5 NiSOD 於文獻上推測的反應機構

經由理論計算來解釋 NiSOD 活性中心的反應性，還原態 NiSOD 活性中心之氮及硫原子的 p 軌域與鎳離子的 d 軌域進行 π interacction 的 鍵 結 ， 使 得 π* 軌 域 填 入 成 對 電 子 ， 藉 由 氮 及 硫 原 子 之 π interacction，造成 π*軌域能量較高而不穩定。因此當 O2−進入時，π*

軌域的電子會轉移至 O2−，配合 2 個質子，使 O2−還原成 H2O2，鎳離

子中心則氧化成正三價，形成氧化態 NiSOD。在氧化態 NiSOD 的情 況下，則是當軸位 His 的氮配位後，以其 p 軌域與鎳離子中心的 d 軌 域進行σ interaction 鍵結，使 1 個未成對電子填入 σ*軌域。當 O2−進 入後會提供一個電子還原三價的鎳離子中心，且軸位的 His 則會離開 鎳離子中心，而成為還原態 NiSOD，而 O2−氧化成 O2。

Fig. 1.5 Ni-SOD 於理論計算的氧化態與還原態鍵結軌域¹¹

第三節 含鎳超氧化物歧化酶擬態化合物的相關文獻探討

由目前文獻發表的蛋白質結構可知，還原態 NiSOD 的鎳離子中 心較為穩定且傾向以平面四邊形的構型存在，在合成擬態化合物上相 對比較穩定，因此在過去的文獻上大多著重於還原態 NiSOD 擬態化 合物的探討，而氧化態 NiSOD 的探討相對較少。接著分別就過去的 文獻，針對結構性還原態 NiSOD 擬態化合物、功能性還原態 NiSOD 擬態化合物以及結構性氧化態 NiSOD 擬態化合物作介紹：

一、結構性還原態 NiSOD 擬態化合物

關於還原態 NiSOD 的擬態化合物，大多是以 N2S2的配位基，與二價 鎳配位形成平面四邊形的錯合物，來做為還原態 NiSOD 的結構模擬 及光譜性質的探討。

Fig. 1-6 結構性還原態 Ni-SOD 擬態化合物之一^{12, 13}

由 Krüger及 Holm 等 人 於 西 元 1987年 ¹² 及 1998年 ¹³ 發 表 [Ni(phmi)]^2- 及[Ni(ema)]^2-、[Ni(phma)]^2- 與[Ni(emi)]^2- (Fig.1-6 )的文獻 中可知，將N2S2配位基與鎳二價金屬離子鍵結，其中兩amidate的N 配位分別模擬還原態 Ni-SOD活性中心之His1 上末端amine的N及 backbone上amide的N；兩S則分別模擬兩個Cys2與Cys6 上thiolate 之S，形成平面四方的構形，結構上與還原態Ni-SOD活性中心之結 構皆具有一定程度的相似度，且因這類型配位基的硫與氮上的氫有機 會被去質子化使配位基為負三、四價，有機會迫使鎳金屬中心氧化，

形成高價氧化態的錯合物。

Fig. 1-7 結構性還原態

Ni-SOD 擬態化合物之二

2010年由Shearer 設計兩個二價鎳結構性還原態 NiSOD 擬態錯合 物(Fig.1-7)¹⁴，並藉由光譜及理論計算的研究，進行與酵素活性中心 間的比較及探討。其配位方式與還原態 NiSOD 相當相似，僅一個 amidate與amine的差別，較能符合NiSOD於氧氣下穩定存在之性質。

Fig. 1-8 結構性還原態 Ni-SOD 擬態化合物左至右分別

為 Tp

NiS

CNPh

、Tp

NiS

CNEt

與 Tp

NiS

COEt

在 2008 年 由 Jensen 利 用 hydrotris(3-phenyl-5-methylpyrazoyl)- boratonickel(II)分別與 organoxanthate 及 dithiocarbamate 配位形成含氮 硫五牙基的二價鎳錯合物(Fig.1-8)¹⁵，並從氧化還原電位探討還原態 Ni-SOD氧化成氧化態Ni-SOD時可能經歷之中間態 ¹⁸。但在此階段仍 未能得到Ni^IIIN3S2的結構性氧化態Ni-SOD擬態化合物。

Harrop 在 2011 年發表的擬態化合物(Fig. 1-9)¹⁶，同樣是以 N2S2

為基本架構，再修飾配位基成 N3S2，將其與鎳離子配位形成一 N2S2

平面四邊形構形的錯合物。此錯合物在結構及電性上都與 NiSOD 活 性中心相似，然而當加入氧化劑 FcPF6後，卻得到 N3S 配位至二價鎳 而另一個硫原子與另一分子的硫形成 disufide 而形成雙核錯合物。雖 然反應過程中，可以利用 EPR 在 4 K 環境下，短暫偵測到同時具有 Ni^III及 radial 的混合訊號，但未能直接分離出五配位之三價鎳的氧化 態擬態化合物。

Fig. 1-9 結構性還原態 Ni-SOD 擬態化合物之四¹⁶

二、結構性氧化態 NiSOD 擬態化合物

有部分研究發現，若使用如 salen-type 或前述 N2S2的配位基，因 具有高負電性，在與二價鎳離子配位後，若使用氧化劑將其氧化，將 會使配位基上的一個電子被移除形成 ligand radial。但若額外添加吡 啶或咪唑等分子，有機會使得鎳金屬中心由二價氧化成三價，可用 EPR 光譜佐證此現象。

Fig. 1-10 由 EPR 光譜測定結構性氧化態 Ni-SOD 擬態化合物之一¹⁷

如Krüger及Holm於1987年及1998年所發表的一系列二價鎳錯 合物[Ni(phmi)]^2-及[Ni(ema)]^2-、[Ni(phma)]^2-與[Ni(emi)]^2-，於溶液中 加入pyridine後進行Electron paramagnetic resonance (EPR) 的測量，

得到自旋量子數為1/2的Ni^III訊號，並且因為 pyridine 的氮原子與鎳 中心未成對電子偶合(coupling)的關係，使其具有 triplet 的超精細結構 (super-hyperfine coupling) (Fig.1-10)¹⁷。顯示此Ni^III可做為結構性氧化 態NiSOD擬態化合物，因其配位方式與氧化態NiSOD 皆為Ni^IIIN3S2。

Fig. 1-11 由 EPR 光譜測定結構性氧化態 Ni-SOD 擬態化合物之二¹⁸

2010 年由 Duboc 所合成的二價鎳錯合物(Fig. 1-11)¹⁸，也可以得到 相似的結果，其中兩個氮是由配位基上 bipyridine 提供，當含錯合物 的溶液加入咪唑後，經由電化學方式將其氧化，從 EPR 光譜上即可 偵測 Ni^III之訊號。並藉由 CV 光譜說明其 NiSOD 擬態化合物在外加 適當電壓下，其氧化態與還原態可進行可逆的轉換。

三、還原態 NiSOD 之活性擬態化合物

由於 NiSOD 被發現的時間較晚，對此酵素進行擬態化合物相關 研究亦較少，且多以結構模擬為主。Darensbourg 及 Laurence 所發表 的研究結果是目前少數可消耗超氧化物，並展現活性的結果。Shearer 則是將酵素蛋白質片段進行修飾，探討胜肽鏈所形成的化合物的活性 與酵素間做比較。

Fig. 1-12 功能性還原態 Ni-SOD 擬態化合物之一¹⁹

由 Darensbourg 在 2009 年發表的正二價鎳錯合物[(mmp-mdach)- Ni(Im)]Cl (Fig.1-12)¹⁹，藉由 nitroblue tetrazolium (NBT) assay 得知，

此擬態化合物確實可消耗超氧化物 KO2，但是經由紅外線光譜儀及質

譜的偵測，發現反應後得到的新物種並非是期望得到的鎳三價錯合 物，而是配位基上硫原子被氧化形成 sufenato 及 sulfinato 錯合物。

Fig. 1-13 功能性還原態 Ni-SOD 擬態化合物之二²⁰

Laurence 在 2010 年發表的擬態化合物，是利用三個胺基酸 asparagine-cysteine-cysteine (NCC)組合成的胜肽化合物做為配位基，

與鎳離子配位形成的 NiSOD 擬態化合物(Fig. 1-13)²⁰。因其配位環境 與 NiSOD 活性中心相似，在利用 SOD activity assay 的活性測試上，

表現出具有對超氧化物的反應性，所得到的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)為 4.1 × 10^-5 M。

將上述研究與 Shearer 所發表擷取 NiSOD 前 12 個胺基酸片段組 成的[Ni(SOD)^M1]做比較²¹，發現活性上以[Ni(SOD)^M1]較佳，IC50為 2

× 10^-7 M。與從牛肝紅血球取得到 SOD (一般為 Cu/ZuSOD)做比較²²， IC50則為 2 × 10^-7，表示生物體中 SOD 酵素歧化超氧離子的效果最佳。

本實驗室江建緯學長所進行的研究 ²³，利用含氮氧五牙配位基 H2BDPP，配位基在沒去質子化的情況下與鎳離子形成的二價錯合 物，能夠將 O2−還原成 H2O2，此時二價鎳錯合物則氧化成三價鎳錯合

物，並且可以得到此三價鎳錯合物的晶體結構，成功地模擬氧化態 NiSOD。此三價鎳錯合物又可與 O2−反應產生 O2，本身還原成二價鎳 錯合物，成功的模擬了 NiSOD 的催化循環。