實驗方法

實驗小鼠飼養於李茂盛婦產科診所之動物室，新購入之小 鼠需適應環境二週後才開始實驗，動物室的光照週期條件為 12 小時光照(清晨六點至傍晚六點)，12 小時之黑暗週期(傍晚 六點至清晨六點), 飼養溫度維持在攝氏 20-24℃之間，於飼養 期間給予充分的水及飼料，使用飼料為美國Diet Test 齧齒類 動物飼料，主要成分為粗蛋白 23 %、粗脂肪 4.5%、粗纖維 6.0%、灰份 8.0%、礦物質 2.5%，其餘部分(56%)為碳水化合 物。小鼠之飲用水為逆滲透膜過濾過之飲水，本動物實驗已

經 動 物 實 驗 管 理 小 組(Institutional Aminal Care and Use Committee, IACUC)核准。

貳、誘發小鼠之超級排卵與配種(Nagy et al., 2003 a)

為取得大量著床前鼠胚進行著床試驗，母鼠必須在配種前 施打外源性性腺激素，本實驗以中國化學製藥廠製造的動物用 血清哥娜性腺激素(gonadotropin)，仿造 FSH (follicle-stimulating hormone)之功能，刺激卵巢濾泡的成熟，並配合中國化學製藥廠 製造的動物用哥娜，即人類絨毛膜性腺激素，仿造黃體促素 (luteinizing hormone, LH)之功能，幫助排卵，以便於配種後獲得 較多數量之受精卵。為正確掌握排卵時間，人類絨毛膜性腺激 素必須於內源性之黃體促素釋出前注射。通常性腺激素與人類 絨毛膜激性腺素注射時間相隔42 至 48 小時。配種後隔天早上，

若在母鼠陰道內發現由公鼠精液之膠質所形成之陰道栓(vaginal plug)，即可判定母鼠已與公鼠交配成功。本實驗於母鼠腹腔內 注射血清性腺激素5 IU，46 小時後再以腹腔注射方式注射人纇 絨毛膜性腺激素 5 IU，人類絨毛膜激性腺素注射完後隨即將母 鼠置入公鼠籠內，準備進行交配。交配後隔天觀察有無陰道栓(圖 一 A)的形成，有則表示公鼠與母鼠完成交配。

參、小鼠胚胎之收集及培養(Nagy et al., 2003 b)

收集小鼠胚胎之前須配製人類輸卵管液培養基 (Quinn 1995)，此培養基的成分為：NaCl 101.6 mM, KCl 4.69 mM, KH2PO4 0.37 mM, MgSO4^˙7H2O 0.2 mM, Na Lactate 60 % syrup 21.4 mM, Na pyruvate 0.33 mM, Glucose 2.78 mM, NaHCO3 2.78 mM, CaCl2^˙2H2O 2.04 mM, penecillin-G streptomycin 2000 IU/l, phenol red 1% ， 取胚前一天，將人類輸卵管液培養基以 20μl 為一滴，滴於35-mm 培養皿中，再覆蓋礦物油於培養基上，置 於37℃，5％二氧化碳培養箱中過夜，以調整酸鹼值，待用。

將懷孕母鼠以頸椎脫臼法犧牲，即一手置於母鼠之頸部處 固定，另一手抓住尾巴往後拉，使頸椎脫臼。接著解剖母鼠取 出其輸卵管，先用酒精噴灑於母鼠之腹部，以外科剪刀在腹部 剪一小洞，用手將其皮膚向外拉扯，直至露出腹部肌膜，剪開 腹膜，將生殖道拉出剪下輸卵管，放入人類輸卵管液培養基液 滴中，將接裝有人類輸卵管液培養基注射針筒之磨鈍的 30G 注 射針刺入繖部的洞口以眼科鑷子夾緊注射針與繖部，緩緩將人 類輸卵管液培養基注射入輸卵管中收集單一細胞期胚胎，在解 剖顯微鏡下以吸管收集鼠胚後，放入回溫之玻尿酸酶內數分鐘 以去除卵丘細胞(cumulus cells)。等卵丘細胞開始脫落擴散時，

即可以玻璃毛細管吸吐受精卵數次，以去除包被於鼠胚外之卵

丘細胞，再以人類輸卵管液培養基清洗受精卵後，將胚胎放入 事先準備好已調整酸鹼值及溫度並覆蓋礦物油之人類輸卵管液 培養液中，置入培養箱內培養，每天觀察、記錄胚胎生長狀況。

肆、小鼠囊胚之分級

本實驗採體外培養的方式得到不同型態的囊胚，由於小鼠 胚胎較小且內細胞團級滋養外胚層細胞不易再做區分，所以只 以囊胚腔的大小作分級，小鼠囊胚期胚胎依囊胚腔的大小及是 否孵化分成三組：第一組囊胚腔小於或等於胚胎一半的體積，

第二組囊胚腔大於胚胎一半的體積，第三組為剛開始孵化的囊 胚(圖二) 。

伍、囊胚直徑之測量

為了評估胚胎分級後實際的大小，我們將胚胎直接至於相 位差顯微鏡下，以 200 倍的倍數觀察包含透明帶的囊胚直徑，

利用事先置於接目鏡內的尺測量，呈圓形的胚胎測量任選的兩 段互相垂直的直徑，若胚胎呈橢圓形則測量最長及最短的直 徑，每個胚胎分別測量兩次並紀錄後接著進行核差別染色。

陸、囊胚期胚胎之核差別染色(differential stain)

為了進一步評估我們對胚胎分級後，每一組囊胚的細胞總 數目、內細胞團細胞數目及滋養外胚層細胞數目我們採用胚胎

免疫手術(immunosurgery)之原理對囊胚進行核的染色(Piekos et al., 1995)，以 96 孔培養皿操作，先以 pH 2.5 的 Acid Tyrods’溶 液將囊胚的透明帶去除，將胚胎培養於含有10 mM

trinitrobenzene- sulphonic acid, 4 mg/ml polyvinylpyrrolidone 及 0.015%的 Triton X-100 的 M16 培養液中，置於冰上 10 分鐘後 以M2 培養液洗滌三次以上，接著將胚胎培養於含有 0.1 mg/ml anti-dinitrophenol (DNP)-bovine serum albumin 的 M2 培養液 中，於37℃作用 15 分鐘後以 M2 培養液洗滌三次以上，將胚胎 培養於以M2 培養液十倍稀釋的天竺鼠血清補體(guinea pig complement serum)中，並添加 10 µg/ml 的紅色螢光試劑

propidium iodide，於 37℃作用 15 分鐘後以磷酸緩衝液洗滌三 次以上，然後將胚胎置於含有22 µg/ml 的藍色螢光試劑

bisbenzimide 的絕對酒精中，存放於 4℃，經隔夜作用後，將胚 胎固定在載玻片上，以甘油使脫水的胚胎漲大，再以蓋玻片覆 蓋在胚胎上輕壓一下後，以螢光顯微鏡調整至UV-2A 及 G-2A 兩種濾鏡觀察。滋養外胚層細胞會呈現紅色的螢光，而內細胞 團會呈現藍色的螢光，分別記錄胚胎的細胞數目。

柒、公鼠輸精管結紮(Nagy et al., 2003 c)

由於進行胚移置(embryo transfer)前受胚母鼠需處於假懷

孕(pseudopregnancy)狀態，使子宮環境處於適合胚發育之階段，

故需以經輸精管結紮之公鼠與母鼠交配，挑選八週齡以上配種 能力強之公鼠進行輸精管結紮，公鼠於術後兩週即可用於配種。

本實驗採用之麻醉劑為戊巴比妥鹽，注射小鼠的劑量為 100mg/kg，使用前秤 10 mg 直接溶於 1 ml 之生理食鹽水中備 用，此種麻醉劑注射小鼠依體重每10 克以 0.1 ml 注射公鼠。注 射時以手指抓緊小鼠背頸部皮膚以固定之，以l ml 之針筒、27G 針頭吸取藥劑，於下腹一側鼠蹊部將針頭穿刺入腹腔中，避免 針頭刺到膀胱等臟器，緩緩將藥劑注入腹腔內，並於針頭抽出 前停留一會以避免藥劑隨針頭抽出而流出體外。

公鼠結紮乃以手術方式進行，手術前應以濕熱方式將手術 器械滅菌(autoclave)，將公鼠秤重並依體重注射麻醉劑至腹腔 中，接著將公鼠平置於手術墊布、腹部朝上，以75％酒精消 毒腹部，以剪刀於腹部皮層及肌肉層切開一個約1.5 公分之傷 口，接著於腹腔壁附近尋找連接睪丸及輸精管之脂肪塊(fat pad)，並以鑷子小心將其拖出體外，以眼科夾固定部分輸精管 後，以酒精燈燒紅之鑷子夾斷並移除一小斷輸精管，將結紮完 成之輸精管連同睪丸及脂肪塊小心置回腹腔中，再以相同之步 驟處理另一側之輸精管。完成結紮後，以手術針、線分別將肌

肉層及皮層逢合，將術後公鼠移置籠中待其恢復後再移回勳物 房，手術後兩週之輸精管結紮公鼠即可開始用於配種。

捌、懷孕母鼠之準備與胚移置(Nagy et al., 2003 d)

受胚母鼠必須具備母性良好且窩仔數高之特質，一般選擇 混種品系(out bred)，本實驗採用目前使用最廣泛之 ICR，其母 性較佳、窩仔數多且同籠之母鼠可共同哺育仔鼠。

植入囊胚的前3 天，將母鼠作陰道抹片檢查(圖三)，選擇 抹片結果為動情期的發情母鼠與輸精管結紮之公鼠交配，隔天 選取具有陰道栓(圖一 B)的母鼠，將這些母鼠分籠飼養以作為假 懷孕之受胚母鼠。進行胚胎移置手術時，受胚母鼠秤重後以戊 巴比妥鈉進行全身麻醉，置於90-mm 培養皿中央，並於背部以 75％酒精清潔及消毒體表，以解剖剪刀於背中線距尾部約 2 至 3 公分處之皮層切一小於 l 公分之橫向開口，滑動開口至一側 卵巢上方，由體璧外可見附著於卵巢上之脂肪，將此處之體璧 剪一小開口，以較鈍之鑷子拖出脂肪使卵巢、輸卵管及一小段 子宮角露出後，以止血鉗夾住脂肪以固定位置，將受胚鼠移至 立體顯徽鏡下，以眼科鑷將子宮角固定後、於距離子宮輸卵管 交接處約5 mm 處以 26 G 之鈍針避開血管，刺一小洞，確定針 頭進子宮角內後將其抽出。

事先將囊胚移至含 5% 胎牛血清的人類輸卵管培養液 中，以內徑約200 µm 之玻璃吸管吸取少量培養液，製作兩三段 氣泡，吸取 5 至 7 個囊胚。將玻璃吸管插入子官角之小洞中，

吹動吸管至囊胚後方之氣泡到達吸管尖端為止，勿將氣泡吹 入，等待數秒再將吸管抽出，將生殖道置回體內，並以相同方 式進行另側之移置。縫合體壁及皮層開口塗抹碘酒且置回鼠 籠。評估注入血癌抑制因子反意寡核苷酸之胚胎發育至囊胚的 著床能力時，為了排除受胚母鼠個體差異造成的著床結果干 擾，同一隻受胚母鼠的雙邊子宮，一邊植入無意義序列注入胚 胎的控制組囊胚，另一邊的子宮則植入注入血癌抑制因子反意 寡核苷酸注入後而形成的囊胚。囊胚植入兩天後以將母鼠麻 醉，以1%芝加哥天空藍由母鼠尾部靜脈注射約 0.2 ml，再將母 鼠腹腔的皮毛及肌肉剪開，若胚胎有著床則可以看到一小團藍 色胚胎著床後的囊(sac)(圖四)，計算著床於子宮腔的胚胎數目。

玖、顯微注射法

一、反意寡核苷酸之製備

本實驗所設計之血癌抑制因子基因的反意寡核苷酸是 直接委託Gene tool (U.S.A.)公司製造標定 FITC 的抑制血 癌抑制因子反意寡核苷酸，以該公司軟體設計阻礙RNA

表現最高的一段序列為模板，抑制血癌抑制因子反意寡核 苷酸的序列為: GACCTTCATTATGGGCTGGACTCTA (156~180)，另外也購入一段無意義的序列注入對照組鼠胚 (nonsense Control): ATCAGGATTGGTGG CATC

TTCCCAG 以排除注射時血癌抑制因子反意寡核苷酸以外

TTCCCAG 以排除注射時血癌抑制因子反意寡核苷酸以外