血癌抑制因子之反意寡核苷酸對著床前期鼠胚發育

第一節 以小鼠囊胚型態分級評估其著床率 壹、小鼠胚胎發育之結果

本實驗一共累計採用了32 隻 ICR 品系的供胚母鼠，得到 單一細胞期胚胎650 個，繼續培養數小時後，589 個胚胎形成雙 原核，也就是指精卵受精的比率為90.6%，培養 3.5 天後行成 524 個囊胚，囊胚型成率為89.0%，這些囊胚經過分級後：第一組囊 胚腔小於或等於胚胎一半的體積的囊胚數目佔所有囊胚細胞的 40.5% (212/524)，第二組囊胚腔大於胚胎一半的體積的囊胚數目 佔所有囊胚細胞的 38.5% (202/524)，第三組為剛開始孵化的囊 胚佔所有囊胚的20.1% (110/524)。

貳、囊胚期胚胎直徑之測量及核差別染色

囊胚形成並完成分級後，一部分之囊胚用於測量直徑及核 差別染色，直徑的大小在第一級、第二級級第三級胚胎分別為 89.3±1.2µm、110.7±1.5µm 及 115.8±1.6µm。先以單一變異數分

析三組之間具有顯著差異後，再以Student’s t-test 統計，第一級 與第二級、第三級胚胎囊胚的直徑比較，皆具有顯著差異，第 二級與第三級之間亦具有統計差異(p<0.01)。核差別染色的結果 以螢光顯微鏡觀察，滋養外胚層細胞會呈現紅色的螢光，而內 細胞團會呈現藍色的螢光(圖六)。每一組分別染了 35 個囊胚，

第 一 組 囊 胚 細 胞 數 目 為 15.3±0.6，滋養外胚層細胞數目為 24.0±0.8，囊胚總細胞數為 39.3±1.3。第二組囊胚，內細胞團數

目為26.7±0.5，滋養外胚層細胞數目為 59.2±1.0，囊胚總細胞數 為。第三組囊胚，內細胞團數目為32.2±1.0，滋養外胚層細胞數 目為45.2±1.7，囊胚總細胞數為 77.4±2.6，第一級、第二級與第 三級囊胚的內細胞團與滋養外胚層細胞的比值分別為 64.1±

1.9、82.3± 1.4 及 73.0± 2.1。(表一)，以單一變異數分析三組之

間具有顯著差異後再以t-test 檢定這三組胚胎細胞數目的差異，

第一級與第二級、第三級胚胎囊胚的內細胞團、滋養外胚層細 胞的數目及內細胞團與滋養外胚層細胞的比值，第一級與第二 級、第三級囊胚之間具有統計差異，第二級與第三級之間亦具 有顯著差異 (p<0.05)。發現第二組囊胚外觀較第一組大實際染 出來的細胞數目不論在內細胞團或外胚層細胞的細胞數目上也 真的比第一組多，但是這些數值並無統計之意義。第三組囊胚 的大小較不一致，不過內細胞團或外胚層細胞的細胞數目細胞 的數目也都多於第一組和第二組，且內細胞團的細胞數目與第 一組比較具有顯著差異(p<0.01)。

參、胚胎著床率之統計

這些經過分級之後的囊胚移置到與輸精管切除之公鼠交 配成功的假孕母鼠子宮腔內。兩天後計算受胚母鼠子宮腔著床 的胚胎數，第一級囊胚腔小於或等於胚胎一半的體積的胚胎，

一共成功植入60 個囊胚，著床率為 56.7(34/60)，第二級較大的 囊胚一共成功植入60 個囊胚，著床率為 73.3% (44/60)，而第三 組剛開始孵化的囊胚共植入66 個胚胎，著床率為 80.3 (53/66)。

以卡方檢定分析這些數值，第二組和第三組的胚胎著床率明顯 高出第一組胚胎且具有統計之差異(表二)。

肆、評估囊胚孵化潛力

由前面的結果得知，欲得到最高的著床率應該置入已孵化 的囊胚，因此繼續培養第一級及第二級囊胚至孵化，再培養一 天後至第六天，第一級及第二級囊胚孵化比例分別是 43.3%

(13/34)及 65.6%(21/32)。培養二天後至第七天，第一級及第二級 囊胚孵化比例分別是63.3% (19/34)及 68.8%(22/32)(表三)。由這 個結果得知，較大的囊胚在繼續培養的第一天就孵化達 65.6%，

第二天則只有一個胚胎繼續孵化，比起第一級較小的囊胚有較 高且快速的孵化能力。雖然第一級的囊胚在第二天也達到63.3%

的囊胚孵化率，但是這一類的胚胎顯然有延遲發育的現象。

第二節 血癌抑制因子之反意寡核苷酸對著床前期鼠胚發育及著床的 影響

壹、血癌抑制因子反意寡核苷酸對鼠胚生長速率之影響

本研究分別注入0.25 fmole、0.5 fmole、1.0 fmole 或 2.0 fmole 及 4.0 fmole 的血癌抑制因子反意寡核苷酸於鼠胚中，並 逐日紀錄胚胎發育情形，由於實驗前胚胎皆已在相位差顯微鏡 下篩選過為雙原核期胚胎，因此各組胚胎達到雙原核期的比例 是100%，本研究結果採累積方式，將各次做的結果加總，統計 于表四，並以卡方檢定來統計各組的生長速率與對照組間是否 有差異。

未做任何處理的空白對照組、注射溶液對照組、注射2 fmol 及4 fmol 無意義序列之對照組，累計的鼠胚總數為 151、171 及 146、83，達到二細胞期的比率分別為 90.7%、91.8%、92.5%及 90.4，分別注入 0.25 fmole、0.5 fmole、1.0 fmole、2.0 fmole 及 4.0 fmole 血癌抑制因子反意寡核苷酸的各組胚胎達到二細胞期 的比率分別為93.1%、90.3%，90.3%，92.1%及 96.4%，除了一 小部分的胚胎停滯雙原核時期，大部分的二細胞期胚胎內的兩 個細胞大小相同，於此時期胚胎的型態及外觀上與控制組比較 並未出現異常，且生長速率與未做任何處理的空白對照組比較

並無差異。

當胚胎繼續發育至四細胞期時，空白對照組、注射溶液對 照組與注射2 fmol 及 4 fmol 無意義序列之對照組，達到四細胞 期的比率分別為88.7%、88.3%及 87.7%及 85.5，分別注入 0.25 fmole、0.5 fmole、1.0 fmole 及 2.0 fmole 血癌抑制因子反意寡核 苷酸的各組胚胎達到四細胞期的比率分別為85.5%、88.2%、

82.1%、83.9%及 70.4%，注入血癌抑制因子反意寡核苷酸的各 組胚胎達到四細胞期的能力隨著注入濃度增高而降低，注入 4.0 fmole 血癌抑制因子反意寡核苷酸已完全停滯於二細胞期不再 發育了，血癌抑制因子反意寡核苷酸在四細胞期已開始對胚胎 造成傷害，一部份的胚胎停滯于二細胞期，注入2.0 fmole 血癌 抑制因子反意寡核苷酸的四細胞期鼠胚小部分出現胚胎內細胞 大小不一的現象。

當胚胎生長至收集胚胎後第四天時，大部分胚胎進入桑椹 胚時期，空白對照組、注射溶液對照組與注射2 fmol 及 4 fmol 無意義序列之對照組，達到桑椹胚期的比率分別為87.4%、86.6%

及84.9%，注入溶液的控制組與無意義序列的胚胎發育至桑椹胚 為止皆與控制組鼠胚的生長數率及型態上沒有差異，但是在此 時期空白控制組已有約30%生長較快之胚胎已出現囊胚。分別

注入0.25 fmole、0.5 fmole、1.0 fmole 及 2.0 fmole 各組生長至桑 椹胚期的速率分別為 84%、76.6%、72.3%及 63.8%；當注射血 癌抑制因子反意寡核苷酸濃度高於0.25fmole 時小鼠胚胎在桑甚 胚時有意義的降低。2.0 fmole 的高濃度組未達桑甚胚期的胚胎 除了有縐縮的情形也有一部份胚胎內出現碎片。

當胚胎生長至收集胚胎後第五天時，大部分胚胎進入囊胚 時期，空白對照組、注射溶液對照組與注射2 fmol 及 4 fmol 無 意義序列之對照組，達到囊胚期的比率分別為85.4%、79.5%及 79.5%及 78.3%，注入溶液的控制組與無意義序列的胚胎發育至 分桑椹胚為止皆與控制組鼠胚的生長數率及型態上沒有差異，

但是在此時期空白控制組已有約之50%生長較快之胚胎出現孵 化囊胚了。分別注入0.25 fmole、0.5 fmole、1.0 fmole 及 2.0 fmole 各組生長至囊胚期的速率分別為80.6%，63.5%，39.4%及

13.2% ，當注射血癌抑制因子反意寡核苷酸濃度高於 0.25 fmole 時胚胎的囊胚生成率與控制組比較有顯著差異，而注射濃度高 於0.25 fmole 血癌抑制因子反意寡核苷酸後，各組胚胎由桑椹胚 發育至囊胚的比例有意義的降低。注射2.0 fmole 血癌抑制因子 反意寡核苷酸的高濃度組未達桑椹胚期的胚胎除了有縐縮的情 形也有一部份胚胎內出現碎片，而此組實驗所形成的囊胚較

小，且胚胎內出現較多的空泡及碎片。第三天至第五天胚胎生 長發育的型態見圖七。

貳、血癌抑制因子反意寡核苷酸注入之效果

根據螢光顯微鏡觀察本實驗所設計的反意寡核苷酸可以 進入鼠胚中，且會由細胞核逐漸擴散至整個細胞，取一部份顯 微注射後的胚胎每日於螢光顯微鏡下觀察並拍照，以螢光是否 存在，確定注入之反意寡核苷酸，可以維持到囊胚期而不衰退(圖 八)。

為了進一步確定血癌抑制因子蛋白質是否仍存在於胚胎 中，我們以細胞免疫染色的方法的檢視，對照組的胚胎每一個 胚胎生長階段都可以偵測到血癌抑制因子蛋白質的表現，而注 入血癌抑制因子反意寡核苷酸的胚胎在血癌抑制因子免疫染色 後，二細胞期即顯現出血癌抑制因子蛋白質表現量有降低的趨 勢，在四細胞期、桑甚胚期及囊胚期同樣也顯現出血癌抑制因 子蛋白質表現量降低(圖九)，這個結果表示本篇所設計以反意寡 核苷酸抑制鼠胚中血癌抑制因子基因的表現，確實可達到抑制 的效果。

參、注射血癌抑制因子反意寡核苷酸後囊胚型態之改變

我們以測量囊胚期胚胎的直徑及核差別染色後(圖十)計算 出細胞數目作為注射血癌抑制因子反意寡核苷酸後胚胎發育型 態的評估，在2.0 fmol 血癌抑制因子反意寡核苷酸注入後囊胚直 徑的平均大小為 99.5±5.8µm，明顯小於未處理的空白對照組且 在統計上具有顯著差異，2.0 fmol 血癌抑制因子反意寡核苷酸注 入後囊胚的總細胞數、內細胞團及滋養外胚層細胞數目、內細 胞團及滋養外胚層細胞數目的比值皆顯著的小於未處理的空白 對照組(P<0.01)。而以 1.0 fmol 血癌抑制因子反意寡核苷酸注射 的胚胎發育成的囊胚除了內細胞團及滋養外胚層細胞數目的比 值與未處理的空白對照組比較無顯著差異外，其餘型態評估值 包括胚胎半徑、總細胞數、內細胞團及滋養外胚層細胞數目都 有意義的低於未處理的空白對照組(表五)

肆、血癌抑制因子反意寡核苷酸對鼠胚著床率之影響

為了評估注入血癌抑制因子反意寡核苷酸之胚胎生長至 囊胚期之胚胎的著床功能，本實驗設計直接將囊胚移置到假懷

為了評估注入血癌抑制因子反意寡核苷酸之胚胎生長至 囊胚期之胚胎的著床功能，本實驗設計直接將囊胚移置到假懷