反意寡核苷酸抑制基因表現之原理及應用

DNA 以模板股 (template)轉錄出來的 RNA 為 sense RNA，與 模板股互補的那一股 DNA 稱為非模板股(non- template)，而根據 non- template 股所轉錄出來的 RNA 即為反意 RNA (antisense RNA)。使用反意寡核苷酸之目的在於抑制某特定基因產物之完 成，其應用之原理為利用表現出標的基因之反意股約數十個寡核 苷酸與標的基因之 RNA 序列互補而結合，如此標的基因便無法 順利進行轉譯作用合成蛋白質(Green et al., 1986)。

壹、反意寡核苷酸抑制基因表現的機制

一、反意寡核苷酸直接擷抗於mRNA 的密碼區(coding region) 使得合成蛋白質的延長過程被阻斷，此外，反意寡核苷酸 直接與mRNA 上任一區域結合會引起 mRNA 構形的改變 而干擾蛋白質的轉譯(Oppenheim et al., 1991)。

二、反意寡核苷酸抑制蛋白質轉錄的起始作用(initiation)，藉 由與mRNA 促進區(promoter region)或起始區(initiator region)附近的序列結合，使得核糖體的複合體(ribosomal complex)無法順利與 mRNA 結合，造成轉譯的起始作用受 抑制(Kitajima et al., 1992)。

三、當轉譯作用於細胞質進行時，表示RNA 在細胞核經由剪 接(splicing)的過程成為具生物活性的型態，此時反意寡核 苷酸可以直接作用於pre-mRNA 透過抑制 polyadenylation 或阻斷穿透(transport)至細胞質的過程而達到抑制基因表 現的效果。反意寡核苷酸直接與剪接連結(Splice junctions) 結合會干擾mRNA 的成熟，而造成基因表現受阻(Kulka, 1989)，

四、未與反意寡核苷酸結合的mRNA 會被 RNase H 分解 (Cerritelli, 1998)而無法表現。

貳、設計反意寡核苷酸抑制標的基因的原則

在體外試驗中，30 個核苷酸足以用於南方或北方墨點法 (Southern or Northern blotting)的探針，反意寡核苷酸可以抑制基 因最小的長度為12 個核苷酸，一般建議於細胞中最適當的反意 寡核苷酸長度為14 至 25 個鹼基(Herschlag, 1991; Manche

1992)，根據以上的原理，設計反意寡核苷酸抑制標的基因的原 則為：

一、若希望其抑制轉譯的起始過程可以選擇剪接後mRNA 5’cap 端至接近轉譯起始密碼(AUG)之間的核苷酸或選擇 可以抑制 nuclear processing 的過程的序列。

二、確定該序列不會自體互補。

三、此反意寡核苷酸的鳥嘌呤(guanine)的比例不可以超過 36%，或連續出現 3 個以上的鳥嘌呤否則其水溶性會降 低。

此外，反意寡核苷酸的碳骨架須經適當的修飾，若其骨架 未經修飾直接進入體內，則半衰期可能只有五分鐘，為了避免 反意寡核苷酸被水解，發展出由甲基取代氧離子的反意寡核苷 酸(Tidd and Warenius, 1989)，這種甲基化的核苷酸在小鼠細胞質 半衰期約6分鐘，或者以硫離子取代氧離子形成硫代磷酸酯，硫 代磷酸酯修飾過的核苷酸骨架骨架在細胞質的半衰期依設計的 結構不同大約為50分鐘至40小時(Schlingensiepen and et al., 1997)，硫代磷酸酯核苷酸與RNA的二級結構結合時親和力較 低，此外，還有以其他各種取代的基團用於修飾反意核苷酸但 是仍有專一性、穩定性及細胞毒性等因素造成研究結果不理想 (Summerton and Weller, 1997)。

基於早期所設計修飾過的反意核苷酸不論在核苷酸專一 性、效率以及細胞毒性上都不能完全符合實驗的需求，美國的 Gene tools 生技公司研發出一種稱為 morpholino 的反意核苷酸，

其化學式為將五碳醣插入氮離子改成六環結構，而連結碳骨架

的磷酸根其中一個氧離子也置換成氮離子(Summerton and Weller, 1997)，這種結構具核切酶(nucleases)抵抗性可穩定存留 於細胞內較長的時間、可避免產生出具毒性的裂解物質、作用 效率高、可避免 RNase H 對與目標 RNA 相似的非目標 RNA 產 生裂解作用、序列專一性為硫代磷酸酯核苷酸的100 倍，即使 在高濃度狀況下使用也不會降低其專一性，對目標RNA 結合能 力強，可侵入目標 RNA 的二級結構，達到與 RNA 穩定結合的 目的，並且在細胞質及細胞核內皆有活性(Summerton and Weller, 1997)。

理論上，反意寡核苷酸可被發展和應用在中止任何基因物 合成，實際上反意寡核苷酸分子已被用於治療各型的骨髓瘤 (myeloma，Barille-Nion, 2003)、血管損傷(Janssens, 2003)和肺 癌、淋巴癌等多種癌症(Stahel et al., 2003; Kim et al., 2004)，同時 也是製藥界和臨床發展基因療法的一個方向(Biroccio et al., 2003)。

根據Paria 等人(1992)的研究，利用 c-myc 的反意寡核苷 酸抑制胚胎發育，建立了減低早期胚胎基因表現的研究模式，

近年來陸續有學者應用反意寡核苷酸做為研究著床前期胚胎發 育的工具來研究諸多基因在早期發育所扮演的角色，例如 E 鈣

粘附素 (E-cadherin, Ao and Erickson,1992)、鈉、鉀三磷酸腺苷 酸( Na⁺, K⁺-ATPase, Jones et al.,1997)及第二型去氧核糖核酸拓 樸異構酵素(DNA topoisomerase II, St Pierre et al., 1997)等，利用 反意寡核苷酸抑制基因的表現可以解釋某些基因在著床前期胚 胎表現調控的機轉。