第一章 緒論
第一節、 脊髓運動神經元的發育過程
二、 脊髓運動神經元的構造
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notochord 及 floor plate 會分泌 Sonic hedgehog (Shh)，其能誘導 ventral 區域 運動神經元以及 floor plate 區細胞的分化(Marti et al., 1995; Ericson et al., 1996)，另外，floor plate 亦會分泌 bone morphogenetic proteins (BMPs) 來 調控 dorsal 區域細胞的形成(Liem et al., 1995; Liem et al., 1997)，過去的研究 中發現，在 Shh 以及 BMP receptor 缺失的老鼠中，會缺乏運動神經元和 dorsal 區域的 commissural neuron (Chiang et al., 1996; Wine-Lee et al., 2004)。在 脊髓的發育過程中，Shh 及 BMPs 對於細胞分化的調控似乎是有拮抗作用，由 Shh 所調控而分化的 ventral 區細胞，其分化能力可以被高濃度的 BMPs 所抑 制(Arkell and Beddington, 1997; Liem et al., 2000)，相反地，Shh 可以抑制經 BMPs 所調控的 dorsal 區細胞形成作用(Liem et al., 1995)，Shh 的功能隨著濃 度梯度分布而有所不同，例如，低濃度的 Shh 能夠誘導運動神經元的形成，而 在高濃度 Shh 環境中則可以誘導 floor plate 細胞分化(Roelink et al., 1995)。
因此，由 notochord 及 floor plate 所分泌的 Shh 因其濃度分布不同可以決定細 胞分化的種類並且影響脊髓 ventral 區域的發育。
二、 脊髓運動神經元的構造
當運動神經元進行有絲分裂後便會遷移到脊髓 ventral 部分的其他區域，並 且形成截然不同的 motor column，包含 medial motor column (MMC) 以及 lateral motor colum (LCM)。MMC 在整個脊髓中延伸且可分為 medial 及 lateral 兩個部分，其區域之功能為神經支配 dorsal 及 ventral 處的中軸肌群 (axial musculature) 。而 LMC 只會表現在支配臂神經叢 (brachial plexus) 及腰神經 叢 (lumbar plexus) 的脊髓區域，其又可分為 medial 及 lateral 兩個部分，神經 支配 ventral 及 dorsal 區域的肢軀肌肉。
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第二節、 Neuromuscular junction (NMJ) 的形成 一、 NMJ 之形成
Neuromuscular junction (NMJ) 是運動神經元與肌肉纖維之間特化的突觸，
運動神經末梢會分化形成前突觸高度活化區域 (presynaptic active zone) ，具 有 許 多 突 觸 小 泡 (synaptic vesicle) 並 且 能 夠 釋 放 神 經 傳 導 物 質 (neurotransmitter) 至突觸間隙中，神經傳導物質會與後突觸膜上高度聚集的神 經傳導物質之受體結合，引起下游機制的活化控制肌肉的收縮。 NMJ 的發育 過程可以分為五個階段： (1) 神經末梢未到達肌肉纖維之前，乙醯膽鹼受體 (acetylcholine receptors, AChRs) 會廣泛地分布在肌肉纖維的中央區域，其稱 為 prepatterning。 (2) 神經末梢到達肌肉纖維後，調控後突觸膜上 AChRs 更
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二、 Agrin/Lrp4/MuSK/rapsyn 訊息傳遞路徑
運動神經元會釋放出正向因子用以抵抗 ACh 對 AChR 聚集的負調控反應，
一般認為是透過 Agrin/Lrp4/MuSK 訊息傳遞路徑。1987 年，McMahan 與其學 生在 Torpedo electric organ 中發現了與 AChR 聚集活性相關的糖蛋白 (glycoprotein) ，且命名為 Agrin (Nitkin et al., 1987)。Agrin 是由運動神經元 所製造，沿著軸突運送至神經末梢前突觸之區域且釋放至突觸間隙，誘導後突 的 Agrin 具有 B/Z 區域，而且誘導 Muscle specific kinase receptor 在後突觸膜 上聚集的程度，與其他細胞所分泌之 Agrin 相較為千倍以上(Gesemann et al., 1995)。Nova 是調控 Z + form Agrin splicing 的重要因子，nova1-/-/nova2-/- double knockout (Nova DKO)的老鼠出生後會癱瘓且在 NMJ 中缺乏 AChR 聚集，而近 期研究指出，在 Nova DKO 的老鼠中將 Z + form Agrin 送進運動神經元中將會 使 AChR 在後突觸膜上聚集(Ruggiu et al., 2009)，可見由運動神經元所分泌之 Z + form Agrin 對 NMJ 的形成相當的重要。
Muscle specific kinase receptor (MuSK) 最早被發現在含有許多突觸的 Torpedo electric organ 中有大量表現(Jennings et al., 1993)，並且與 NMJ 中的 AChR 有 co-localiztion 的情形(Valenzuela et al., 1995)。在 MuSK-/-老鼠中發
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lipoprotein receptor-related protein 4 ) 的缺失會造成 NMJ 發育不完全，甚至 會有死胎的情況，而且突觸的分化情況與 MuSK 突變時類似(Weatherbee et al., 2006)，而 lrp4 屬於低密度脂蛋白受體 ( low density lipoprotein receptor, LDLR ) 家族中的一員。經由研究發現，在給予 Agrin 的情況下，lrp4 的存在對於 MuSK‧
幫助許多乙醯膽鹼受體在後突觸膜上排列聚集形成巨大的 complex(Borges et al., 2008)，讓 NMJ 的發育得以完全。
三、 TGF/BMP 訊息傳遞路徑與 NMJ 的之間的關係
TGF家族是蛋白質中最多的一群，其中包含 TGF、bone morphogenetic proteins (BMPs)以及 activins，這些蛋白質皆會透過刺激其 type I 及 type II 受 體來調控下游機制(Wu et al., 2010)。近期在以 Xenopus 為模型的研究發現，
由許旺細胞所分泌的 TGF1 能夠誘導運動神經元內 Agrin 表現量增加，間接地 促進 NMJ 的形成(Feng and Ko, 2008)，在過去許多以果蠅為模型的研究上發 現，BMP 訊息傳遞路徑會參與調控 NMJ 的形成，當果蠅體內的 BMP homolog Glass bottom boat (Gbb) 、 type I recpetors Thickveins(Tkv) 與 Saxophone(Sax)、type II receptor Wishful thinking(Wit)以及其下游 Smad homolog Mad 的基因發生突變時，皆會導致 NMJ 發生缺失。例如，當果蠅體 內 type II BMP receptor ( BMPRII) homolog Wit 發生突變時，NMJ 的大小及功 能會顯著地降低，然而利用基因工程操作專一性地將 Wit 送進 Wit 突變的果蠅 體內運動神經元中則可部分恢復 NMJ 的形態及功能(Aberle et al., 2002;
Marques et al., 2002)，而當 Gbb 發生突變時，利用基因工程方法將 Gbb 專一 地表現在肌肉上可以恢復 NMJ 的缺失，此外，當運動神經元軸突中的逆向運 輸蛋白 Glued (dynactin homolog) 被抑制時會破壞運動神經元內 BMP 訊息傳 遞路徑(McCabe et al., 2003)。另外，過去的研究已證實運動神經元的 trio 會促 進 NMJ 處前突觸的生長，而當果蠅體內 Gbb 及 Mad 發生突變時會降低運動神 經 元 中 Rac/GEF/Trio 的 表 現 ， 相 反 地 在 運 動 神 經 元 中 過 度 表 現 (overexpression) 活化態的 Tkv 及 Sax 時則會增加 trio 的轉錄作用(Ball et al.,
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2010)，這些觀察提供了一些證據支持肌肉所分泌的 Gbb 是一種 retrograde signal 能夠調控運動神經元軸突末梢突觸的生長且影響 NMJ 的形成。
第三節、 運動神經元的發育與周邊系統之間的關係
在神經新生 (neurogenesis) 時期，神經元會先過度增生而之後有一部分的 神經元會被消除。以老鼠腰椎處脊髓 (lumbar spinal cord)中的 lateral motor column 為例，在老鼠胚胎時期第 13 天 (E13) 約有 4000 到 5000 個運動神經 元，但當老鼠出生之後只有不到 50%的運動神經元存活下來(Oppenheim et al., 2001)。這樣大量細胞死亡的現象在神經系統發育的過程中相當常見，有研究指 出，運動神經元這樣自然發生細胞死亡是由於周邊系統的影響(Hamburger, 1958)。例如，在雞胚胎中摘除掉 limb buds 之後會導致運動神經元及感覺神經 元大量死亡，相反地，將額外的 limb buds 移植進雞胚胎中則可發現這些神經 元將會大量增生。
第四節、 Peripheral-derived neurotrophic factor
1960 年，Montalcini 及 Cohen 等人發現了 nerve growth factor (NGF)，證 實了 Hamburger 於 1958 年由實驗結果所提出的看法，在神經元發育的過程中 會發生計畫性的細胞死亡 (programmed cell death, PCD) 又稱細胞凋亡 (apoptosis) ，這些神經元需要來自目標組織細胞 (例如肌肉) 所分泌的訊號因 子才得以生存。而 Puves 於 1988 年提出了 neurotrophic hypothesis，透過計 算健康的神經元與死亡的神經元可了解到，細胞凋亡的時期在特定的神經細胞 族群中增加 neurotrophic factors (NTFs) 或是移除 NTFs，對於神經元的存活 影響很大，NTFs 可以促進神經細胞的存活(Gould and Enomoto, 2009)。NTFs 的來源及種類非常多，例如：
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一、 muscle-derived signal
由缺乏 limb buds 的動物實驗中可以發現在神經元細胞發生計畫性細胞死亡 的過程中，肌肉可以調控運動神經元的存活。曾有研究分析 wingless 基因發生 突變的雞胚胎，發現脊髓中 lateral motor column 區域的運動神經元存活數目與 wing bud muscle 的數量成比例(Lanser and Fallon, 1987)，亦有研究發現當老 鼠的肌肉發育缺失時，會導致 90%的運動神經元死亡(Oppenheim et al., 1993)。
然而，當 limb muscle 數量趨近為零時仍有存活的運動神經元，顯示除了肌肉 之外還有其他組織細胞會影響運動神經元的生存。
二、 Schwann cell-derived signal
由上述的內容可知肌肉對運動神經元的生存非常的重要，但也有研究發現許 旺細胞 (Schwann cell) 在運動神經元的存活上亦扮演了重要的角色。ErbB3 為 neuregulin receptor，ErbB3 null mutant 的老鼠無法生成許旺細胞，實驗發 現與正常老鼠相較，運動神經元的數目在 E18 時減少了約 79% (Riethmacher et al., 1997)，顯示許旺細胞跟肌肉一樣都對運動神經元的生存相當重要。在過去 研究中發現，發育中的許旺細胞會製造多種的 neurotrophic factor，例如 glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) 以及 TGF等。所以，ErbB3 null mutant 的老鼠因為不能生成許旺細胞而無法提供給運動神經元需要的 NTFs。
第五節、 BMP superfamily
骨形成蛋白 (bone morphogenetic proteins, BMPs) 最早被發現其可以誘導 細胞分化形成骨頭，故命名為骨形成蛋白(Wozney et al., 1988)。BMPs 是 TGF
superfamily 中最為龐大的一群蛋白質，至今已發現超過 20 種 BMPs。就如同 TGF family 中其他成員，BMPs 的受體為 type I 以及 type II 受體共同組成的 複合體。Type II 受體具有與 ligand 結合的專一特性，而 type I 受體決定下游訊 息傳遞路徑的活化。目前已知 type II 受體有五種而 type I 受體有七種 (Shi and
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Massague, 2003)，五種 type ll 受體包含 TGF type II receptor (TRII)、BMP type II receptor (BMPRII)、Mullerian inhibiting substance type II receptor (MISRII) 以及 activin type II receptor (ActRIIA 及 ActIIB)，而 type I 受體則包 括 activin receptor-like linase (ALK)-1 到 ALK-7 共七種。其中，BMPs 會與 BMPRII、ActRIIA 及 ActIIB 三種 type II 受體結合，並且與 ALK-2、ALK-3 及 ALK-6 三種 type I 受體結合(Labeur et al., 2010)。
如附錄一顯示，BMPs 以 homodimer 或是 heterodimer 的形式與 type II 受 體結合後會跟 type I 受體形成複合體，type II 受體會磷酸化 type I 受體的 GS domain (Wrana et al., 1994) ， 接 著 活 化 的 type I 受 體 會 磷 酸 化 下 游 receptor-regulated Smad (R-Smad) 的 C 端 Ser-Ser-X-Ser (SSXS) motif 中的 serines，R-Smad 包括 Smad 1、Smad 2、Smad 3、Smad 5 以及 Smad 8 (Kretzschmar and Massague, 1998)。活化的 R-Smad 會與 Smad 4 (亦稱為 Co-Smad) 結合形成 R-Smad/Co-Smad 複合體，並且進入細胞核內調控目標 基因的轉錄作用(Chen et al., 1997)。除了經由 Smad 傳遞訊息之外，BMPs 亦 會經由其他途徑傳遞訊息，曾有研究指出 BMPs 能夠調控 p38、MAPK、ERK、
NFkB 及 PI3K 等 intracellular mediators 引起下游機制反應(Sieber et al., 2009;
Bragdon et al., 2011)，另外，BMPRII 的 cytoplasmic tail 透過 LIM kinase 1 (LIMK1) 及 c-Jun N-terminal kinase (JNK)，其會影響調控細胞骨架動態的因 子(Foletta et al., 2003; Podkowa et al., 2010)。
一、 BMP4
BMP4 最早被發現在皮膚或肌肉中表現可以誘導異位性 (ectopic) 骨頭及軟 骨的形成(Wozney et al., 1988)，由 408 個胺基酸 (amino acid, aa) 所組成之 prepropeptide，其中包含 N 端 19 個胺基酸的訊息序列 (signal sequence)、
273 個胺基酸的 prodomain 以及 C 端 116 個胺基酸的 mature peptide，
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prodomain 及 mature peptide 皆具有兩個 N-linked glycosylation site，而 mature peptide 內含有七個 cystein(Wozney et al., 1988; Sieber et al., 2009)。
所以，就如同其他 TGF superfamily 成員，BMP4 一開始被產生出來時作為較 大的 precursor，經由 protease 作用後形成 mature dimer form，接著釋放到 細胞間質 (extracellular matrix) 中(Suzuki et al., 1993)，其七個 cystein 可以 讓 BMPs 之間產生共價雙硫鍵 (covalent disulfide bond)，使 BMPs 聚合成 homodimer 或 heterodimer 以形成具有活性的訊號傳遞因子(Nohe et al., 2004)。
二、 BMP4 之受體
曾有研究指出，BMPRII 具有不同的 variant。Long form BMPRII 由 1038 個 胺基酸所組成，其 kinase domain 後面接著富含 serine/threonine residues 的 較長 C 端，而 short form BMPRII 則是缺少 C 端並且在多數細胞中較為稀少 (Beppu et al., 1997)。BMPRII 表現在許多不同的組織上，例如骨骼肌、心臟以
曾有研究指出，BMPRII 具有不同的 variant。Long form BMPRII 由 1038 個 胺基酸所組成，其 kinase domain 後面接著富含 serine/threonine residues 的 較長 C 端，而 short form BMPRII 則是缺少 C 端並且在多數細胞中較為稀少 (Beppu et al., 1997)。BMPRII 表現在許多不同的組織上，例如骨骼肌、心臟以