第三章 實驗結果
第二節、 BMP4 參與調控運動神經元與肌肉之間的機制
vitro model (Ling et al., 2005)，故為了瞭解哪些 BMPRII ligand 參與運動神經 元及肌肉之間的機制，我們利用 NG108-15 神經細胞(圖二 A) 以及 C2C12 肌 肉母細胞株養成成熟的肌小管(圖二 B) 觀察 BMPRII ligand 之表現。其中 BMP4 mRNA 在肌小管上有高度表現，相反地在神經細胞上的表現量極少(圖二 C)。
另外，根據本實驗室之前的資料顯示，利用雷射顯微擷取儀(laser capture microdissection, LCM) 取得運動神經元組織後觀察 BMP4 mRNA 表現量，發 現與在 NG108-15 神經細胞上表現情形一致，BMP4 mRNA 在神經細胞中表現 量極少(Wang, 2006)。所以，BMP4 mRNA 在肌小管及神經細胞表現量上的差 異，提高了肌肉所分泌的 BMP4 參與運動神經元及肌肉之間作用機轉的可能 性。
為了瞭解肌肉所分泌的 BMP4 是否參與調控運動神經元及肌肉之間的作用 機制，我們首先利用免疫組織染色法發現肌肉會表現 BMP4 (圖三)，接著利用 與 rhodamine--bungarotoxin 的 double staining 實驗顯示 BMP4 聚集在肌肉 的 NMJ 處(圖三 C-E)。我們想要了解 BMP4 聚集在 NMJ 處的現象與運動神經 元及肌肉之間的關係，故進一步利用 muscle denervation 實驗觀察 NMJ 處 BMP4 的表現情形，過去曾有文獻指出，當老鼠的坐骨神經被切除七天後軸突 末梢之 presynaptic synaptophysin protein 會消失(Okada et al., 2006)，首先我 們確認了 muscle denervation 實驗的可行性 (圖四 A-F)，而後從 muscle denervation 實驗中我們觀察到 BMP4 聚集在 NMJ 處的現象消失了(圖四 G-I )，
此結果顯示肌肉的 BMP4 在 NMJ 中穩定表現需要來自運動神經元所分泌的訊 號因子。
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根據文獻研究顯示，Agrin 在 NMJ 發育過程時會被運動神經元所分泌，並 且誘導後突觸端乙醯膽鹼受體(acetylcholine receptor, AChR)聚集以形成穩定 的 NMJ (Reist et al., 1992)，故 Agrin 是廣泛研究於運動神經元與肌肉間作用 的調控因子。所以，我們更進一步探討 Agrin 是否會調控 BMP4 在 NMJ 處的 表現量及分布位置。首先，利用不同濃度的 Agrin 處理成熟的 C2C12 肌小管後 觀察 BMP4 mRNA 表現情形，結果顯示隨著 Agrin 濃度的增加，C2C12 肌小 管中 BMP4 mRNA 的表現量亦跟著增加 (圖五 A )，另外，我們也同時分析了 Agrin 對於 BMPRII 的調控情形，結果顯示 Agrin 不影響肌小管中 BMPRII 之 mRNA 表現量 (圖五 B)。而在 BMP4 protein 表現方面，實驗顯示相較於缺少 Agrin 處理的組別，加了 Agrin 處理的 C2C12 肌小管其 BMP4 抗體染色的螢光 強度有顯著上升，顯示 Agrin 可以促進 BMP4 蛋白質的表現(圖六)。然而，從 實驗中可知 Agrin 調控肌肉中 BMP4 mRNA 及 protein 的表現量，但卻不能誘 導 BMP4 聚集在 NMJ 處(圖六 A-F)，由上述實驗顯示，我們先前所觀察到 BMP4 聚集在 NMJ 處的現象可能需要來自運動神經元其他的訊號因子所調控。
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圖二、分化後的 NG108-15 細胞及 C2C12 肌小管中 BMP4 的 mRNA 表現量。
(A) 為培養四天之誘導分化的 NG108-15 細胞，神經細胞具有延長的 neurite。(B) 為培養五天之成熟 C2C12 肌小管，細胞融合形成長條狀。(C) 為分化後的 NG108-15 細胞及 C2C12 肌小管中 BMP4 的 mRNA 表現量比較，發現 BMP4 的 mRNA 在 C2C12 肌小管上表現量較多；n=3。實驗數值以 mean±SEM 表示。
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圖三、BMP4 表現在 muscle fiber 及 neuromuscular junction 處。利用 BMP4 之專一性抗體，觀察 BMP4 在肌肉組織中的表現情形。 (A)為 soleus muscle 之橫切圖，利用為 AEC 呈色，可見 BMP4 之專一性染色分布在肌肉束外圍組織，
並且部分區域具有較深色染色，如箭頭所示。 (B)為 non-immune rabbit IgG 處 理之 control 組。(C-E)從正常成鼠身上取得 soleus muscle 做 whole mount 免疫 螢光染色實驗，觀察 BMP4 與 neuromuscular junction 之間的分布位置。(C)利 用 rhodamine--bungarotoxin 標定乙醯膽鹼受體 (AChR)，代表 neuromuscular junction 區域，為紅色螢光。(D)利用 BMP4 抗體與 Alexa Fluor 488 chicken anti-rabbit IgG 標定 BMP4，為綠色螢光。(E) 為圖 C 及圖 D 之疊合圖，大部分 呈現黃色，顯示 BMP4 表現在 neuromuscular junction 處。圖 A 及圖 B 之比例 尺為 50 µm，圖 C 至圖 E 之比例尺則為 15 µm。
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圖四、Muscle denervation 後 BMP4 在 neuromuscular junction 處的表現。
將成鼠的坐骨神經摘除七天之後，取下成鼠之 soleus muscl 且利用 whole mount 免疫螢光染色法，觀察 BMP4 在 neuromuscular junction 處的分布情況。(A-C) 為正常組別之老鼠 soleus muscle，(A)利用 rhodamine--bungarotoxin 標定乙 醯膽鹼受體(AChRs)，代表 neuromuscular junction 區域，為紅色螢光。(B)利用 synaptophysin 抗 體 與 Alexa Fluor 488 chicken anti-rabbit IgG 標 定 synaptophysin，synaptophysin 為突觸小泡 (synaptic vesicle) 上之蛋白質，分 布在穩定的軸突末梢處，為綠色螢光。(C)為圖 A 及圖 B 之疊合圖呈現黃色，顯 示正常成鼠之 neuromuscular junction 表現穩定。(D-F)為 muscle denervation 組別之老鼠 soleus muscle，可觀察到將成鼠之坐骨神經摘除後，(D)後突觸端乙 醯膽鹼受體之紅色螢光不受影響，但圖(E)中 synaptophysin 之綠色螢光消失，
neuromuscular junction 處軸突末梢已受到破壞。(F) 為圖 D 及圖 E 之疊合圖，
沒有黃色呈色，顯示摘除坐骨神經七天後，neuromuscular junction 遭受破壞而 不穩定。(G-I)為 muscle denervation 組別之老鼠 soleus muscle，(D)後突觸端 乙醯膽鹼受體之紅色螢光不受影響，(E)利用 BMP4 之抗體與 Alexa Fluor 488 chicken anti-rabbit IgG 標定 BMP4 的表現。(F)為圖 D 及圖 E 之疊合圖，沒有 黃色呈色，顯示軸突末梢遭受破壞後，BMP4 的表現消失了。比例尺皆為 15 µm。
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圖五、神經性衍生蛋白 Agrin 調控 C2C12 肌小管中 BMP4 的 mRNA 表現量，
但不影響 BMPRII mRNA 表現量。(A)培養五天之成熟 C2C12 肌小管，以 2 ng/ml、
10 ng/ml 及 50 ng/ml 三種濃度之 Agrin 處理 16 小時後萃取 total RNA，再以 real-time PCR 分析三種不同濃度刺激下 BMP4 的 mRNA 表現量，可觀察到給 予的 Agrin 濃度越高，BMP4 之 mRNA 表現量會跟著增加，在 10 ng/ml 及 50 ng/ml 的濃度下達到顯著；n=6。(B) 培養五天之成熟 C2C12 肌小管，同樣以 2 ng/ml、10 ng/ml 及 50 ng/ml 三種濃度之 Agrin 處理 16 小時後萃取 total RNA，
最後以 real-time PCR 分析 BMPRII 的 mRNA 表現量，發現給予不同濃度的 Agrin 刺激，BMPRII 之 mRNA 表現量沒有顯著差異；n=6。實驗數值以 mean±SEM 表示，統計結果以 Student’s t-test 統計方法計算；* 代表 p < 0.05。
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圖六、神經性衍生蛋白 Agrin 調控 C2C12 肌小管中 BMP4 的 protein 表現量，
但不影響 BMP4 的表現位置。(A-C)在蓋玻片上培養五天之 C2C12 成熟肌小管，
經 10 ng/ml Agrin 處理 16 小時後以 1% paraformaldehyde 固定細胞，接著以 rhodamine--bungarotoxin 、BMP4 抗體及 Alexa Fluor 488 chicken anti-rabbit IgG 做免疫螢光染色實驗。 (A)利用 rhodamine--bungarotoxin 標定乙醯膽鹼受 體 (AChR)，箭頭所指為乙醯膽鹼受體聚集處，即紅色螢光。(B) 綠色螢光即為 BMP4 染色處，可觀察到 BMP4 分布在 C2C12 肌小管中。(C) 為圖 A 及圖 B 之 疊合圖，沒有黃色呈色，顯示 Agrin 會調控乙醯膽鹼受體之聚集，但不影響 BMP4 的分布位置。(D-F) 則為未經 Agrin 處理之對照組。(D) 沒有乙醯膽鹼受體聚集 之現象，無紅色螢光。(E) 綠色螢光為 BMP4，分布在 C2C12 肌小管中，其綠
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色螢光強度較圖 B 弱。(F) 為圖 D 及圖 E 之疊合圖。(D)利用 image J 軟體分析 Agrin 處理組與對照組之綠色螢光強度，各組分析至少 60 條以上肌小管，取得 數值後比較兩組 BMP4 抗體染色的螢光強度。結果顯示經 Agrin 處理之組別，綠 色螢光強度較高，代表相較於對照組，BMP4 的 protein 表現量有顯著增加；n=3。
實驗數值以 mean±SEM 表示，統計結果以 Student’s t-test 統計方法計算；**
代表 p < 0.01。
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第三節、 BMP4 亦是由 Schwann cell 所產生並且會於運動神經元中運輸 為了更加了解 BMP4 在運動神經元與肌肉之間作用機制中所扮演的角色，我 們亦利用免疫組織染色法觀察 BMP4 在坐骨神經( sciatic nerve)上表現的情況，
由坐骨神經縱切的染色圖可知 BMP4 會有高度表現(圖七 A)，而在坐骨神經橫 切的染色圖中發現 BMP4 的分布型態呈現半同心圓狀(圖七 B,D)，此型態與坐 骨神經橫切的 Schwann cell 染色圖(圖七 C,E)表現一致，故 Schwann cell 亦會 產生 BMP4。
假設肌肉纖維與 Schwann cell 皆是經由產生 BMP4 以達到調控運動神經的 功能，BMP4 應該會在軸突( axon )中被運送，就如同其他神經滋養因子 (Jiang et al., 2000a; Russell et al., 2000; Wang et al., 2007a)。所以我們進一步地做 nerve ligation 實驗，在老鼠的坐骨神經上打兩個結，經過 18-20 小時後取下坐 骨神經組織觀察 BMP4 的表現型態及運輸方向。坐骨神經縱切染色圖發現 BMP4 會堆積在打結處兩端(圖八 A-D)，顯示 BMP4 的運送方式為雙向運輸，
而 在 靠 近 神 經 末 端 的 遠 端 處 (distal) 堆 積 的 BMP4 可 能 是 來 自 於 肌 肉 或 Schwann cell 所分泌(圖八 D)。另外，由坐骨神經橫切的染色圖發現 BMP4 在 Schwann cell 中的表現程度下降並且型態出現點狀(圖八 E)，而此型態與軸突 染色型態一致(圖八 F)，故當坐骨神經受傷時，由肌肉或 Schwann cell 所分泌 的 BMP4 會被運送進運動神經之軸突內。
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圖七、BMP4 在坐骨神經 (sciatic nerve) 上的表現。(A) 坐骨神經之縱切圖，
利用 BMP4 之專一性抗體以 AEC 呈色，可觀察 BMP4 在坐骨神經上有表現。(B) 坐骨神經之橫切圖，箭頭所指為 BMP4 聚集處，顯示 BMP4 的分布呈半同心圓 形。 (C)坐骨神經之橫切圖，利用 S-100 beta 之抗體標定 Schwann cell，箭頭 所指為 Schwann cell，呈圓形或半圓形。(D)為圖 B 之區域放大圖。(E)為圖 C 之區域放大圖。圖 A 之比例尺為 200 µm，圖 B 至圖 E 之比例尺為 50 µm。
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圖八、Nerve ligation 後 BMP4 在坐骨神經 (sciatic nerve) 上的表現。將 nerve ligation 後 18-20 小時之成鼠犧牲，取出坐骨神經後包埋以組織切片及利用 BMP4 之專一性抗體，以 AEC 呈色觀察 BMP4 的表現情形。(A) nerve ligation 後坐骨 神經之縱切圖，圖中 ”p”代表近端處 (proximal)，靠近運動神經元，而 “d”則代 表遠端處 (distal)，靠近軸突末梢，由圖中可觀察到 BMP4 在打結處兩端皆有堆 積的現象，而在兩個結的中間沒有 BMP4 之染色。(B) 為圖(A)近端處之區域放 大圖。(C) 為圖(A)打結之中間區域放大圖。(D) 為圖(A)遠端處之區域放大圖。
(E) nerve ligation 後坐骨神經之橫切圖，箭頭所指為 BMP4 之染色，大部分呈 點狀。(F) 為正常成鼠之坐骨神經橫切圖，利用 neurofilament 之專一性抗體標 定軸突 (axon)，其分布情形如箭頭所指呈點狀。圖 A 之比例尺為 200 µm，圖 B 至圖 F 之比例尺皆為 50 µm。
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第四節、 軸突損傷會影響周邊組織中 BMP4 的表現
在許多文獻研究中發現，當神經受到損傷時周邊系統的衍生因子表現型態會 跟著改變(Ishii, 1989; Friedman et al., 1992; Sendtner et al., 1992; Jiang et al., 2000a)，然而，為了提升在 nerve ligation 實驗中靠近神經末端的遠端處(distal) 堆積的 BMP4 是來自於肌肉或 Schwann cell 所分泌的可能性，我們利用 nerve ligation 實驗進一步分析在坐骨神經受損情況下，肌肉組織、坐骨神經組織以及 腰椎處脊髓組織中 BMP4 mRNA 表現量。結果顯示當軸突受損時肌肉組織中 BMP4 mRNA 表現量會顯著增加，在坐骨神經組織中 BMP4 mRNA 表現量則 會下降，而在腰椎處脊髓組織中則是沒有差異(圖九)，故可知軸突損傷時會影
在許多文獻研究中發現，當神經受到損傷時周邊系統的衍生因子表現型態會 跟著改變(Ishii, 1989; Friedman et al., 1992; Sendtner et al., 1992; Jiang et al., 2000a)，然而，為了提升在 nerve ligation 實驗中靠近神經末端的遠端處(distal) 堆積的 BMP4 是來自於肌肉或 Schwann cell 所分泌的可能性，我們利用 nerve ligation 實驗進一步分析在坐骨神經受損情況下，肌肉組織、坐骨神經組織以及 腰椎處脊髓組織中 BMP4 mRNA 表現量。結果顯示當軸突受損時肌肉組織中 BMP4 mRNA 表現量會顯著增加，在坐骨神經組織中 BMP4 mRNA 表現量則 會下降，而在腰椎處脊髓組織中則是沒有差異(圖九)，故可知軸突損傷時會影