同 TGF family 中其他成員，BMPs 的受體為 type I 以及 type II 受體共同組成的 複合體。Type II 受體具有與 ligand 結合的專一特性，而 type I 受體決定下游訊 息傳遞路徑的活化。目前已知 type II 受體有五種而 type I 受體有七種 (Shi and
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Massague, 2003)，五種 type ll 受體包含 TGF type II receptor (TRII)、BMP type II receptor (BMPRII)、Mullerian inhibiting substance type II receptor (MISRII) 以及 activin type II receptor (ActRIIA 及 ActIIB)，而 type I 受體則包 括 activin receptor-like linase (ALK)-1 到 ALK-7 共七種。其中，BMPs 會與 BMPRII、ActRIIA 及 ActIIB 三種 type II 受體結合，並且與 ALK-2、ALK-3 及 ALK-6 三種 type I 受體結合(Labeur et al., 2010)。
如附錄一顯示，BMPs 以 homodimer 或是 heterodimer 的形式與 type II 受 體結合後會跟 type I 受體形成複合體，type II 受體會磷酸化 type I 受體的 GS domain (Wrana et al., 1994) ， 接 著 活 化 的 type I 受 體 會 磷 酸 化 下 游 receptor-regulated Smad (R-Smad) 的 C 端 Ser-Ser-X-Ser (SSXS) motif 中的 serines，R-Smad 包括 Smad 1、Smad 2、Smad 3、Smad 5 以及 Smad 8 (Kretzschmar and Massague, 1998)。活化的 R-Smad 會與 Smad 4 (亦稱為 Co-Smad) 結合形成 R-Smad/Co-Smad 複合體，並且進入細胞核內調控目標 基因的轉錄作用(Chen et al., 1997)。除了經由 Smad 傳遞訊息之外，BMPs 亦 會經由其他途徑傳遞訊息，曾有研究指出 BMPs 能夠調控 p38、MAPK、ERK、
NFkB 及 PI3K 等 intracellular mediators 引起下游機制反應(Sieber et al., 2009;
Bragdon et al., 2011)，另外，BMPRII 的 cytoplasmic tail 透過 LIM kinase 1 (LIMK1) 及 c-Jun N-terminal kinase (JNK)，其會影響調控細胞骨架動態的因 子(Foletta et al., 2003; Podkowa et al., 2010)。
一、 BMP4
BMP4 最早被發現在皮膚或肌肉中表現可以誘導異位性 (ectopic) 骨頭及軟 骨的形成(Wozney et al., 1988)，由 408 個胺基酸 (amino acid, aa) 所組成之 prepropeptide，其中包含 N 端 19 個胺基酸的訊息序列 (signal sequence)、
273 個胺基酸的 prodomain 以及 C 端 116 個胺基酸的 mature peptide，
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prodomain 及 mature peptide 皆具有兩個 N-linked glycosylation site，而 mature peptide 內含有七個 cystein(Wozney et al., 1988; Sieber et al., 2009)。
所以，就如同其他 TGF superfamily 成員，BMP4 一開始被產生出來時作為較 大的 precursor，經由 protease 作用後形成 mature dimer form，接著釋放到 細胞間質 (extracellular matrix) 中(Suzuki et al., 1993)，其七個 cystein 可以 讓 BMPs 之間產生共價雙硫鍵 (covalent disulfide bond)，使 BMPs 聚合成 homodimer 或 heterodimer 以形成具有活性的訊號傳遞因子(Nohe et al., 2004)。
二、 BMP4 之受體
曾有研究指出，BMPRII 具有不同的 variant。Long form BMPRII 由 1038 個 胺基酸所組成，其 kinase domain 後面接著富含 serine/threonine residues 的 較長 C 端，而 short form BMPRII 則是缺少 C 端並且在多數細胞中較為稀少 (Beppu et al., 1997)。BMPRII 表現在許多不同的組織上，例如骨骼肌、心臟以 及大腦等，也會表現在 cultured cell lines 中，像是 ROB-C26 osteoprogenitor cells、lung epithelial cells 以及 COS cell。BMPRII 與 BMP4 的結合能力只有 在缺乏 type I receptor 會變得微弱，type I receptor 的存在可以促進 BMPRII 與 BMP4 之間的結合能力 (Kawabata et al., 1998)。在哺乳類動物中，BMPs 會結合的 type I receptor 有兩種，分別為 BMP type IA (亦稱為 ALK-3) 及 BMP type IB (又稱為 ALK-6)，此兩種 type I receptor 的結構非常相似並且其 kinase domain 有 85% 胺基酸序列是一樣的。BMP type IA 及 type IB 分別與 BMPs 之間的結合能力不盡相同，但此兩種 receptor 與 BMP4 的結合能力是相似的 (Kawabata et al., 1998)。BMP4 亦會與 ALK-2 及 ActRIIA 結合(Bragdon et al., 2011)。
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究的成員(Labeur et al., 2010)，BMP4 及 BMP2 皆具有誘導骨頭與軟骨形成的 能力，且在早期胚胎發育時期扮演重要的角色。當老鼠體內 BMP4 基因缺失時，使得 extraembryonic mesoderm 及 posterior/ventral mesoderm 無法形成，胚 胎會在 E6.5 至 E9 之間死亡(Winnier et al., 1995)。BMP4 的生理功能相當地 多元複雜且重要，由過去的研究發現其亦會參與去髓鞘化 (demyelination) 與 軸突再生 (axon regeneration) 的過程，當 spinal cord lesion 時，BMP4 表現 量會增加且促進星狀膠細胞 (astrocyte) 的活化，進而形成 glial scar 阻礙軸 突再生的功能(Fuller et al., 2007)，而近期亦有研究觀察到在 spinal cord injury 的動物模型中在背根神經節 (dorsal root ganglion, DRG) 加強 BMP4 訊息傳 遞機制可以促進軸突再生 (axon regeneration) 的能力(Parikh et al., 2011)。
BMP4 亦會調控細胞的死亡與存活，曾有文獻指出在基因轉殖鼠的皮膚中過度 表現 (overexpression) BMP4 時，會降低神經支配的程度而誘導細胞凋亡反應，
造成背根感覺神經元的數目顯著性減少(Guha et al., 2004)，另外亦有研究發現 BMP4 能 夠 促 進 耳 蝸 內 的 螺 旋 神 經 節 (spiral gangalion) 之 單 極 神 經 元 (monopolar neuron) 以及沒有 neurite 的神經元之存活(Whitlon et al., 2007)。
BMP4 亦具有神經保護的功能，曾有文獻指出 BMP4 與 ciliary neurotrophic factor (CNTF) 皆可保護視網膜中的無長突神經細胞 (amacrine neuron) 以及
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活化後突觸膜上的 glutamate 受體引起下游反應。在後突觸端的 glutamate 受 體是離子通道型受體 (ionotropic receptor)，依據其對不同試藥之作用可分為 N-methyl-D-aspartate(NMDA)受體、-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxaz
-ole-propionate (AMPA)受體以及 kainate 受體(Heath and Shaw, 2002)。興奮 性反應的終止主要是透過星狀膠細胞 (astrocyte) 膜上的麩氨酸轉運蛋白 (glutamate transporter) 將突觸間隙中 94%的 glutamate 送進星狀膠細胞內，
經由星狀膠細胞內 glutamine synthetase 作用將其轉變成 glutamine 後送到星 狀膠細胞外，神經細胞會回收 glutamine 再合成 glutamate 利用(Laake et al., 1995; Tanaka et al., 1997)。過多的 glutamate 將會造成其 NMDA 受體過度活 化，引起大量 Ca2+流進細胞內，細胞質內過多的 Ca2+會進入粒線體中(Peng and Greenamyre, 1998)，影響粒線體膜上抗細胞凋亡蛋白 (antiapoptotic protain) Bcl-2 與促細胞凋亡蛋白 (proapoptotic protein) Bax 之比例進而引起細胞死亡 (Schelman et al., 2004a)，此外，Ca2+亦會活化 MEK / ERK 訊息路徑促使細胞 膜上 AMPA receptor 大量增加，促使細胞內環境更為興奮性，造成細胞死亡 (Zhu et al., 2002)，此興奮性毒殺作用與中樞系統的疾病有關，包括缺血性損 傷 (ischemia)、血流再灌注損傷 (reperfusion injury) 以及神經退化性疾病如肌 萎縮性側索硬化症 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS)(Weiss, 2011)。
ALS 的病理特徵為運動皮質、腦幹以及脊髓中的運動神經元死亡，ALS 病人 的隨意肌會逐漸衰弱，而當呼吸肌衰弱時會使個體無法呼吸(Caroscio et al., 1987)。ALS 的致病機制相當地複雜，其中曾有文獻指出興奮性毒殺作用與 ALS 疾病有關，在 ALS 病人的腦脊髓液中發現 glutamate 的含量是正常人的 3 倍以 上(Rothstein et al., 1990)，從 ALS 病人身上取得的腦脊髓液在細胞實驗中會造 成運動神經元死亡及退化(Rothstein et al., 1992; Rothstein et al., 1995)，
Riluzole 目前是治療 ALS 疾病較有效的藥劑，其可以抵抗 glutamate 所誘導的 興奮性毒殺作用，延緩 ALS 病人運動神經元的退化(Bensimon et al., 1994)。
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第七節、 本論文之研究目的
許多研究指出 BMP 的訊息傳遞對果蠅體內 NMJ 發育相當重要，retrograde BMP 會調控前突觸運動神經元的突觸生長、聚集及穩定，當果蠅體內的 Gbb 及 其受體發生突變時，會導致 NMJ 受到破壞，降低神經傳導物質的釋放及突觸 的大小。然而，在哺乳類 NMJ 的研究上，一般多為探討 Agrin/MuSK 之訊息傳 遞路徑，但在過去的研究中指出 BMP 在脊髓損傷時會有所反應並且參與軸突 再生的過程，顯示了 BMP 在神經元及周邊系統之間扮演重要的角色。但是，
目前關於 BMP 在哺乳類 NMJ 的研究還未完全了解，而從本實驗室初步的實驗 結果發現，BMP 之受體 BMPRII 會表現在 NMJ 處，顯示 BMP 的訊息傳遞可 能也參與運動神經元與肌肉之間的調控機制，故我們將進一步探討 BMP 在 neuromuscular system 中的表現情形，本論文內容主要針對 BMP4 作探討。
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培養於含有 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, sigma)、20% fetal bovine serum (FBS, Biological industries)、1x penicillin/streptomycin (sigma, 內含 100 U/ml penicillin 以及 100 µg/ml streptomycin)的生長培養液。 (2) NG108-15 細胞 (小鼠神經細胞瘤與大鼠神經膠細胞瘤之融合細胞) 培養於含 有 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, sigma)、10% fetal bovine serum (FBS, Biological industries)、1x HAT solution (invitrogen, 內含 100 µM hypoxanthine 、 1µM aminopterin 及 0.4 µM thymidine) 、 1x‧
種細胞前，先將無菌無塵操作台 (Laminar flow working station) 打開抽風約 15 分 鐘 ， 並 將 0.05% Trypsin-EDTA (GIBCO) 、 1X 杜 氏 磷 酸 緩 衝 液 (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS ) 以及配製好的 C2C12 細胞生 長培養液自冰箱 4℃中取出，進行 37℃水浴回溫後，以 75%酒精噴灑瓶身、瓶
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dibutyryl cAMP (sigma) 培養四天，誘導 NG108-15 細胞株分化成神經，此期 間由於細胞代謝速率變快，故需每天更換生長培養液以維持足夠的養分。將分 性蛋白 Agrin，誘導乙醯膽鹼受體 (acetylcholine receptor, AChR) 聚集現象，模擬 NMJ 以達到研究目標(Ferayorni et al., 2004; Lin et al., 2005)。我們將訂 購的 Recombinant Rat Agrin (R&D)溶解至無菌的 DPBS 中，以 100 µg/ml 濃
模擬 NMJ 以達到研究目標(Ferayorni et al., 2004; Lin et al., 2005)。我們將訂 購的 Recombinant Rat Agrin (R&D)溶解至無菌的 DPBS 中，以 100 µg/ml 濃