建 立 新 螢 光 表 現 系 統 暨 水 稻 異 黃 酮 代 謝 工 程 之 研 究 本 研 究 擬 建 立 一 水 稻 基 因 功 能 評 估 平 台，並進行水稻異黃酮代謝工程，以增加水稻的營 養價值。目前已建立一轉殖效率約 5-10%的 TNG67 轉殖流程，可供後續功能基因分析之用，亦可作為 日後水稻分子育種的基礎。另一方面，已完成 2 個 可融合螢光基因表現系統 (AcGFP 及 ZsGFP) 的建 構，經轉殖至 TNG67 後，以 PCR 及螢光顯微鏡進行 轉殖系的分析，結果確認均可在水稻中表現具有功能 的綠螢光蛋白質 (圖 25) 。此系統將可作為協助其它
較具挑戰性作物轉殖平台的建立，亦可應用於探討 目標蛋白質在細胞中的次細胞位置。此外，已將大 豆CHI 及 IFS 基因轉殖至 TNG67，冀能取得高異黃 酮累積的水稻。現已完成CHI、IFS、IFS::CHI 的表 現構築，並轉殖至 TNG67，各構築取得至少 5 個以 上的轉殖系。經由 PCR 及 real-time RT-PCR 的分析 結果，確認目標基因已轉入水稻基因體，並能表現 (圖 26)。後續研究將進行同質結合體的篩選及植株 的異黃酮含量分析，冀能進一步探討 CHI、IFS 及 IFS::CHI 基因在水稻異黃酮生合成路徑所扮演的功 能，期能取得 高營養價值之 高異黃酮累積 轉殖品 系。
圖 25 (A) pCAMBIA35SAcGFP 及 pCAMBIA35SZsGFP 之構築；(B) 螢光基因在癒傷組織表現之情形；(C) 螢光基因在轉殖 植株轉入之情形。
圖 26 (A) pCAMBIA1300、pCAMBIA35SCHI、pCAMBIA35SCHI 及 pCAMBIA35SIFS::CHI 之構築；(B) 各轉殖品系之 PCR 分析結果；(C) 各轉殖品系之 real-time RT-PCR 分析結果。
強效啟動子之選殖 本研究建構玉米 Ubi-1 啟 動子驅動螢光基因AcGFP 及 ZsGFP，設計引子，
利用 PCR 方式進行重組質體，並確認基因序列，
再次選殖於 pCAM1301 載體上，最後置入農桿菌 勝任細胞，進行基因轉殖 (圖 27A)。經農桿菌基 因轉殖至 TNG67 後，獲得不同株系轉殖株，並利 用螢光顯微鏡進行轉殖株系的觀察，結果確認均可 在轉殖的癒傷組織、根及葉等全株各部位皆可表現 綠螢光蛋白質 (圖 27B)，因此證明此構築確實可以 在水稻表現。此系統將可作為協助其它較具挑戰性 作物轉殖平台的建立，亦可應用於探討目標蛋白質 在細胞中的次細胞位置。
誘變水稻抗白葉枯病之轉錄體分析 本研究 是利用轉錄體學研究，尋找台農 67 號水稻的突變
株 對 抗 白 葉 枯 病 菌 (Xanthomonas oryzae pv.
Oryzae, Xoo）的抗性基因，獲得關鍵之抗性基因後 將用於未來分子輔助育種選拔，將此抗性基因導入 優良水稻栽培品種。依據植物生理反應將其防禦病 原 的 機 制 ， 區 分 為 五 個 分 子 過 程 (molecular processes)：基本防衛、病原辨識、訊息傳遞、基 因表現、全面啟動防衛 (圖 28)，本研究已找到一 些參與此五個過程的重要基因。運用基因表現倍率 (fold change) 分析水稻接種病菌後啟動的基因表 現變 化 ，結 合 KEGG 代 謝途 徑 資料 庫 分析 (表 3-10、3-11)，推測脂質訊息傳遞系統可能是該抗性 水 稻 重 要 的 防 禦 啟 動 機 制 。 運 用 基 因 本 體 分 析 (gene ontology)，發現病菌初期感染引起水稻表現 變化的基因蛋白質，主要位於細胞膜上與細胞核
圖 27 (A) pCAMBIAUbi::AcGFP 及 pCAMBIAUbi::ZsGFP 之構築；(B) 螢光基因在癒傷組織、根及葉等全株各部位皆可表現 綠螢光蛋白質表現之情形。
圖 28 植物對抗病原入侵的防衛五個分子過程。
內 (圖 29)，推測這些蛋白質的基因表現變化，將 大幅影響下游基因的表現模式，進而改變了整體組 織的生理代謝途徑。分析接菌後不同時間點 (0、
0.5、1.0、2.0、6.0、24、48h)，發現抗性水稻在接 種病菌後 0.5h 內已啟動防禦反應，在 48h 內，基 因表現變化量最大的時間出現在 0.5-6h 之間；另一 方面，感性水稻在 0.5h 內亦已出現受到病菌控制 的反應。
表 3-10 抗性與感性水稻之基因表現差異分析
表現變化倍率z
抗性上升─
感性下降y (代謝途徑)w
抗性下降─
感性上升x (代謝途徑)
1.5 825(45) 1324(53)
2 386(21) 670(25)
3 171( 7) 326(11)
z 在接菌後 0 h 至 0.5-6 h 基因表現倍率變化 1.5、2、3 倍。
y 轉錄體數目：抗性水稻表現量上升且感性水稻表現量下降者。
x 轉錄體數目：抗性水稻表現量下降且感性水稻表現量上升者。
w 參與之代謝途徑數目（KGEE 資料庫）標示於括弧內。
表 3-11 基因表現變化倍率 1.5 倍者參與的代謝途徑
KEGG 代謝途徑 抗性上升─感性下降 抗性下降─感性上升
途徑數目(獨有)z 基因數目 途徑數目(獨有) 基因數目
1.代謝 1.1碳水化合物 5 7 13(8) 19
1.2能量 4(3) 4 3(2) 7
1.3脂質 7(5) 9 4(2) 6
1.4核甘酸 2 4 2 3
1.5胺基酸 5(2) 7 8(5) 8
1.6其他胺基酸 － － 2(2) 6
1.8輔因子與維他命 1 3 3(2) 3
1.9醛類與多酮類 1(1) 1 1(1) 2 1.10其他二次代謝物合成 2(1) 4 3(2) 11
1.11異生素分解與代謝 1 1 1 2
2.基因訊息過程 2.1轉錄 2(1) 5 2(1) 3
2.2轉譯 2 6 2 4
2.3摺疊、分類與分解 5(1) 8 4 6
2.4複製與修復 5(3) 5 3(2) 3
3.環境訊息過程 3.2訊息傳導 1(1) 3 － －
4.細胞過程 4.1運輸與異化 1 3 2(1) 5
5.生物系統 5.9環境調適 1(1) 1 － －
z 抗性上升─感性下降或抗性下降─感性上升之表現基因參與之獨有代謝途徑。
圖 29 水稻接種病原後表現量發生變化基因之基因本體 (gene ontology) 分析。
水稻抗白葉枯 病之蛋白質二 維電泳分析 水 稻是全球主要糧食作物，亦是台灣現階段農業發展 不可或缺之重要作物。由 Xanthomonas oryzae pv.
oryzae（Xoo）所引起的細菌性病害白葉枯病是危害 水稻最嚴重的主要病害之一，嚴重危害時會造成水 稻減產 50%以上。本研究利用國內具有強感染力的 白葉枯病原菌株（XF89-b），以剪葉法接種於感 病品系 IR24 及其抗白葉枯病近同源系 IRBB66（屬 IRRI 培育之品系，具有 5 個已知抗白葉枯病單一基 因 Xa4、xa5、Xa7、xa13、Xa21），分別於接種後 7 天、14 天、21 天及 28 天調查病斑長度並拍照，
以確定 IR24 及 IRBB66 對國內菌株之抗感病性，發 現具多個抗病基因對國內菌株 XF89-b 具有一定 抗性（圖 30）。另為釐清水稻對白葉枯病菌的抗性 機制，利用 pH 4-7 的蛋白質二維電泳分析，探討 IR24 與 IRBB66 抗感病品系間之差異表現蛋白質，
結果可發現 5 個差異表現之蛋白質點，分別以 B1、
B2、B3、B4 與 B5 表示之（圖 31）。後續將進一 步利用 LC-MS/MS 進行蛋白質點的鑑定及功能性 註解，以進一步釐清這些蛋白質在水稻抗病機制中 所扮演的角色。