含金屬超氧化物歧化酶的相關文獻探討

超 氧 化 物歧 化 酶 (superoxide dismutase, SOD) 的 存 在 最早 是 由 Fridovich 和 McCord 等人於 1969 年發現，其為生物體自身抵抗氧化 的機制，並廣泛地存在於各種動物、植物、微生物中，避免細胞受到 自由基攻擊而造成的突變或損害。O2−為生物體中進行呼吸作用所產 生的副產物，具有高度的活性，當濃度過高時會攻擊 DNA，蛋白質 和細胞膜脂質造成傷害。SOD 可以使 O2−進行歧化反應，轉換為 O2

及 H2O2，藉此調控 O2−在生物體內的濃度，且與其他酵素相比，SOD 具有最快的超氧化物轉換效率( 約 7 × 10⁹ M⁻¹s⁻¹ ，pH = 7 時，O2−轉 換為 O2及 H2O2的反應速度為~105 M⁻¹s⁻¹)¹。SOD 催化超氧化物的歧 化反應可分為兩個步驟：

氧化反應：M⁽ⁿ⁺¹⁾-SOD + O2−

→ Mⁿ⁺-SOD + O2

還原反應：Mⁿ⁺-SOD + O2−

+ 2H⁺ → M⁽ⁿ⁺¹⁾-SOD + H2O2

其中 M 可以是 Cu (n = 1)；Mn (n = 2)；Fe (n = 2)；Ni (n = 2)，亦即超 氧化物歧化酶可以是銅

/

一、銅/鋅超氧化物歧化酶，

Cu/ZnSOD

1939 年 Mann 與 Keilin 從牛的紅血球及肝細胞中分離出含有鋅及 銅的蛋白質，但不被認為具有酵素的功能，因此這種蛋白質被當做只 具有儲存金屬的功用。直至 1969 年 McCord 與 Fridovich 發現此種含 銅鋅的蛋白質具有清除超氧自由基的功能，因此將它命名為超氧歧化 酶，隨後陸續在各種生物體內發現有銅鋅型超氧歧化酶的存在。

Fig. 1-1 Cu/ZnSOD 的蛋白質結構與活性中心^2,3

大多數從真核細胞內分離出的 Cu/ZnSOD 酵素呈淡藍色，分子量 約為 32 kDa，具有兩個相同次單體(subunit)，每個次單體都有一個活 性 中 心 ， 含 有 一 個 銅 離 子 與 鋅 離 子 。 由 X- 光 單 晶 繞 射 解 析 此 Cu/ZnSOD 蛋白質分子結構，可發現銅離子在活性中心是由四個 His 上的氮配位，其中有一個 His 與鋅離子做橋梁連結，另外還有兩個 His 及一個 Asp 與鋅離子鍵結。

銅離子在此酵素中扮演氧化和還原 O2−的角色，而鋅離子的主要

功能是穩定酵素的結構。Cu/ZnSOD 進行 O2−歧化反應的反應機構如 Scheme 1-1 所示。

Scheme 1-1 Cu/Zn-SOD

進行氧化還原的反應機構

若是將銅離子替換成其他金屬離子，酵素會失去活性，但若是將 鋅離子替換成 Co²⁺、Hg²⁺或 Cd²⁺，則酵素仍具有部分活性 ⁴。

二、含錳或鐵超氧化物歧化酶，Mn or FeSOD

MnSOD 最早由 Keele 等人在 1970 年由大腸桿菌中分離出來，顏 色為淡紅色，此酵素主要存在於原核細胞與真核細胞的粒腺體中，是 粒線體中主要的抗氧化酵素，負責轉化粒線體中的超氧離子。

Fig. 1-2 MnSOD 的蛋白質結構與活性中心⁵

MnSOD 的每個單體分子量約 19~24 kDa，每個單元體中含有一個 錳離子。錳離子與三個 His 及一個 Asp 鍵結，並與兩個 His、一個 Trp 及一個 Tyr 組合成活性中心。MnSOD 進行氧化還原的反應機構如 Scheme 1-2 所示。

Scheme 1-2 MnSOD 進行氧化還原的反應機構⁶

FeSOD 第一是被分離出來也是從大腸桿菌中，分布於原核細胞基質 (cell matrix)、藻類中，在動物組織中極少發現 FeSOD 的存在。

Fig. 1-3 Fe-SOD 的蛋白質結構與活性中心^{7, 8}

FeSOD 胺基酸序列上與 MnSOD 相似，顏色為淡黃色，每個單位 體分子量約 18.5~22 kDa，鐵離子與三個 His 及一個 Asp 鍵結。FeSOD 進行氧化還原的反應機構如 Scheme 1-3 所示。

Scheme 1-3 FeSOD 進行氧化還原的反應機構

三、含鎳超氧化物歧化酶

NiSOD 是在 1996 年由 Youn 等人於鏈黴菌(Streptomyces)及藍綠 藻(cyanobacteria)中發現，由 X-光單晶繞射解析後得知其為四個蛋白 質單體構成，分子量約 53.7 kDa。

Fig. 1-4 NiSOD 的蛋白質結構與活性中心⁹

還原態 NiSOD 活性中心的配位環境如 Scheme 1-4 左側所示，在 鎳離子中心赤道面的平行四邊形上，配位著 His 上末端胺的氮及骨架 上醯胺的氮以順式位向(cis arrangement)佔據平面四邊形的兩個角，與 兩個亦為順式位向配位於平面四邊形另外兩個角的 Cys 硫醇上的 硫，形成 Ni^IIN2S2平面四邊形的結構。在氧化態 NiSOD 的活性中心，

除了原本平面四角形的結構，軸位上 His 咪唑的氮會配位到鎳離子中 心，形成 Ni^IIIN3S2平面四角錐的結構如 Scheme 1-4 右側所示。

Scheme 1-4 NiSOD 進行氧化還原的反應機構

目前文獻上推測 NiSOD 的反應機制之一如 Scheme 1-5 所示，當 O2−進入還原態 NiSOD 與鎳離子鍵結後，藉由活性中心周圍的 Tyr9、

Cys2 與 Cys6 上的氫鍵穩定 O2−，接著進行還原反應，將 O2−還原成 H2O2 釋出，同時正二價的鎳中心氧化成三價鎳離子，因金屬中心缺 電子的關係，His1 上咪唑的氮配位置鎳離子中心。接著氧化態 NiSOD 的三價鎳離子中心繼續與 O2−反應，同樣藉由 Tyr9、Cys2 與 Cys6 上 的氫鍵穩定鍵結在鎳離子上的 O2−，接著進行氧化反應使 O2−氧化成

O2釋出，同時配位在軸位的 His1 離開鎳離子中心，鎳離子還原為二 價平面四邊形的構形，完成了 NiSOD 催化 O2−為 H2O2及 O2的循環。

Scheme 1-5 NiSOD 於文獻上推測的反應機構¹⁰

經由理論計算來解釋 NiSOD 活性中心的反應性，還原態 NiSOD 活性中心之氮及硫原子的 p 軌域與鎳離子的 d 軌域進行 π interacction 的 鍵 結 ， 使 得 π* 軌 域 填 入 成 對 電 子 ， 藉 由 氮 及 硫 原 子 之 π interacction，造成 π*軌域能量較高而不穩定。因此當 O2−進入時，π*

軌域的電子會轉移至 O2−，配合 2 個質子，使 O2−還原成 H2O2，鎳離

子中心則氧化成正三價，形成氧化態 NiSOD。在氧化態 NiSOD 的情 況下，則是當軸位 His 的氮配位後，以其 p 軌域與鎳離子中心的 d 軌 域進行σ interaction 鍵結，使 1 個未成對電子填入 σ*軌域。當 O2−進 入後會提供一個電子還原三價的鎳離子中心，且軸位的 His 則會離開 鎳離子中心，而成為還原態 NiSOD，而 O2−氧化成 O2。

Fig. 1.5 Ni-SOD 於理論計算的氧化態與還原態鍵結軌域¹¹