血癌抑制因子對著床前期小鼠胚胎發育之研究 Studies of the leukemia inhibitory factor on

(1)

中山醫學大學生物化學研究所博士論文

Ph.D. Thesis, Institute of Biochemistry, Chung Shan Medical University

血癌抑制因子對著床前期小鼠胚胎發育之研究 Studies of the leukemia inhibitory factor on

preimplantation mouse embryo development

指導教授：劉哲育博士 (Jer-Yuh Liu)

研究生：鄭自君 (Tzu-Chun Cheng)

中華民國九十三年一月

January, 2004

(2)

誌謝

感謝李茂盛教授及黃俊嘉主任在我對研究工作感到莫名的倦怠時，適時的鼓勵我，給予我在職進修的機會，並在這四年多來對我的研究全力的支持，讓我得以在無經濟壓力下完成博士論文。

博一時，經歷九二一大地震後，所飼養的小鼠，竟然全數無法生育，生殖的實驗完全停擺，天災帶來的挫折讓我重新思考研究的方向。然而，不管遇到多大的困難，恩師劉哲育博士始終孜孜不倦的指導我，每每在與老師抽絲剝繭的討論之後，真相呼之欲出，使我真正體會到「處處留心皆學問」的道理，在劉老師的指導下，我得以積極樂觀的完成博士論文的研究，衷心感謝老師的教誨及啟發。

感謝王錫崗老師、李碧雪老師、李茂盛老師、林培正老師以及黃志揚老師撥冗為我的論文作進度審查及口試，並且不吝指正使我獲益良多，終能順利完成論文的寫作。

感謝全體生化所老師們的在課業上的指導及生活上的關懷；實驗室的好夥伴：意維、逸憲、旻庭、競爵、建宏、玉晴、婉齡、佩珍、

滄澤、應醫師等謝謝大家的幫忙；我的好同事：陳忠義醫師、洪銘洲組長、大惠美、小惠美、秋萍、秀惠、奕臻、香苓、玉霞、永慧，謝謝你們在我實驗及撰寫論文的過程中不斷的鼓勵我。

最後我要感謝我的婆婆、媽媽、姐姐、我的先生及兒子，謝謝你們做我強大而溫暖的精神支柱！

僅以今日的研究成果獻給以上支持及關愛我的師長、夥伴、同事及家人，但願持續的研究，探索出更多生命科學的奧秘，以供臨床醫學應用。

(3)

胚胎能否順利著床取決於著床前期胚胎和子宮內膜的發育狀況，血癌抑制因子(leukemia inhibitory factor)是著床及成功懷孕所必須的因子，但是血癌抑制因子在著床前期胚胎發育所扮演的角色並不十分清楚。本論文針對血癌抑制因子對胚胎發育的調控做研究，首先評估在正常培養狀況下，小鼠囊胚期胚胎型態與著床率之關聯，將在體外培養形成的囊胚依囊胚腔形成的大小以及是否孵化分成三組。分別植入假懷孕母鼠的子宮內，比較胚胎型態，

包括囊胚直徑、囊胚細胞數目等與著床率的關聯性，我們的結果指出，囊胚腔較小則內細胞團(inner cell mass)、滋養外胚層細胞 (trophectoderm)及內細胞團與滋養外胚層細胞比值皆明顯下降，導致胚胎著床率也下降，已孵化的胚胎會有最高的著床率。藉由體外培養及胚胎植入模式的建立繼續探討於雙原核時期顯微注射血癌抑制因子反意寡核苷酸(antisense)抑制胚胎內血癌抑制因子的表現，並觀察其對著床前期鼠胚發育的影響。注射0.25 fmol 血癌抑制因子反意寡核苷酸後，胚胎的發育不受影響，注射 0.5、1.0 fmol 及 2.0 fmol 血癌抑制因子反意寡核苷酸後，胚胎繼續發育至桑甚胚期及囊胚期的比例則有意義的降低，注射 4.0 fmol 血癌抑制因子反意寡核苷酸則胚胎無法發育到四細胞期以上。測定胚胎中血癌抑制因子的免疫活性則有隨著血癌抑制因子反意寡核苷酸注入濃度升高而下降的趨勢。注射2.0 fmol 血癌抑制因子反意寡核苷酸後，測量囊胚的直徑、胚胎細胞總數目、內細胞團(inner cell mass, ICM)及滋養外胚層(trophectoderm, TE) 的細胞數目以及內細胞團滋養外胚層比值皆有意義的降低，將注射 1.0 及 2.0 fmol 血癌抑制因子反意寡核苷酸後未孵化的囊胚植入的子宮中，各組囊胚著床率皆顯著的降低。添加50 ng/ml 的血癌抑制因子於培養液時可以有效的改善注入血癌抑制因子反意寡核苷酸後胚胎受損的情形，本實驗結果指出血癌抑制因子在著床前期的胚胎正常發育上扮演相當重要的角色。

關鍵字: 血癌抑制因子、囊胚、內細胞團、滋養外胚層細胞、著

床前期

(9)

英文摘要

Good embryo development and receptive endometrium are essential factors for embryo implantation. Leukemia inhibitory factor (LIF) is an essential factor for implantation and establishment of pregnancy. However, its role in the development of preimplantation embryos remains controversial. The aim of this study is to assess the effects of LIF on development of preimplantation mouse embryo. We observe the relationship between the blastocyst morphology and the implantation rate for mice.

Mouse blastocysts were then classified into 3 grades: grade I, small blastocysts; grade II, large blastocysts; grade III, hatching blastocysts. Although there was no significantly different in the implantation rates between the grade III and grade II, grade I was significantly decreased as compared with grade III. Grade I and grade II was also significantly decreased in both the diameter of blastocysts and cell number of inner cell mass (ICM) and trophectoderm (TE) as compared with grade III. These findings indicated that the expanded and haching blastocyst selections for embryo transfer in in vitro culture were evaluated with the high implantation rate. We successfully established the model of in vitro culture and blastocyst transfer for following experiments of LIF. Changes in preimplantation embryos were determined after microinjection of LIF antisense oligonucleotide at the two-pronucleus stage. The 0.5- or 1.0-fmol treated groups had significantly lower percentages of embryos developed to the morula or blastocyst stage and the 2.0-fmol treated group had significantly lower percentages of embryos developed to the four-cell, morula, or blastocyst stage. No embryos developed to the four-cell stage in the 4.0-fmol treated group. Moreover, there was a decreasing trend in the levels of LIF immunoactivity with the increasing amount of LIF antisense oligonucleotide injected. The diameter of blastocysts in the 2.0-fmol treated group was significantly smaller than that in the untreated group. The blastocysts in this group had significantly lower numbers of blastomeres and cells in the ICM or TE and ICM/TE ratio. The 1.0- or 2.0-fmol treated groups had significant lower implantation rates than their corresponding control groups.

In the 2.0-fmol groups with supplementing exogenous LIF, significantly lower percentages were also observed in the four-cell, morula, and blastocyst stages.

However, blastocysts treated with 50 ng/ml LIF had a significant higher percentage than those in the LIF gene impaired group without LIF supplement. These results indicate that LIF is a critical factor for the normal development of embryos at the preimplantation stages.

Key words:leukemia inhibitory factor (LIF), blastocyst, inner cell mass (ICM), trophectoderm (TE), preimplantation stages.

(10)

第一章文獻回顧

第一節哺乳類動物著床前期胚胎發育的過程第二節影響哺乳動物著床前期胚胎發育之因子第三節哺乳類動物胚胎著床之機制

第四節囊胚期胚胎型態之評估

第五節血癌抑制因子之生化特性及生理功能 第六節反意寡核苷酸抑制基因表現之原理及應用

(11)

第一節哺乳類動物著床前期胚胎發育的過程

哺乳類動物會因為種(species)的不同而有不同的懷孕期 (gestation period)，就小鼠而言，不同的品系(strain)懷孕期長短亦不同。根據Theiler(1972; 1983)以 C57BL/6J 與 CBA 小鼠雜交 (hybride)得到的第一代子代所做的研究，可以將著床前期

(preimplantation) 之胚胎(embryo)發育分為五個階段：第一階段為交配(postcoitum)後 0 至 1 天(0-1 day p.c.)，此階段之胚胎為卵細胞 (oocyte)與精子(sperm)受精後，形成單一細胞之授精卵，精卵授精時啟動了卵細胞的第二次減數分裂(second meiotic division)，並且排出第二極體(second polar body) 。核膜(nuclear membrane)將來自父系和母系的染色體(chromosome)分別包圍起來而形成半套體 (haploid)的雄原核(male pronucleus)及雌原核(female pronucleus)，

雙原核發生融合後，接著進行DNA 複製及染色體重組等有絲分裂 (mitosis division)之過程(Maro et al., 1984; Schatten et al., 1985)。此時的胚胎位於輸卵管(oviduct)的壺腹區域(ampullary region)。

第二階段為交配後 1 天，胚胎發育為二細胞期，受精卵進行第一次分裂(cleavage)需 24 小時，其後約 10-12 小時分裂一次

（McLaren et al., 1982），二細胞期胚胎發育至中期時需要依賴大量來自母體卵子生成(oogenesis)時所遺留下來的蛋白和 mRNA 合

(12)

成，雙套染色體之轉錄活性被誘發也啟動胚源性基因(embryonic genes)的表達(Schultz, 1993)。來自母體卵子生成時製造的蛋白在這個階段仍然存在，但是來自母體的mRNA 已開始快速的降解 (degrade)(Kidder, 1992)，這時的胚胎已逐漸移向輸卵管中，逐漸遠離壺腹區域。

第三階段為交配後 2 天，胚胎發育為 4 至 16 個細胞期，胚葉細胞( blastomere)在分裂過程中，其表面結構亦產生變化，早期胚葉細胞表面平均分佈著微絨毛(microvilli )，發育到 8 細胞期時，

鄰近之細胞有類似細胞突起(lamellipodia-like)之結構相互接觸，胚葉細胞在分裂過程中，其表面結構亦產生變化，使細胞間更加緊密，此時胚胎之型態有極大的改變稱為致密化(compation ) (Ducibella and Anderon, 1975; Pedersen, 1986)，通常此時的胚胎已漸漸移向子宮和輸卵管的交接處。

第四階段為交配後 3 天，這個階段的胚胎由桑甚胚(morula) 進入囊胚(blastocyst)早期，囊胚的形成為胚細胞首次分化，此階段囊胚腔( blastocoel)開始形成，已可分辨內細胞團(inner cell mass) 及滋養外胚層細胞(trophectoderm cell)，在囊胚生長的過程，囊胚腔逐漸擴張增大(expanding)，外胚滋養層細胞變薄，且表面覆滿微絨毛，排列十分緊密，胚葉細胞彼此形成一連結複合物，並構

(13)

成一個密封的外圍，稱為滋養外胚層細胞，滋養外胚層細胞將形成滋養葉細胞(trophoblast)、胎盤組織(placenta tissue)以及胚體外之外胚層(extraembryonic ectoderm)，並負責囊胚內外的主動運輸，

及轉移營養之功能 (McLaren et al., 1982)。而內細胞團細胞較小以膜間聯繫連結，內細胞團細胞則主要形成胎體(somites)、卵黃囊 ( yolk sac)、尿膜(amnion )(Gardner 1983)，此時期的胚胎通常已位於子宮腔。

第五階段為交配後4 天，胚胎在此時期已進入囊胚後期，大部分之囊胚已脫離囊胚外包覆的透明帶(zona pellucida)，行成孵化之囊胚(hatching blastocyst)，胚胎孵化的過程是藉由滋養葉細胞合成類似胰蛋白酶(trypsin-like)的酵素，水解透明帶中的醣蛋白基質 (glycoprotein matrix)，孵化過程可以在體外單獨進行，若在活體的子宮腔發生，來自子宮腔的酵素也扮演重要的角色(Wassarman et al., 1984)，當囊胚完全孵化時，胚胎便進入著床的階段。

第二節影響哺乳動物著床前期胚胎發育之因子

著床前期的胚胎可以在沒有血流的供應下在生殖道中自由漂流，並且進行代謝、生長及分化。直到形成囊胚後才開始和母體的子宮有交流，因此，有學者認為外源性的生長因子對著床前期的胚胎是不需要的，在胚胎體外培養的過程僅需提供簡單的鹽

(14)

類、焦葡萄酸(pyruvate)及白蛋白(albumin)(Whitten and Biggers, 1968; Devreker et al., 1998)。隨著基因剔除(gene knockout)的應用才確定當老鼠缺乏某些基因時胚胎無法正常發育，如小鼠缺乏群落刺激因子-1(colony stimulating factor-1, CSF-1)或顆粒球巨噬群落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF) 時，囊胚的內細胞團細胞數目會降低 (Pollard, 1992;

Robertson et al., 2001)，缺乏血癌抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF) (Stewart et al., 1992)及上皮生長因子接受器(epidermal growth factor receptor, EGF-R)會導致著床失敗(Threadgill et al., 1995)。

生殖道及著床前期胚胎皆會分泌諸多的胜肽(peptide)生長因子及細胞動力素，藉由自體分泌(autocrine)、旁體分泌(paracrine) 與內分泌的作用方式促進胚胎的生長(Kane et al., 1997; Hardy and Spanos, 2002)，這些生長因子的接受器蛋白位於胚胎細胞表面包括：類胰島素生長因子家族(insulin like growth factor family, IGF family)、纖維母細胞生長因子家族(fibroblast epidermal growth factor family, FGF family)、乙型血小板衍生因子(platelet derived growth factor β, PDGF β)、及胰島素(insulin)、血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF)等，這些生長因子在胚胎

(15)

不同的發育階段表現以影響胚胎的生長，腫瘤生長因子家族(tumor growth factor family, TGF)由胚胎所分泌接受器位於生殖道，胚胎及生殖道皆會分泌上皮生長因子家族(epidermal growth factor family, EGF family)、乙型血小板衍生因子(platelet derived growth factor family, PDGF β)及血癌抑制因子，同時胚胎也具有該因子的

接受器。第一型類胰島素生長因子家族只在八細胞期表現，但是其接受器從一個細胞時期至囊胚期皆可以在胚胎細胞偵測 (Svalander et al., 1991; Boehm et al., 1990; Hardy and Spanos, 2002)。

Slager 等人(1991)利用組織免疫染色法，發現乙型轉型生長因子(transforming growth factor β, TGFβ)只特異的表現在滋養外胚層，在內細胞團則不存在，而甲型轉型生長因子(transforming growth factor α, TGFα)存在於內細胞團及滋養外胚層靠近內細胞團的部分(Derdik et al., 1992)，此基因發生缺陷時，囊胚會發生很高比例的細胞凋亡(Brison and Schultz, 1998)。其他促進囊胚形成有關的因子包括胰島素(insulin)(Harvey and Kaye, 1990)、類胰島素生長因子(Palma et al., 1997)、甲型轉型生長因子(Derdik, 1992)、

血癌抑制因子(Lavranos et al., 1995; Fry et al, 1992)、群落刺激因子 -1(Pampfer et al., 1991)或顆粒球巨細胞群落刺激因子(de Moraes

(16)

and Hansen, 1997; Robertson et al., 2001)。

此外，細胞動力素介白質-1(interlin-1, IL-1) 及介白質 -6(interlin-6, IL-6)也在著床前期的胚胎中被偵測到(Zolti et al., 1991; Simon et al., 1993; Sharkey et al., 1995), 並參與著床之功能。

第三節哺乳類動物胚胎著床之機制

著床時子宮的基質細胞(stroma cell)會因應囊胚或人工刺激，釋放組織胺(histamine)、前列腺素(prostaglandis)、白三烯 (leukotrienes)及血小板活化素(platelet activating factor) (Hearn et al., 1991; McMaster et al., 1993)，使纖維母間質細胞(Fibroblastic stromal cell)轉化為蛻膜細胞(decidual cell)，子宮內膜(endometrium) 的蛻膜化在荷爾蒙的調節上是經由雌性素(estrogen)和黃體素 (progesterone)誘發轉變而成的。在人類這種改變是由黃體激素 (progesterone)所主導，始於月經黃體期後期(late luteal phase)。在小鼠，黃體素和雌性素可加強生殖道中胚胎著床前的發育(Dey et al., 1980)，除此之外，著床前胚胎尚須要額外的旁泌因子才能完全發育及分化 (paracrine factor) (Bischof et al., 1998)。

著床前子宮與胚胎同步發育，胚胎發育至囊胚時子宮轉變為可著床狀態(receptive state)，胚胎僅在一個極短的時間內有機會附著到子宮內膜上，這個時期稱為著床窗口(implantation

(17)

window)(Psychoyos, 1995; Klentzeris, 1997)，HOX (homeobox )基因、細胞動力素(cytokines)、抑鈣素（calcitonin）、及細胞粘黏分子(cell adhesion molecules) 等都是子宮內膜是否接受胚胎著床的重要生物標記(Cavagna and Mantese, 2003)，小鼠子宮接受性僅在懷孕、假懷孕(pseudopregnancy)或適當給予黃體素或雌性素的有限時期發生(Paria, 1993; Sakoff and Murdoch, 1995)。當胚胎從輸卵管進入子宮，囊胚孵化後，胚胎滋養層細胞即自透明帶移行出來準備附著於子宮內膜上皮細胞(endometrial epithelium cell) 。

壹、影響著床的免疫因子

胚胎著床過程與免疫反應類似，胚胎著床的免疫抗排斥反應和黏膜系統不同，女性生殖道中，分泌免疫球蛋白 A

(immunologlobulin A)的漿細胞(plasma cell)位於子宮頸內 (endocervix)、子宮頸外(ectocervix)、陰道(vagina)及輸卵管 (fallopian tube)(Kutteh and Mestecky, 1994)，子宮內膜只偵測得到極少的漿細胞，子宮腔存在極少量的典型免疫球蛋白 A (Arends et al., 1983; Buckley and Fox, 1989)，胚胎著床的免疫反應缺乏典型的黏液免疫系統(mucosal immune system)，胚胎於蛻

(18)

膜所進行的著床免疫反應大部分是由白血球(leukocyte)所分泌的因子來完成。

為了防止入侵的滋養層細胞擴張，蛻膜上的巨大顆粒淋巴球(LGL, large granular lymphocytes)具有介白質-2(interleukin 2, IL-2)的接受體，會受到介白質-2 誘導後活化(Umehara and Bloom, 1990)，表現出自然殺手細胞(nature killer cell)的型態去毒殺典型自然殺手細胞的標的物(Robertson et al., 1996)，由於囊胚的外胚滋養層細胞有部分遺傳自父系，以免疫學之觀點應視為半同種異抗原(semi-allograft antigen)，但是胎兒細胞並沒有表現第一型人類白血球抗原(human leukocyte antigent, HLA)，這一類的抗原會被自然殺手細胞分泌的CD3、CD16 或 CD68 所溶解，因此傳統移植器官的排斥現象並不存在(Sawicki et al, 2001)，因此半異基因型的胚胎逃過免疫系統的排斥是藉著唯一與母體子宮蛻膜和血液接觸的滋養層細胞(cytotrophoblast)形成無法辨識的非典型人類白血球抗原 HLA-G (non classical human leukocyte

antigent -G) (Kovats et al., 1990, Loke and King, 2000)而降低自然殺手細胞分泌的 CD8 毒殺，滋養層細胞並分泌 indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), 這是參與色氨酸(tryptophan)代謝的酵素，可以分解色氨酸並且抑制T-細胞的活性(Tatsumi et al.,

(19)

2000)，幫助胚胎逃過免疫系統的排斥，在胚胎侵入子宮內膜上皮細胞(endometrial epithelial cell)時，滋養層細胞會分泌 Fas ligand 誘發 T-細胞經由 Fas 路徑(Fas pathway)凋亡(apoptosis) (Kayisli et al, 2003)使胚胎順利進入蛻膜化的子宮內膜

(decidualized endometrium; deciduas)，完成著床。

貳、影響著床附著與粘黏的因子

胚胎與子宮內膜藉著分子生物訊息的分泌與傳遞進行著床作用，許多因子在這個過程中表現以幫助著床。在大鼠 (Psychoyos, 1973)和人類(Martel et al., 1987; Psychoyos and Martel, 1990)的研究發現，接觸與附著的過程與子宮內膜上皮細胞上伴隨著內噬作用(endocytosis)及巨噬作用(pinocytosis)的吸液足(pinopodes)結構有關，此結構的表現受到黃體素的調控，

功能尚不十分清楚。Psychoyos 及 Nikas (1994) 認為吸液足可以幫助囊胚附著於子宮腔上皮細胞，當吸液足形成時，表示子宮已經呈現接受囊胚的狀態(Martel et al., 1991)。此外，在附著的過程中MUC-1, trophinin/tastin 及 integrin 等與細胞粘黏 (adhesion)有關的分子直接參與胚胎與子宮粘黏的作用。

高度醣化(glycosylation) 的 MUC-1 蛋白 MUC-1，在人類和小鼠著床期的子宮上皮細胞皆有表現，其功能與啟動胚胎和

(20)

子宮的接觸有關(Surveyor et al., 1995; Hey et al., 1994)；

trophinin/tastin 只在著床時期的子宮表現，trophinin/tastin 影響囊胚和子宮腔接觸的位置(Fukuda et al., 1995)；此外，integrin 家族的蛋白也與著床有密切之關係，integrins 屬於穿膜醣蛋白 (transmembrane glycoproteins)，至少有十四種 integrin 的次單位被發現存在於人類的子宮內膜(Reddy and Meherjy, 1999)，有五種integrin 醣蛋白(α2β1, αvβ3, α4β1, α6,β4,)在著床時期的子宮內膜上皮細胞表現，人類胚胎滋養層細胞分泌的fibronectin、

vitronetic 會分別與 intergin α4β1、αvβ3,接合，參與囊胚與子宮內膜的接觸作用，(Lessey et al., 1996; Bowen and Hunt, 2000)。

雖然對囊胚接觸子宮內膜的著床過程的調節機轉仍未完全明瞭，但有相當多的證據顯示胚胎藉著分子生物訊息的分泌與傳遞與母體之子宮內膜進行交互作用，最近的研究指出子宮內膜和胚胎的作用，胚胎就像一顆包在糖漿的網球一樣，在子宮內膜滾動，而胚胎本身表面分泌L-選擇素(L-selectin)蛋白，

與子宮內膜的醣蛋白作用，而產生類似強力黏著劑的作用，使胚胎著床(Genbacev et al., 2003 )。

參、影響囊胚穿入子宮內膜的因子

(21)

細胞動力素(cytokine) 介白質藉由自體內分泌(autocrine) 與旁體內分泌(paracrine)之作用直接參與胚胎著床的調節與進行。子宮內膜表現的細胞動力素有介白質1 至 4 (IL-1~4)、介白質6 (IL6)、介白質 7 (IL7)、介白質 10 (IL10)，而在這當中又以介白質-1 及及介白質-6 系統為主，介白質-1 直接參與細胞的增生與分化。介白質-1 包含三個主要成份：介白質-1 類似體 (IL-1 isoforms α and β)、介白質-1 接受器擷抗劑(IL-1 receptor antagonist)和介白質-1 接受器。

介白質-1 類似體藉由與介白質-1 接受器之結合，產生訊息傳導(Dinarello, 1988)。無論是胚胎或子宮內膜所分泌的介白質-1，對於子宮內膜之介白質-1 系統具有自體分泌之調節機轉。第一型介白質-1 接受體(interleukin-1 receptor type I,

IL-1RI)，與介白質-1 結合為胚胎與子宮內膜接觸(attachment)所必須的因子(Simon, 1999)，介白質-1 及介白質-6 會刺激胚胎產生integrin α1 及α2 ( Das et al., 2002)，介白質-1α於著床階段在子宮內膜的基質細胞大量表現並與胚胎所產生的瘦體激素 (leptin)共同活化第九型金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase 9;

MMP9)及 integrin 介白質-1，幫助囊胚穿入(invasion)子宮內膜之基底膜 (Huang et al., 1998; Simon et al., 1998; Gonzalez et al.,

(22)

2001)，胚胎滋養層細胞分泌第九型金屬蛋白酶水解細胞外基質 (extracellular matrix, ECM)中的膠原蛋白(collagen)幫助胚胎滋養層細胞侵入子宮蛻膜。

根據體外的試驗得知，滋養層細胞粘著於 laminin 上成扁平狀並保持固著，與 fibronectin 結合時細胞變長且有假足 (Shigemoto, 1999)，胚胎滋養層細胞上的 integrin 與細胞外基質

上的fibronectin 及 laminin 結合，則得到一個牽引的力量，這種粘附作用與胚胎後續移入子宮內膜對成功的著床是相當重要的，當胚胎滋養層細胞對子宮內膜過度入侵時，第三型金屬蛋白酶抑制劑(TIMP3, tissue inhibitor of metalloproteinase 3)就會抑制金屬蛋白酶的活性，避免胚胎過度入侵(Lecoet al., 1996;

Huang et al., 1998)，藉著子宮內膜之 MMP/TIMP 系統及 integrin 家族與其接受體的交互作用，使滋養層細胞順利穿透基底膜成功著床。

肆、影響胎盤血管新生的因子

胚胎著床之目的是為了到達母體得到子宮之血液循環的氧氣及養分以繼續生長，胚胎著床也同時伴隨著血管的生成作用(angiogenesis)，當胚胎剛附著於子宮內膜時，子宮基質微血管通透性增加，血管的形成必須水溶性的介質(soluble

(23)

mediator)，黏性受質(adhesive substract)及內皮細胞表面受體 (endothelial cell surface receptor)共同進行胎盤的血管新生 (neoangiogenesis)。首先由血管內皮細胞生長因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF)家族及纖維母細胞生長因子 (fibroblast growth factor, FGF) 活化平滑肌細胞及微血管的外皮細胞，接著驅動微血管內皮的integrin 和細胞外基質協同作用 (Moller et al., 2001; Smyth and Patterson, 2002)，在體內的試驗中以 αvβ3、 αvβ5、 α1β1或 α2β1的的抗體中和這些integrin 的作用會抑制血管內皮細胞生長因子所誘導的血管生成(Kim et al., 1993)。integrin αvβ3與金屬蛋白酶結合並活化血管生成而金屬蛋白酶分解細胞外基質幫助胚胎侵入子宮內膜(Bischof, 2001)，因此胚胎著床時的影響因子都是環環相扣，形成一個網狀的系統，胚胎著床必須依賴以上子宮及胚胎影響著床因子精確的的交互作用才能順利完成。

第四節囊胚期胚胎型態之評估

在人類試管嬰兒(in vitro fertilization)的療程中，長期以來在胚胎生長至第三天時植入胚胎(embryo transfer)，人類胚胎在體外培養至第三天時為八細胞期之胚胎，通常可以生長到此時期的胚胎總數目較繼續培養至第五天囊胚期的胚胎多，但是為了提高懷

(24)

孕的機率會植入較多的胚胎於子宮腔，若植入之胚胎多數著床成功則形成多胞胎(multiple pregnancy)(Garel et al., 1997; Elster 2000)，而多胞胎懷孕的結果會造成高危險妊娠，例如胎兒神經系統缺陷比例提高、胎兒體重過、低懷孕的過程也亦誘發子癲前症 (Pre-eclampsia) 、孕期糖尿病 (gestational diabetes) 、高血壓 (hypertension)、早產等(Skupski et al., 1996)。

由於人類胚胎體外培養方法的進步，將培養胚胎之培養液改為兩階段式的培養或共同培養大幅提高囊胚形成的比率(Gardner et al., 1998; Marek et al., 1999)。品質不好的胚胎通常無法生長到囊胚期，因此可以增加胚胎的選擇性，胚胎品質提高後就僅需要植入一至二個胚胎，大大的降低多胞胎的機率，此外，囊胚期胚胎植入子宮時，胚胎與子宮處於同期化(synchronization)也可以提高胚胎著床的機會(Schoolcraft et al., 1999)。由於採用囊胚期胚胎植入著床率較高(Schoolcraft et al., 2000; Shapiro et al., 2002)，所以選擇最佳品質的囊胚作為胚胎植入是必須的，因此適當的囊胚期胚胎分級相當重要。

Gardner 及 Schoolcraft 於 1999 年提出較完整囊胚期胚胎分級的報導，他們依據囊胚腔的大小將囊胚分為 6 至 1 的等級，等級 1 表示為早期囊胚(early blastocyst)，囊胚腔小於胚胎一半的體

(25)

積，等級2 表示為中期囊胚(blastocyst)，囊胚腔開始大於胚胎一半的體積，等級 3 表示為完全囊胚(full blastocyst)，囊胚腔幾乎完全佔據胚胎的體積，等級4 表示為膨脹囊胚(expanded blastocyst)，囊胚腔大於前面 3 級胚胎且透明帶變薄，等級 5 表示孵化的囊胚且只有一部份外胚滋養層細胞露出囊胚，等級 6 表示完全孵化的囊胚，透明帶完全脫離胚胎。囊胚內細胞團的部分則分為A, B, C 三級，A 級表示細胞數目多且緻密，B 級表示細胞數目少且鬆散，C 級表示細胞數目極少，外胚滋養層細胞亦分為A, B, C 三級，A 級表示多數細胞形成凝聚性的上皮細胞，B 級表示由少數細胞形成鬆散的上皮細胞，C 級表示細胞數少且為體積較大的細胞。使用這種人類囊胚分級方法篩選胚胎，再植入母體，可以得到 86.7%(59/68) 的懷孕率及 69.9(95/136) 的著床率 (Gardner et al., 2000)。

陸續有研究者提出人類囊胚分類的方法，有學者提出直接測量內細胞團的大小及形狀來提高著床率(Kevin et al., 2001), Jeffrey 等人(2001)則分別在胚胎受精後 16 至 18 小時、25 至 27 小時及 64 至67 小時依分裂的三個時期胚胎品質評分再相加而得到評估囊胚品質的總分以為囊胚分級的方法。

而在小鼠囊胚體外培養及著床的研究上Lane(1997)以含有不

(26)

同的胺基酸成分的培養液培養小鼠胚胎，觀察小鼠胚胎由單一細胞生長至囊胚的發育率及胚胎孵化比例，並且測量囊胚的細胞數目，以評估不同成分的胺基酸培養液培養胚胎後對著床率及第十五天胚胎的重量的影響，結果發現囊胚的細胞數目及囊胚內細胞團的數目和胚胎移入子宮後的存活率有關，但是囊胚的形成和孵化則不適於用來評估胚胎未來的發育潛能。然而此篇作者並未將事先將欲移入子宮的胚胎型態做進一步分析，因此統計出的結果仍須再做確認，雖然已有Gardner 及 Schoolcraft 已提出人類體外培養的囊胚在植入母體前根據囊胚腔的的擴張程度、內細胞團滋養外胚層的型態分級的可行性，但是形成囊胚的細胞數目以及著床的能力則必須進一步釐清，小鼠著床前期的胚胎在型態和人類的類似(Hardy et al, 1993)，應用小鼠的著床模式來做評估應可作為日後生殖醫學臨床的參考，此外亦則尚未有學者對囊胚之分級或著床提出相關之研究，在基因轉殖動物研究蓬勃發展之際，提供重要的動物實驗參考值也是相當重要的。

第五節血癌抑制因子之生化特性及生理功能 壹、血癌抑制因子之生化特性

血癌抑制因子最早是由Tomida 等人(1984)由小鼠 L929 纖維母細胞所純化出來的一種醣蛋白(glycoprotein)，因為具有抑制

(27)

小鼠骨髓白血病细胞系的骨髓瘤M1 細胞(myeloid leukemic cell line M1)增殖的能力，並誘導小鼠骨髓瘤細胞 M1 分化成巨噬細胞，因此被命名為血癌抑制因子，人類的血癌抑制因子基因位於第22 對染色體 q14 的位置，血癌抑制因子屬於介白質-6 蛋白家族的成員之一，分子量為20kD，未成熟的蛋白型態含有 202 個胺基酸，成熟的蛋白型態由180 個胺基酸組成(Gearing et al., 1987) ，具有 6 個潛在的天門冬醯胺醣化位置 (N-glycosylation sites)，3 個雙硫鍵，3 個 exon，主要型態的 mRNA 的長度為 4kb，

次要型態為1.8kb。

血癌抑制因子的結晶體(crystal structure)結構於 1994 年被鑑定出來(Robinson et al, 1994)，主要為 4 個α螺旋(α helix)分別

由2 個長環及一個短環所串聯。螺旋狀的細胞動力素被分類為短鏈(short chain)及長鏈(long chain)兩種，血癌抑制因子、介白質-2、介白質-4 及顆粒球巨噬群落刺激因皆形成單體型式 (monomeric form)同屬短鏈細胞動力素(Boulay and Paul, 1992;

Bazan, 1992)。血癌抑制因子具活性的接受體為血癌抑制因子接受器β及 gp130 所組成的複合體(Gearing et al., 1992; Ip et al., 1992; Taga and Kishimoto, 1992)，另有四種細胞動力素的接受器除了本身特異的接受器之外也與血癌抑制因子共用gp130 接受

(28)

器，這四種動力素分別是抑瘤素-M (oncostatin M, OSM; Malik et al., 1989)、介白質-6、(Van Snick et al., 1988)、睫狀神經營養因數(ciliary neurotrophic factor, CNTF; Stockli et al., 1989)及介白質 -11(Paul et al., 1990; Kawashima et al., 1991 )。

血癌抑制因子訊息傳遞的路徑是透過與受體gp130 結合後使得原本與gp130 結合的 Jak 激酶(Janus Kinase)被磷酸化，

已經磷酸化的Jak 接著刺激溶於細胞質 gp130 尾端的酪氨酸 (tyrosine)磷酸化，磷酸化的 gp130 再使細胞質中的轉錄作用的訊息傳遞子及活化子(Signal transducer and activator of

transcription, STAT)的 SH2 domain 磷酸化，STAT 接著形成雙體進入細胞核調節下游的基因(Gerhartz, 1996; Heinrich, 1998)，也有學者提出當磷酸酪氨酸激酶與磷酸化的gp130 結合後可能會經由MAPK 路徑(mitogen- activated protein kinase

pathway)( Stahl et al.,1995)傳遞訊息。

貳、血癌抑制因子之生理功能

血癌抑制因子是一種多功能的細胞動力素，在生物發育及維持正常生理功能中扮演重要的角色，血癌抑制因子能抑制白血病细胞的增殖，而且對多種细胞的增殖、分化、存活以及胚胎發育都具有重要的作用(Heinrich et al., 1998; Auernhammer

(29)

and Melmed 2000)，對於于神經系統的發育及修復，也是不可缺少的因子(Murphy et al., 1993; Auernhammer et al., 1998; Gadient et al., 1998)。此外，血癌抑制因子可以抑制胚胎幹細胞的分化。

因此，在胚胎幹細胞的培養過程中，必需添加血癌抑制因來抑制幹細胞的分化(Niwa, 2001; Burdon et al., 2002)。

目前已知血癌抑制因子廣泛的存在各種細胞中，在心臟、

肝臟、子宮內膜、中樞神經系統、腎臟、肺臟、胸腺等器官及組織也都偵測得到血癌抑制因子。血癌抑制因子和許多生理系統上的增殖、分化、細胞存活有關(Metcalf, 1992; Hilton, 1992)。

參、血癌抑制因子在生殖系統之重要性

人類及多種哺乳類動物的輸卵管及子宮內膜上皮中皆會分泌血癌抑制因子(Shen and Leder, 1992; Yang et al., 1994;

Cullinan et al., 1996; Vogiagis et al., 1996)，人類血癌抑制因

子會受到月經週期的調節，隨著月經週期而在子宮內膜細胞中有週期性增減的表現，此外，在受到基因突變導致缺乏血癌抑制因子的老鼠，著床無法發生(Stewart et al., 1992)。

肆、血癌抑制因子對囊胚發育的影響

在1991 年 Robertson 等人的研究報告中發現血癌抑制因子可以加強小鼠囊胚及孵化的形成(Robertson et al.,1991)，類似

(30)

的結果在牛的胚胎也被發現(Funston et al., 1997)，而在 Fry 等人對羊的研究中則發現血癌抑制因子可以增加胚胎的著床率(Fry et al., 1992)，但是血癌抑制因子對人類胚胎體外培養的研究還相當少，Dunglison 等人(1996)將血癌抑制因子 (1,000 IU/mL) 加入由接受試管嬰兒治療夫婦捐贈的胚胎中培養，發現囊胚期胚胎的形成率從 18%增加至 44% (P<0.05)，而發育評分較好的 囊胚也從10%提高至 33% (P<0.05)。

Jurisicova 等人(1995)將 463 個臨床治療後剩餘的胚胎分成五組，這些分裂早期的胚胎，除了164 個胚胎為控制組外，

其餘四組的數目分別為54、78、87、80；而於培養液中加入不同濃度的血癌抑制因子分別為：5、7.5、10、20 ng/mL，每天觀察每一個胚胎的胎發育狀態及型態，直到囊胚期。就總體而言，

人類胚胎在體外發育至孵化囊胚的數量相少。控制組培養至第五天時只有28%發育至早期的囊胚，到了第六、七天時有 19.5%

發育至囊胚後期；而添加血癌抑制因子5、7.5、10、20ng/mL 於培養各組，並沒有明顯促進胚胎發育成早期或後期囊胚的效果。只有在7.5 及 10ng/mL 有稍微促進後期囊胚形成的比例，

其數值分別為38%及 36%，但是這些差異並無統計上的意義。

根據以上節錄Dunglison 及 Jurisicova 等人對血癌抑制因子影響

(31)

囊胚形成不一致的研究結果還需要未來更深入的研究。

第六節反意寡核苷酸抑制基因表現之原理及應用

DNA 以模板股 (template)轉錄出來的 RNA 為 sense RNA，與模板股互補的那一股 DNA 稱為非模板股(non- template)，而根據 non- template 股所轉錄出來的 RNA 即為反意 RNA (antisense RNA)。使用反意寡核苷酸之目的在於抑制某特定基因產物之完成，其應用之原理為利用表現出標的基因之反意股約數十個寡核苷酸與標的基因之 RNA 序列互補而結合，如此標的基因便無法順利進行轉譯作用合成蛋白質(Green et al., 1986)。

壹、反意寡核苷酸抑制基因表現的機制

一、反意寡核苷酸直接擷抗於mRNA 的密碼區(coding region) 使得合成蛋白質的延長過程被阻斷，此外，反意寡核苷酸直接與mRNA 上任一區域結合會引起 mRNA 構形的改變而干擾蛋白質的轉譯(Oppenheim et al., 1991)。

二、反意寡核苷酸抑制蛋白質轉錄的起始作用(initiation)，藉由與mRNA 促進區(promoter region)或起始區(initiator region)附近的序列結合，使得核糖體的複合體(ribosomal complex)無法順利與 mRNA 結合，造成轉譯的起始作用受抑制(Kitajima et al., 1992)。

(32)

三、當轉譯作用於細胞質進行時，表示RNA 在細胞核經由剪接(splicing)的過程成為具生物活性的型態，此時反意寡核苷酸可以直接作用於pre-mRNA 透過抑制 polyadenylation 或阻斷穿透(transport)至細胞質的過程而達到抑制基因表現的效果。反意寡核苷酸直接與剪接連結(Splice junctions) 結合會干擾mRNA 的成熟，而造成基因表現受阻(Kulka, 1989)，

四、未與反意寡核苷酸結合的mRNA 會被 RNase H 分解 (Cerritelli, 1998)而無法表現。

貳、設計反意寡核苷酸抑制標的基因的原則

在體外試驗中，30 個核苷酸足以用於南方或北方墨點法 (Southern or Northern blotting)的探針，反意寡核苷酸可以抑制基因最小的長度為12 個核苷酸，一般建議於細胞中最適當的反意寡核苷酸長度為14 至 25 個鹼基(Herschlag, 1991; Manche

1992)，根據以上的原理，設計反意寡核苷酸抑制標的基因的原則為：

一、若希望其抑制轉譯的起始過程可以選擇剪接後mRNA 5’cap 端至接近轉譯起始密碼(AUG)之間的核苷酸或選擇可以抑制 nuclear processing 的過程的序列。

(33)

二、確定該序列不會自體互補。

三、此反意寡核苷酸的鳥嘌呤(guanine)的比例不可以超過 36%，或連續出現 3 個以上的鳥嘌呤否則其水溶性會降低。

此外，反意寡核苷酸的碳骨架須經適當的修飾，若其骨架未經修飾直接進入體內，則半衰期可能只有五分鐘，為了避免反意寡核苷酸被水解，發展出由甲基取代氧離子的反意寡核苷酸(Tidd and Warenius, 1989)，這種甲基化的核苷酸在小鼠細胞質半衰期約6分鐘，或者以硫離子取代氧離子形成硫代磷酸酯，硫代磷酸酯修飾過的核苷酸骨架骨架在細胞質的半衰期依設計的結構不同大約為50分鐘至40小時(Schlingensiepen and et al., 1997)，硫代磷酸酯核苷酸與RNA的二級結構結合時親和力較低，此外，還有以其他各種取代的基團用於修飾反意核苷酸但是仍有專一性、穩定性及細胞毒性等因素造成研究結果不理想 (Summerton and Weller, 1997)。

基於早期所設計修飾過的反意核苷酸不論在核苷酸專一性、效率以及細胞毒性上都不能完全符合實驗的需求，美國的 Gene tools 生技公司研發出一種稱為 morpholino 的反意核苷酸，

其化學式為將五碳醣插入氮離子改成六環結構，而連結碳骨架

(34)

的磷酸根其中一個氧離子也置換成氮離子(Summerton and Weller, 1997)，這種結構具核切酶(nucleases)抵抗性可穩定存留於細胞內較長的時間、可避免產生出具毒性的裂解物質、作用效率高、可避免 RNase H 對與目標 RNA 相似的非目標 RNA 產生裂解作用、序列專一性為硫代磷酸酯核苷酸的100 倍，即使在高濃度狀況下使用也不會降低其專一性，對目標RNA 結合能力強，可侵入目標 RNA 的二級結構，達到與 RNA 穩定結合的目的，並且在細胞質及細胞核內皆有活性(Summerton and Weller, 1997)。

理論上，反意寡核苷酸可被發展和應用在中止任何基因物合成，實際上反意寡核苷酸分子已被用於治療各型的骨髓瘤 (myeloma，Barille-Nion, 2003)、血管損傷(Janssens, 2003)和肺癌、淋巴癌等多種癌症(Stahel et al., 2003; Kim et al., 2004)，同時也是製藥界和臨床發展基因療法的一個方向(Biroccio et al., 2003)。

根據Paria 等人(1992)的研究，利用 c-myc 的反意寡核苷酸抑制胚胎發育，建立了減低早期胚胎基因表現的研究模式，

近年來陸續有學者應用反意寡核苷酸做為研究著床前期胚胎發育的工具來研究諸多基因在早期發育所扮演的角色，例如 E 鈣

(35)

粘附素 (E-cadherin, Ao and Erickson,1992)、鈉、鉀三磷酸腺苷酸( Na⁺, K⁺-ATPase, Jones et al.,1997)及第二型去氧核糖核酸拓樸異構酵素(DNA topoisomerase II, St Pierre et al., 1997)等，利用反意寡核苷酸抑制基因的表現可以解釋某些基因在著床前期胚胎表現調控的機轉。

(36)

第二章研究動機

胚胎能否順利著床取決於著床前期胚胎和子宮內膜的發育狀況，影響著床前期胚胎發育至囊胚的因子中，血癌抑制因子是著床及成功懷孕所必須的因子，但是血癌抑制因子在著床前期胚胎發育至囊胚所扮演的角色並不十分清楚，是否應補充於體外培養的環境中也仍有爭議，本研究的目的為探討血癌抑制因子對著床前期胚胎生長發育及著床的影響。首先建立小鼠胚胎體外培養及囊胚植入的模式了解胚胎型態與著床之關聯性，進一步藉由此模式以血癌抑制因子反意寡核苷酸直接抑制血癌抑制因子血癌抑制因子在胚胎內的表現，以確定血癌抑制因子影響著床前期胚胎的生長發育及著床所扮演的角色。

(37)

第三章材料與方法 第一節實驗材料 第二節實驗方法

(38)

第一節、實驗材料 壹、實驗動物

囊胚型態與著床率相關性所使用的小鼠品系皆為購自國科會動物中心的ICR 小鼠，包括 4 至 8 週齡之供胚母鼠(embryo donor)、8 至 12 週齡之受胚母鼠(recipient)及 8 至 20 週齡之輸精管切除之公鼠(vasectomy male mice)。血癌抑制因子對著床前期胚胎發育的影響所使用的供胚小鼠品系亦購自國科會動物中心包括 C57BL/6J 母鼠及 CBA 公鼠。C57BL/6J 母鼠及 CBA 公鼠用於自行繁殖第一子代小鼠(B6CBF1)，B6CBF1 母鼠飼養至4 至 8 週齡作為供胚母鼠(embryo donor)、B6CBF1 公鼠飼養至 8 至 12 週齡則用於與母鼠交配，此外仍以 ICR 母鼠作為受胚母鼠，8 至 20 週齡之 ICR 公鼠作為輸精管切除之雄鼠，各品系小鼠皆飼養於李茂盛婦產科診所之動物室。

貳、藥品試劑

一、下列產品購自中國化學製藥廠

動物用血清哥娜注射劑(Sergona Inj.) 動物用哥娜 500 注射劑(Gona-500 Inj.) 二、下列產品購自美國Sigma 化學公司

(39)

液體礦物油(mineral oil; M8410)、氯化鈉(NaCl;

S9888)、氯化鉀(KCl ; P5405)、磷酸二氫鉀 KH2PO4

(P5655)、硫酸鎂(MgSO4^˙7H2O; M2643)、乳酸鈉(Na Lactate 60 % syrup; L4263)、丙銅酸鈉(Na pyruvate;

P5280)、葡萄糖(glucose; G7021)、碳酸氫鈉(NaHCO3;

S4019)、水合氯化鈣(CaCl2^˙2H2O; C7902)、玻尿酸酶

(hyaluronidase, H3735)、戊巴比妥鈉 (sodium pentobarbital;

P3761)、蛋白水解酵素(proteinase; P8811)、 M16 培養液 (M16 medium; M7292)、M2 培養液(M2 medium; M7167)、

三硝基苯磺酸 (trinitrobenzenesulphonic acid, TNBS;

P2297) 、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone, PVP;

P5288 )、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA;

B2518)、天竺鼠血清補體(guinea pig complement serum;

S1639)、甘油(glycerol, G9012)、碘化丙啶(propidium iodide, p4170)、Triton X- 100 (t-octylphenoxypolyethoxyethanol;

T9284)、Tween 20(polyoxyethylenesorbitan monolaurate;

P-7949)、bis-benzimide (hoechst 33258, B2883)、芝加哥天空藍Chicago Sky Blue 6B (C8679)

三、以下藥品購自美國Invitrogen 公司

(40)

青黴素- 鏈黴素 (penecillin-G streptomycin, Gibco 15140-122) 、磷酸緩衝液 (Dulbecco’s Phosphate-buffered saline, PBS, Gibco 11500-030)、胎牛血清(Fetal bovin serum, Gibco 10270-106)、乙二胺四醋酸鹽(Ethylene Diaminetetra Acetic Acid Disodium Salt Dihydrate EDTA, Gibco 60-00-4)、小鼠血癌抑制因子重組蛋白( recombinant mouse leukemia inhibitory factor, L5158)、3,3-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride Tablet (DAB; D5905)

四、以下藥品購自德國默克公司酚紅(Phenol red; 7241.0025)

五、以下藥品購自日本國產化學株式會社絕對酒精(Ethanol; 2140063)

六、以下藥品購自日本和光純藥株式會社甲醇(methanol; Wako 137-01823)

七、以下藥品購自美國INC 生物醫學公司

兔子抗二硝基酚抗體(rabbit anti-dinitrophenol; DNP, 61006) 八、以下藥品購自聯工化學廠股份有限公司

福馬林(formaldehyde solution ; 88725) 九、以下藥品購自澳大利亞Chemicon 公司

(41)

血癌抑制因子抗體(anti recombinant murine LIF, 16121102-05)

十、以下藥品購自美國Vector 公司 VECTABSTAIN ABC kit (PK-6101) 十一、以下藥品購自美國Gene Tool 公司

fluoresceinated standard control morpholino antisense oligo (31Oct00A)、fluoresceinated LIF morpholino antisense oligo (41-17-Jan01A-K-F)

參、儀器設備

一、電動電子顯示天平(Mettler Toledo, MT AB 104; Switzerland) 二、解剖顯徽鏡 (Nikon, SMZ-2B, Japan)

三、螢光顯微鏡(Nikon, LABOPHO-2, Japan)

四、二氧化碳培養箱(Heraeus Instrument, Cytoperm 2, Germany) 五、相位差顯微鏡( Nikon, Diphot 300, Japan)

六、無菌操作台(造鑫公司, CVM-420T, R.O.C.) 七、微電腦控制拉針器(Sutter Instrument Co., P-87

Flaming/Brown Micropipette Puller, U.S.A.) 八、顯微鍛燒器(Nikon, Microforge, Japan )

九、顯微操做手臂(Narishige, Micromanipulator, Japan)

(42)

肆、其他實驗器材

35mm 培養皿、90mm 培養皿、4 孔培養皿、96 孔培養皿、酒精燈、手術針、線、鑷子、外科剪刀、30G 注射針、眼科鑷子、止血鉗、l ml 之針筒、27G 針頭、眼科夾、載玻片、

蓋玻片、拋棄式培養液過濾器、玻璃毛細管、玻璃微管.(Borosilicate Glass, 外徑 1.0mm，內徑 0.75mm, Sutter Instrument Co.)、含細絲之玻璃微管(Borosilicate Glass with filament, 外徑 1.0mm，內徑 0.78mm, Sutter Instrument Co.)。

第二節、實驗方法 壹、實驗動物之飼養

實驗小鼠飼養於李茂盛婦產科診所之動物室，新購入之小鼠需適應環境二週後才開始實驗，動物室的光照週期條件為 12 小時光照(清晨六點至傍晚六點)，12 小時之黑暗週期(傍晚六點至清晨六點), 飼養溫度維持在攝氏 20-24℃之間，於飼養期間給予充分的水及飼料，使用飼料為美國Diet Test 齧齒類動物飼料，主要成分為粗蛋白 23 %、粗脂肪 4.5%、粗纖維 6.0%、灰份 8.0%、礦物質 2.5%，其餘部分(56%)為碳水化合物。小鼠之飲用水為逆滲透膜過濾過之飲水，本動物實驗已

(43)

經動物實驗管理小組(Institutional Aminal Care and Use Committee, IACUC)核准。

貳、誘發小鼠之超級排卵與配種(Nagy et al., 2003 a)

為取得大量著床前鼠胚進行著床試驗，母鼠必須在配種前施打外源性性腺激素，本實驗以中國化學製藥廠製造的動物用血清哥娜性腺激素(gonadotropin)，仿造 FSH (follicle-stimulating hormone)之功能，刺激卵巢濾泡的成熟，並配合中國化學製藥廠製造的動物用哥娜，即人類絨毛膜性腺激素，仿造黃體促素 (luteinizing hormone, LH)之功能，幫助排卵，以便於配種後獲得較多數量之受精卵。為正確掌握排卵時間，人類絨毛膜性腺激素必須於內源性之黃體促素釋出前注射。通常性腺激素與人類絨毛膜激性腺素注射時間相隔42 至 48 小時。配種後隔天早上，

若在母鼠陰道內發現由公鼠精液之膠質所形成之陰道栓(vaginal plug)，即可判定母鼠已與公鼠交配成功。本實驗於母鼠腹腔內注射血清性腺激素5 IU，46 小時後再以腹腔注射方式注射人纇絨毛膜性腺激素 5 IU，人類絨毛膜激性腺素注射完後隨即將母鼠置入公鼠籠內，準備進行交配。交配後隔天觀察有無陰道栓(圖一 A)的形成，有則表示公鼠與母鼠完成交配。

參、小鼠胚胎之收集及培養(Nagy et al., 2003 b)

(44)

收集小鼠胚胎之前須配製人類輸卵管液培養基 (Quinn 1995)，此培養基的成分為：NaCl 101.6 mM, KCl 4.69 mM, KH2PO4 0.37 mM, MgSO4^˙7H2O 0.2 mM, Na Lactate 60 % syrup 21.4 mM, Na pyruvate 0.33 mM, Glucose 2.78 mM, NaHCO3 2.78 mM, CaCl2^˙2H2O 2.04 mM, penecillin-G streptomycin 2000 IU/l, phenol red 1% ，取胚前一天，將人類輸卵管液培養基以 20μl 為一滴，滴於35-mm 培養皿中，再覆蓋礦物油於培養基上，置於37℃，5％二氧化碳培養箱中過夜，以調整酸鹼值，待用。

將懷孕母鼠以頸椎脫臼法犧牲，即一手置於母鼠之頸部處固定，另一手抓住尾巴往後拉，使頸椎脫臼。接著解剖母鼠取出其輸卵管，先用酒精噴灑於母鼠之腹部，以外科剪刀在腹部剪一小洞，用手將其皮膚向外拉扯，直至露出腹部肌膜，剪開腹膜，將生殖道拉出剪下輸卵管，放入人類輸卵管液培養基液滴中，將接裝有人類輸卵管液培養基注射針筒之磨鈍的 30G 注射針刺入繖部的洞口以眼科鑷子夾緊注射針與繖部，緩緩將人類輸卵管液培養基注射入輸卵管中收集單一細胞期胚胎，在解剖顯微鏡下以吸管收集鼠胚後，放入回溫之玻尿酸酶內數分鐘以去除卵丘細胞(cumulus cells)。等卵丘細胞開始脫落擴散時，

即可以玻璃毛細管吸吐受精卵數次，以去除包被於鼠胚外之卵

(45)

丘細胞，再以人類輸卵管液培養基清洗受精卵後，將胚胎放入事先準備好已調整酸鹼值及溫度並覆蓋礦物油之人類輸卵管液培養液中，置入培養箱內培養，每天觀察、記錄胚胎生長狀況。

肆、小鼠囊胚之分級

本實驗採體外培養的方式得到不同型態的囊胚，由於小鼠胚胎較小且內細胞團級滋養外胚層細胞不易再做區分，所以只以囊胚腔的大小作分級，小鼠囊胚期胚胎依囊胚腔的大小及是否孵化分成三組：第一組囊胚腔小於或等於胚胎一半的體積，

第二組囊胚腔大於胚胎一半的體積，第三組為剛開始孵化的囊胚(圖二) 。

伍、囊胚直徑之測量

為了評估胚胎分級後實際的大小，我們將胚胎直接至於相位差顯微鏡下，以 200 倍的倍數觀察包含透明帶的囊胚直徑，

利用事先置於接目鏡內的尺測量，呈圓形的胚胎測量任選的兩段互相垂直的直徑，若胚胎呈橢圓形則測量最長及最短的直徑，每個胚胎分別測量兩次並紀錄後接著進行核差別染色。

陸、囊胚期胚胎之核差別染色(differential stain)

為了進一步評估我們對胚胎分級後，每一組囊胚的細胞總數目、內細胞團細胞數目及滋養外胚層細胞數目我們採用胚胎

(46)

免疫手術(immunosurgery)之原理對囊胚進行核的染色(Piekos et al., 1995)，以 96 孔培養皿操作，先以 pH 2.5 的 Acid Tyrods’溶液將囊胚的透明帶去除，將胚胎培養於含有10 mM

trinitrobenzenesulphonic acid, 4 mg/ml polyvinylpyrrolidone 及 0.015%的 Triton X-100 的 M16 培養液中，置於冰上 10 分鐘後以M2 培養液洗滌三次以上，接著將胚胎培養於含有 0.1 mg/ml anti-dinitrophenol (DNP)-bovine serum albumin 的 M2 培養液中，於37℃作用 15 分鐘後以 M2 培養液洗滌三次以上，將胚胎培養於以M2 培養液十倍稀釋的天竺鼠血清補體(guinea pig complement serum)中，並添加 10 µg/ml 的紅色螢光試劑

propidium iodide，於 37℃作用 15 分鐘後以磷酸緩衝液洗滌三次以上，然後將胚胎置於含有22 µg/ml 的藍色螢光試劑

bisbenzimide 的絕對酒精中，存放於 4℃，經隔夜作用後，將胚胎固定在載玻片上，以甘油使脫水的胚胎漲大，再以蓋玻片覆蓋在胚胎上輕壓一下後，以螢光顯微鏡調整至UV-2A 及 G-2A 兩種濾鏡觀察。滋養外胚層細胞會呈現紅色的螢光，而內細胞團會呈現藍色的螢光，分別記錄胚胎的細胞數目。

柒、公鼠輸精管結紮(Nagy et al., 2003 c)

由於進行胚移置(embryo transfer)前受胚母鼠需處於假懷

(47)

孕(pseudopregnancy)狀態，使子宮環境處於適合胚發育之階段，

故需以經輸精管結紮之公鼠與母鼠交配，挑選八週齡以上配種能力強之公鼠進行輸精管結紮，公鼠於術後兩週即可用於配種。

本實驗採用之麻醉劑為戊巴比妥鹽，注射小鼠的劑量為 100mg/kg，使用前秤 10 mg 直接溶於 1 ml 之生理食鹽水中備用，此種麻醉劑注射小鼠依體重每10 克以 0.1 ml 注射公鼠。注射時以手指抓緊小鼠背頸部皮膚以固定之，以l ml 之針筒、27G 針頭吸取藥劑，於下腹一側鼠蹊部將針頭穿刺入腹腔中，避免針頭刺到膀胱等臟器，緩緩將藥劑注入腹腔內，並於針頭抽出前停留一會以避免藥劑隨針頭抽出而流出體外。

公鼠結紮乃以手術方式進行，手術前應以濕熱方式將手術器械滅菌(autoclave)，將公鼠秤重並依體重注射麻醉劑至腹腔中，接著將公鼠平置於手術墊布、腹部朝上，以75％酒精消毒腹部，以剪刀於腹部皮層及肌肉層切開一個約1.5 公分之傷口，接著於腹腔壁附近尋找連接睪丸及輸精管之脂肪塊(fat pad)，並以鑷子小心將其拖出體外，以眼科夾固定部分輸精管後，以酒精燈燒紅之鑷子夾斷並移除一小斷輸精管，將結紮完成之輸精管連同睪丸及脂肪塊小心置回腹腔中，再以相同之步驟處理另一側之輸精管。完成結紮後，以手術針、線分別將肌

(48)

肉層及皮層逢合，將術後公鼠移置籠中待其恢復後再移回勳物房，手術後兩週之輸精管結紮公鼠即可開始用於配種。

捌、懷孕母鼠之準備與胚移置(Nagy et al., 2003 d)

受胚母鼠必須具備母性良好且窩仔數高之特質，一般選擇混種品系(out bred)，本實驗採用目前使用最廣泛之 ICR，其母性較佳、窩仔數多且同籠之母鼠可共同哺育仔鼠。

植入囊胚的前3 天，將母鼠作陰道抹片檢查(圖三)，選擇抹片結果為動情期的發情母鼠與輸精管結紮之公鼠交配，隔天選取具有陰道栓(圖一 B)的母鼠，將這些母鼠分籠飼養以作為假懷孕之受胚母鼠。進行胚胎移置手術時，受胚母鼠秤重後以戊巴比妥鈉進行全身麻醉，置於90-mm 培養皿中央，並於背部以 75％酒精清潔及消毒體表，以解剖剪刀於背中線距尾部約 2 至 3 公分處之皮層切一小於 l 公分之橫向開口，滑動開口至一側卵巢上方，由體璧外可見附著於卵巢上之脂肪，將此處之體璧剪一小開口，以較鈍之鑷子拖出脂肪使卵巢、輸卵管及一小段子宮角露出後，以止血鉗夾住脂肪以固定位置，將受胚鼠移至立體顯徽鏡下，以眼科鑷將子宮角固定後、於距離子宮輸卵管交接處約5 mm 處以 26 G 之鈍針避開血管，刺一小洞，確定針頭進子宮角內後將其抽出。

(49)

事先將囊胚移至含 5% 胎牛血清的人類輸卵管培養液中，以內徑約200 µm 之玻璃吸管吸取少量培養液，製作兩三段氣泡，吸取 5 至 7 個囊胚。將玻璃吸管插入子官角之小洞中，

吹動吸管至囊胚後方之氣泡到達吸管尖端為止，勿將氣泡吹入，等待數秒再將吸管抽出，將生殖道置回體內，並以相同方式進行另側之移置。縫合體壁及皮層開口塗抹碘酒且置回鼠籠。評估注入血癌抑制因子反意寡核苷酸之胚胎發育至囊胚的著床能力時，為了排除受胚母鼠個體差異造成的著床結果干擾，同一隻受胚母鼠的雙邊子宮，一邊植入無意義序列注入胚胎的控制組囊胚，另一邊的子宮則植入注入血癌抑制因子反意寡核苷酸注入後而形成的囊胚。囊胚植入兩天後以將母鼠麻醉，以1%芝加哥天空藍由母鼠尾部靜脈注射約 0.2 ml，再將母鼠腹腔的皮毛及肌肉剪開，若胚胎有著床則可以看到一小團藍色胚胎著床後的囊(sac)(圖四)，計算著床於子宮腔的胚胎數目。

玖、顯微注射法

一、反意寡核苷酸之製備

本實驗所設計之血癌抑制因子基因的反意寡核苷酸是直接委託Gene tool (U.S.A.)公司製造標定 FITC 的抑制血癌抑制因子反意寡核苷酸，以該公司軟體設計阻礙RNA

(50)

表現最高的一段序列為模板，抑制血癌抑制因子反意寡核苷酸的序列為: GACCTTCATTATGGGCTGGACTCTA (156~180)，另外也購入一段無意義的序列注入對照組鼠胚 (nonsense Control): ATCAGGATTGGTGG CATC

TTCCCAG 以排除注射時血癌抑制因子反意寡核苷酸以外的影響因素，又此二序列皆經BLAST 基因庫的比對(附錄一、二)，前者只專一性的抑制小鼠的血癌抑制因子基因，

後者在小鼠則無擷抗的基因。

二、顯微微管之製備(Nagy et al, 2003a )

本實驗所使用之顯微微管包括固定吸管(holding pipette)及顯微注射微管(microinjection pipette)，一般而言，固定吸管之外徑大小乃依操作胚之細胞質直徑而定，

內徑之尺寸除依操做胚之大小調整外，與控制操作目標物吸放之正負壓調節設備有關，原則上調節正負壓設備之體積愈大者，其配合之固定吸管之內徑愈小。固定吸管的製作方法如下，調整微電腦控制拉針器的設定值為以下條件：速度指數(velocity index, Vel)為60，拉力指數(pull index, Pull)為95，熱度指數(heat index, Heat)為980, 時間指數 (Time index, Time)為60，將玻璃微管兩端固定啟動拉力按

(51)

鈕將玻璃微管分拉成兩支，再使用顯微鍛燒器電烙絲前端之熱玻璃球修整，先將外徑70~100µm處切平，並小心的將切口處燒成圓滑狀，使內徑在10~l5µm間，接著將玻璃微管前端約2mm的長度至熱玻璃球下方，將電烙絲緩慢加熱使玻璃微管受熱後，彎成約35度角，分別以95%酒精及無菌之逆滲透水潤洗數次，予以滅菌鍋滅菌，烘乾後待顯微注射時固定胚胎用。注射用微管則需採用含細絲之玻璃微管為材料，調整微電腦控制拉針器的設定值為以下條件：速度指數為75，拉力指數為110，熱度指數為975, 時間指數(Time index, Time)為150，將玻璃微管兩端固定啟動拉力按鈕將玻璃微管分拉成兩支，接著將玻璃微管前端約2mm的長度至熱玻璃球下方，將電烙絲緩慢加熱使玻璃微管受熱後，彎成約35度角，分別以95%酒精及無菌之逆滲透水潤洗數次，予以高溫高壓溼熱滅菌，烘乾後待顯微注射用。

三、顯微注射

血癌抑制因子之反意寡核苷酸以生理食鹽水配置成 0.5mM、0.25mM……等濃度，無意義的反意寡核苷酸序列配成0.5mM的濃度，以毛細管拉製成的口吸管吸取1ul

(52)

的反意寡核苷酸由顯微注射微管開口端注入微管內，經由玻璃微管細絲之毛細現象，會將反意寡核苷酸溶液吸至針尖，將固定吸管及顯微注射微管分別架設於顯微操作手臂兩側之固定管上，並分別調整好固定吸管及顯微注射微管的角度使其與顯微操作板呈水平狀態。在顯微操作培養皿中滴入已平衡過酸鹼值的人類輸卵管培養液，然後以礦物油覆蓋，於解剖顯微鏡下操作，將20個原核清晰的期鼠胚置於油滴下的培養液中，移至顯微操作板上，並調整固定吸管及顯微注射微管之高度。

將封閉狀態的顯微注射微管尖端，輕輕碰觸固定用微管尖端方式，注射微管管內的正壓將使反意寡核苷酸溶液流出，調整溶液的流速後，先固定吸管之位置，調整微注射針尖，使其與原核膜之焦距相同，將注射微管刺入雄原核內並維持持續正壓使反意寡核苷酸溶液注入原核中。待原核明顯漲大後(圖五) 注入的體積約1pl，將汪射針迅速抽出。釋放固定吸管上已完成注射之胚，並以相同方式進行其餘胚之注射，以注射的濃度與體積換算注入血癌抑制因子反意寡核苷酸的量為 4 fmol、2 fmol、1 fmol、

0.5 fmol及0.25 fmol，注入無意義的反意寡核苷酸的量為

(53)

4.0 fmol及2.0 fmol，注射後將各組鼠胚放回二氧化碳培養箱培養，並每日定時觀察。

拾、細胞免疫染色

為確定注入血癌抑制因子反意寡核苷酸的抑制基因血癌抑制因子表現的效果，我們將注入不同濃度血癌抑制因子反意寡核苷酸後，各個發育期的鼠胚以血癌抑制因子細胞免疫染色的方法確認血癌抑制因子是否有表現。首先將胚胎以Acidic Tyrod’s 溶液溶解外層之透明帶，再以磷酸緩衝液洗滌三遍後將胚胎置於載玻片上，以2%的福馬林固定 15 分鐘，以磷酸緩衝液洗滌三遍後，接著以0.2%的 Triton X-100 於室溫下處理 5 分鐘，以磷酸緩衝液洗滌五遍，與1%雙氧水作用 10 分鐘，以磷酸緩衝液洗滌三遍，以含有10%胎牛血清的磷酸緩衝液於室溫下處理1 小時，接著以 1mg/ml 的血癌抑制因子抗體於 4℃培養隔夜，以TBST 溶液(Tris-HCl 50 mM, Tween 20 0.025%, pH 7.8) 清洗，以含有10%胎牛血清的磷酸緩衝液於室溫下處理 10 分鐘，再以1mg/ml 二級抗體(goat anti-rabbit IgG)作用 1 小時，以 TBST 溶液清洗 5 遍，每遍 2 分鐘，以 Avidin- biotinylated horseradish peroxidas 處理 45 分鐘，再以 TBST 溶液清洗 5 次，

每次5 分鐘，然後以 DAB 溶液(0.05% DBA, 3%雙氧水溶於

(54)

0.05M，pH 7.4 的 Tris 中)處理 20 分鐘，再以 0.05M，pH 7.4 的 Tris 緩衝液洗滌兩次，分別以 70%、80%及 90% 的酒精處理 5 分鐘漸進脫水，然後以甘油處理，在相位差顯微鏡下觀察呈色情形。

拾壹、添加血癌抑制因子蛋白觀察胚胎發育情形

為了觀察添加血癌抑制因子蛋白於注入血癌抑制因子反意寡核苷酸胚胎發育情形，我們將2.0 fmol血癌抑制因子反意寡核苷酸注入雙原核期的鼠胚後，立刻移置已添加5 ng/ml、10 ng/ml及50 ng/ml的培養液中，將各組鼠胚放回二氧化碳培養箱培養，並每日定時觀察。

拾貳、統計方法

本研究在探討囊胚型態之胚胎著床率之統計以卡方檢定 (chi-test) 為統計方法，p 值小於 0.05 時定義為有顯著差異，在胚胎直徑及核差別染色後得到的數值以平均值±平均值的標準誤(mean±SEM, standard error of the mean)表示，並先以單一變異數分析(one way ANOVA) 再以 Student’s t-test 為統計方法，p 值小於 0.05 時定義為有顯著差異。在探討血癌抑制因子對胚胎發育影響的部分，胚胎發育率之統計以卡方檢定(chi-test)為統計方法，在胚胎直徑及核差別染色後得到的數值以平均值±標準偏差

(55)

(mean±SD, standar deviation)表示，並以 Student’s t-test 為統計方法，胚胎著床率先以Kruskal-Wallis test 再以 Mann-Whitneu U test 統計，p 值小於 0.05 時定義為有顯著差異。

(56)

第四章結果

第一節以小鼠囊胚型態分級評估其著床率

第二節血癌抑制因子之反意寡核苷酸對著床前期鼠胚發育及著床 的影響

(57)

第一節以小鼠囊胚型態分級評估其著床率 壹、小鼠胚胎發育之結果

本實驗一共累計採用了32 隻 ICR 品系的供胚母鼠，得到單一細胞期胚胎650 個，繼續培養數小時後，589 個胚胎形成雙原核，也就是指精卵受精的比率為90.6%，培養 3.5 天後行成 524 個囊胚，囊胚型成率為89.0%，這些囊胚經過分級後：第一組囊胚腔小於或等於胚胎一半的體積的囊胚數目佔所有囊胚細胞的 40.5% (212/524)，第二組囊胚腔大於胚胎一半的體積的囊胚數目佔所有囊胚細胞的 38.5% (202/524)，第三組為剛開始孵化的囊胚佔所有囊胚的20.1% (110/524)。

貳、囊胚期胚胎直徑之測量及核差別染色

囊胚形成並完成分級後，一部分之囊胚用於測量直徑及核差別染色，直徑的大小在第一級、第二級級第三級胚胎分別為 89.3±1.2µm、110.7±1.5µm 及 115.8±1.6µm。先以單一變異數分

析三組之間具有顯著差異後，再以Student’s t-test 統計，第一級 與第二級、第三級胚胎囊胚的直徑比較，皆具有顯著差異，第二級與第三級之間亦具有統計差異(p<0.01)。核差別染色的結果以螢光顯微鏡觀察，滋養外胚層細胞會呈現紅色的螢光，而內細胞團會呈現藍色的螢光(圖六)。每一組分別染了 35 個囊胚，

血癌抑制因子對著床前期小鼠胚胎發育之研究 Studies of the leukemia inhibitory factor on

中山醫學大學生物化學研究所博士論文

Ph.D. Thesis, Institute of Biochemistry, Chung Shan Medical University