含各式4-羥基脯胺酸配位基之鎳錯合物合成及反應性探討與含鎳超氧化物歧化酶活性中心模擬之研究

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(1)國立台灣師範大學化學系碩士論文. 指導教授：李位仁博士. 含各式 4-羥基脯胺酸配位基之鎳錯合物合成及反應性探討與含鎳超氧化物歧化酶活性中心模擬之研究. Synthesis and Reactivity of Nickel Complexes with various 4-Hydroxy-L-Prolinol Ligands Relevant to the Active Site of Nickel Superoxide Dismutase. 研究生：林昱辰. 中. 華. 民國. 一百零二. 年. 七月.

(2) 謝. 誌. 感謝指導教授李位仁老師這些年來的教誨，不只是在化學領域上，還有待人處事及生涯規劃上都有極大的幫助，讓我在這些日子以來成長許多，在此致上最真誠的感謝與敬意。感謝口試委員清華大學廖文峯教授及交通大學王雲銘教授在百忙之中參加口試及論文審查，並於口試期間不吝指正，提供許多寶貴的意見與建議，使論文能夠更臻完善，在此致謝。研究期間特別感謝師大貴儀郭頂審助教、台大貴儀陸靖蔚小姐、清大貴儀陳若琪小姐以及林震煌老師實驗室的學生協助實驗數據的收集，使得研究過程得以順利進行。感謝子立、建緯、皓晴學長們在實驗及學業上面的教導，以及在實驗室生活中幫助過我的詠剴、智凱、人翰、名時學長姐們，還有一起奮鬥過的志勇、宗翰、允立、維鈴、毓旂、柏毅、玟季、淑如、耘瑄、其翊、彥甫同學們和虹伶、俊傑、于凡等學弟妹們，在實驗室生活上的關懷與鼓勵，讓這些年留下許多深刻的回憶。最後感謝我的父母以及在我有困難的時候聽我發牢騷的許多朋友，有你們的支持與鼓勵才有今天的我。謹致民國一百零二年八月于台師大.

(3) 目. 錄. 中文摘要……………………………………………………………Ⅰ 英文摘要……………………………………………………………Ⅱ 圖索引………………………………………………………………Ⅲ 表索引………………………………………………………………Ⅴ 反應機構索引………………………………………………………Ⅵ 附錄索引……………………………………………………………VII. 第一章緒論.............................................................................................1 第一節研究動機與目的..................................................................1 第二節含金屬超氧化物歧化酶的相關文獻探討 .........................2 一、銅/鋅超氧化物歧化酶，Cu/ZnSOD ...................................3 二、含錳或鐵超氧化物歧化酶，Mn or FeSOD........................4 三、含鎳超氧化物歧化酶...........................................................6 第三節含鎳超氧化物歧化酶擬態化合物的相關文獻探討 .......10 一、結構性還原態 NiSOD 擬態化合物 ..................................10 二、結構性氧化態 NiSOD 擬態化合物 ..................................13 三、還原態 NiSOD 之活性擬態化合物...................................15 第二章實驗部分.......................................................................................18 第一節實驗儀器及藥品................................................................18.

(4) 一、實驗儀器 .............................................................................18 二、實驗藥品 .............................................................................19 三、實驗條件 .............................................................................22 第二節配位基與錯合物的合成與鑑定 .......................................24 一、配位基 BMPOHP 之合成 ....................................................24 二、配位基 BMPOTMSP 之合成 .................................................27 三、配位基 BMPOTPSP 之合成..................................................28 四、配位基 H2BDPPOH 之合成 .................................................29 五、錯合物 [NiII(BMPOHP)](ClO4)2 (1)的合成 .......................33 六、錯合物 [NiII(BMPOTMSP)](ClO4)2 (2)的合成 ....................34 七、錯合物 [NiII(BMPOTPSP)](ClO4)2 (3)的合成 .....................34 八、錯合物 [NiII(BDPPOH)] (4)的合成 ....................................35 九、錯合物 [NiIII(BDPPOH)]PF6 (5)的合成 .............................36 第三節三價鎳擬態錯合物之反應 ...............................................37 一、[NiIII(BDPPOH)]PF6 (5)與 KO2 之反應(用於 GC 偵測) ....37 二、[NiIII(BDPPOH)]PF6 (5)與 KO2 之反應(用於 UV/vis 偵測)37 第三章結果與討論 ..............................................................................38 第一節配位基的合成與探討........................................................39 一、BMPORP 系列之配位基 .....................................................39.

(5) 二、配位基 H2BDPPOH ..............................................................40 第二節鎳金屬錯合物的合成與探討 ...........................................41 一、. 正二價鎳錯合物之 X-ray 結構解析 ...........................41. 二、. 錯合物氧化還原電位之比較 .......................................49. 三、. 正三價鎳錯合物[Ni(BDPPOH)]PF6 (5)合成與探討 ....53. 第三節鎳金屬錯合物與超氧化物反應的探討 ...........................59 一、氧化態 NiSOD 之活性模擬...............................................59 二、超氧化物歧化酶活性測試.................................................62 第四章結論與展望 ..............................................................................64 參考文獻...................................................................................................66. 附錄.

(6) 摘要近年來有研究從土壤鏈黴菌及海生藍綠藻中發現含鎳超氧化物歧化酶(NiSOD)，此酵素催化超氧離子的歧化反應生成過氧化氫及氧氣，藉此避免生物細胞因氧化壓力受到損壞。為了模擬 NiSOD 活性中心的反應性，本研究設計並合成一系列五牙配位基 BMPORP (R = H, TMS, TPS)和 H2BDPPOH，分別與[Ni(CH3CN)6](ClO4)2 反應後，形成正二價鎳錯合物[Ni(BMPOHP)CH3CN](ClO4)2 (1)、 [Ni(BMPOTMSP)(CH3CN)](ClO4)2. (2) 、 [Ni(BMPOTPSP)(CH3CN)](ClO4)2. (3). 和. Ni(BDPPOH) (4)，並利用紫外可見光光譜、循環伏安法以及 X 光繞射解析鑑定。從循環伏安法得知，以 Ag/Ag+做參考電位，發現錯合物 1、 2 和 3 分別在-1.01, -1.04 and -1.09 V 有不可逆的還原峰，表示 [NiII(BMPORP)CH3CN](ClO4)2 系列的錯合物無法形成穩定的正三價鎳錯合物。而錯合物 4 在 0.52 V 的位置有可逆的氧化還原峰，與氧化劑[CP2Fe]PF6 反應後，生成正三價的鎳錯合物[NiIII(BDPPOH)]PF6(5)，並可利用紫外可見光光譜、循環伏安法以及電子順磁共振光譜鑑定錯合物 5 的特性。錯合物 5 可氧化 KO2 產生 O2，本身還原成錯合物 4。在超氧化物歧化酶活性測試中，可以得到錯合物 5 的半抑制濃度為 1.8 × 10-4 M，表示錯合物 5 具有 NiSOD 的活性。. 關鍵字：含鎳超氧化物歧化酶、正三價鎳錯合物、半抑制濃度 I.

(7) Abstract Nickel-containing superoxide dismutase (NiSOD) has been found in the Streptomyces species, and marine cyanobacteria in recent years. NiSOD can catalyze the disproportionation of the superoxide anion into hydrogen peroxide and dioxygen avoiding cell damage from oxidative stress. In order to mimic the active site of NiSOD, various pentadentate lignads, BMPORP (R = H, TMS, TPS) and H2BDPPOH, were designed and prepared. As these ligands reacted with [Ni(CH3CN)6](ClO4)2, four complexes,. [Ni(BMPOHP)(CH3CN)](ClO4)2. (CH3CN)](ClO4)2. (2),. (1),. [Ni(BMPOTMSP)-. [Ni(BMPOTPSP)(CH3CN)](ClO4)2. (3). and. Ni(BDPPOH) (4) were formed. Complexes 1, 2, 3 and 4 were characterized by UV/vis spectroscopy, cyclic voltammetry (CV) and X-ray crystallograph.. CV measurements for complex 1, 2 and 3. displayed an irreversible reduction in MeCN at -1.01, -1.04 and -1.09 V vs Ag/Ag+, respectively. It shows that [NiII(BMPORP)CH3CN](ClO4)2 cannot be oxidized to NiIII complexes. However, CV measurements of complex 4 displayed a reversible event centered at 0.52 V vs Ag/Ag+ suggesting that complex 4 could be oxidized by [CP2Fe]PF6. The NiIII complex, [Ni(BDPPOH)]PF6 (5), characterized by UV/vis spectroscopy, CV and EPR, was synthesized by oxidation of complex 4. Complex 5 could oxidize KO2 to form O2 gas and itself was reduced to complex 4. The superoxide dismutase activity, half maximal inhibitory concentration (IC50) for dismutasing superoxide anion, of complex 5 was 1.8 × 10-4 M. The IC50 reveals complex 5 possessing SOD activity. Keywords：NiSOD, NiIII complex, half maximal inhibitory concentration. II.

(8) 圖索引 Fig. 1- 1 Cu/ZnSOD 的蛋白質結構與活性中心 ......................................3 Fig. 1- 2 MnSOD 的蛋白質結構與活性中心 ...........................................4 Fig. 1- 3 Fe-SOD 的蛋白質結構與活性中心 ...........................................5 Fig. 1- 4 NiSOD 的蛋白質結構與活性中心.............................................6 Fig. 1- 5 Ni-SOD 於理論計算的氧化態與還原態鍵結軌域 ...................9 Fig. 1- 6 結構性還原態 NiSOD 擬態化合物之一 ................................10 Fig. 1- 7 結構性還原態 NiSOD 擬態化合物之二 ............................... 11 Fig. 1- 8 結構性還原態 NiSOD 擬態化合物之三 ................................12 Fig. 1- 9 結構性還原態 NiSOD 擬態化合物之四 ................................12 Fig. 1-10 由 EPR 光譜測定結構性氧化態 NiSOD 擬態化合物之一 ..14 Fig. 1-11 由 EPR 光譜測定結構性氧化態 NiSOD 擬態化合物之二 .14 Fig. 1-12 功能性還原態 NiSOD 擬態化合物之一 ................................15 Fig. 1-13 功能性還原態 NiSOD 擬態化合物之二 ................................16 Fig. 3- 1 [Ni(BMPOHP)](ClO4)2 (1)的 X-ray 結構解析圖 .......................41 Fig. 3- 2 [Ni(BMPOTMSP)](ClO4)2 (2)的 X-ray 結構解析圖 ....................43 Fig. 3- 3 [NiII(BMPOTPSP)](ClO4)2 (3)的 X-ray 結構解析圖 ...................45 Fig. 3- 4 Ni(BDPPOH) (4)的 X-ray 結構解析圖 ......................................47 Fig. 3- 5[Ni(BMPOHP)](ClO4)2 (1)的 CV 圖 ............................................49 III.

(9) Fig. 3-6 [Ni(BMPOTMSP)](ClO4)2 (2)的 CV 圖 ........................................50 Fig. 3-7 [Ni(BMPOTPSP)](ClO4)2 (3)的 CV 圖 .........................................50 Fig. 3-8 Ni(BDPPOH) (4)的 CV 圖 ...........................................................51 Fig. 3-9 錯合物 4 與[CP2Fe]PF6 進行反應的 UV/vis 吸收光譜圖.......54 Fig. 3-10 [Ni(BDPPOH)]PF6 (5)的 CV 圖.................................................54 Fig. 3-11 [Ni(BDPPOH)]PF6 (5)的 EPR 圖譜及模擬的圖譜 ...................56 Fig. 3-12 [NiIII(BDPPOH)]PF6 (5)之鎳離子 d 軌域的能階分布圖 ..........57 Fig. 3- 13 [Ni(BDPPOH)]PF6 (5)的電子密度分布 ...................................58 Fig. 3- 14 [Ni(BDPPOH)]PF6 (5)與 KO2 進行反應的 UV/vis 吸收光譜圖 ...................................................................................................................60 Fig. 3- 15 [Ni(BDPPOH)]PF6 (5) 與 KO2 進行反應的 GC 訊號圖 ...........61. IV.

(10) 表索引 Table 3-1 [Ni(BMPOHP)](ClO4)2 (1)的重要鍵長與鍵角數據.................42 Table 3-2 [Ni(BMPOTMSP)](ClO4)2 (2)的重要鍵長與鍵角數據 .............44 Table 3-3 [Ni(BMPOTPSP)](ClO4)2 (3)的重要鍵長與鍵角數據 ..............46 Table 3-4 [Ni(BDPPOH)] (4)的重要鍵長與鍵角數據 .............................47 Table 3-5 錯合物 1、2、3、4 的重要鍵長數據 ...................................48 Table 3-6 錯合物 4 與 Ni(BDPP)的重要鍵長數據 ...............................49 Table 3-7 錯合物 4 與酵素及其他擬態化合物的半電位比較 .............52 Table 3-8 Ni(BDPPOH)]PF6 (5)的電子密度分布 .....................................58 Table 3-9 文獻上酵素及模擬化合物的半抑制濃度 .............................63. V.

(11) 反應機構索引 Scheme 1-1Cu/Zn-SOD 進行氧化還原的反應機構................................4 Scheme 1-2 MnSOD 進行氧化還原的反應機構......................................5 Scheme 1-3 FeSOD 進行氧化還原的反應機構 .......................................6 Scheme 1-4 NiSOD 進行氧化還原的反應機構 .......................................7 Scheme 1-5 NiSOD 於文獻上推測的反應機構 .......................................8 Scheme 1-6 Ni(BDPP)擬態化合物之反應機構......................................17 Scheme 3-1 BMPORP 系列配位基的合成步驟 ......................................39 Scheme 3-2 BDPPOH 的合成步驟 ...........................................................40 Scheme 3-3 超氧化物歧化酶活性測試之反應過程 ..............................62. VI.

(12) 附錄索引附錄 A NMR 光譜圖及電子吸收光譜 Figure A-1 2,6-Bis(bromomethyl)pyridine 的 1H-NMR 光譜圖 Figure A-2 (2S,4R)-4-Hydorxy-2-pyrrolidinecarboxylic acid methyl ester hydrochloride 的 1H-NMR 光譜圖 Figure A-3 2,6-Bis(((2S,4R)-4-hydroxy-2-(methyloxycarbonyl)-1pyrrolidinyl)methyl)pyridine (BMPOHP)的 1H-NMR 光譜圖 Figure A-4 BMPOTMSP 的 1H-NMR 光譜圖 Figure A-5 BMPOTMSP 的 13C-NMR 光譜圖 Figure A-6 BMPOTMSP 的 13C-NMR 光譜圖 Figure A-7 BMPOTPSP 的 1H-NMR 光譜圖 Figure A-8 (2S,4R)-1-Ethyl-2-methyl-4-hydroxypyrrolidine-1,2dicarboxylate 的 1H-NMR 光譜圖 Figure A-9 (2S,4R)-Ethyl-4-hydroxy-2-(hydorxydiphenylmethyl)pyrrolidine-1- carboxylate 的 1H-NMR 光譜圖 Figure A-10 (2S,4R)-4-Hydroxy-2-(hydroxydiphenylmethyl) pyrrolidine 的 1H-NMR 光譜圖 Figure A-11 2,6-Bis(((2S,4R)-4-hydorxy-2-(diphenylhydroxymethyl)1-pyrrolidiny)methyl)pyridine (H2BDPPOH) 的 1H-NMR 光譜圖 Figure A-12 2,6-Bis(((2S,4R)-4-hydorxy-2-(diphenylhydroxymethyl)1-pyrrolidiny)methyl)pyridine (H2BDPPOH) 的 1H-NMR 光譜圖 Figure A-13 NiBMPOHP(1)的電子吸收光譜 VII.

(13) Figure A-14 NiBMPOTMSP(2)的電子吸收光譜 Figure A-15 NiBMPOTPSP(3)的電子吸收光譜. 附錄 B X-光結構解析數據 Table B-1 [Ni(BMPOHP)](ClO4)2 (1)的晶體常數 Table B-2[Ni(BMPOTMSP)](ClO4)2 (2)的晶體常數 Table B-3 [Ni(BMPOTPSP)](ClO4)2 (3)的晶體常數 Table B-4 NiBDPPOH (4)的晶體常數. 附錄 C CV 光譜圖 Figure C-1 [Ni(BMPOHP)](ClO4)2 (1) 的 CV 圖 Figure C-2 [Ni(BMPOTMSP)](ClO4)2 (2) 的 CV 圖 Figure C-3 [Ni(BMPOTPSP)](ClO4)2 (3) 的 CV 圖 Figure C-4 Ni(BDPPOH) (4) 的 CV 圖 Figure C-5 Ni(BDPPOH)PF6 (5) 的 CV 圖. VIII.

(14) 第一章. 緒論. 第一節研究動機與目的氧氣在生物體內可以經過不同的途徑產生如 hydroxyl radical(·OH) 、 superoxide anion(O2−) 等活性氧化物 (reactive oxygen species, ROS)。在正常的生理環境下，此類 ROS 具有防止病菌入侵生物體內、抑制癌細胞生長和調節細胞訊息傳遞等作用。但是受到異常環境的影響，例如紫外線照射、輻射、吸菸、空氣汙染等，會使 ROS 過量進而與 DNA，蛋白質和細胞膜脂質進行反應，導致心血管疾病、高血壓、糖尿病、神經方面等病變的傷害。生物體中存在具有抗氧化能力的酵素，用以減少 ROS 所造成的傷害，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)就是其中一種，它能使 O2—進行歧化反應轉化為毒性較低的過氧化氫及氧氣，藉以控制 ROS 在體內的濃度，預防疾病的發生。本研究會進行關於 SOD 的相關研究，以合成的方式得到具有 SOD 催化活性的化合物，來探討 SOD 的反應機制，並且期望能應用在醫療方面，治療及預防由 ROS 造成的疾病。. 1.

(15) 第二節含金屬超氧化物歧化酶的相關文獻探討超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD) 的存在最早是由 Fridovich 和 McCord 等人於 1969 年發現，其為生物體自身抵抗氧化的機制，並廣泛地存在於各種動物、植物、微生物中，避免細胞受到自由基攻擊而造成的突變或損害。O2−為生物體中進行呼吸作用所產生的副產物，具有高度的活性，當濃度過高時會攻擊 DNA，蛋白質和細胞膜脂質造成傷害。SOD 可以使 O2−進行歧化反應，轉換為 O2 及 H2O2，藉此調控 O2−在生物體內的濃度，且與其他酵素相比，SOD 具有最快的超氧化物轉換效率( 約 7 × 109 M−1s−1 ， pH = 7 時，O2−轉換為 O2 及 H2O2 的反應速度為 ~105 M−1s−1 )1。SOD 催化超氧化物的歧化反應可分為兩個步驟：. 氧化反應：M(n+1)-SOD + O2− → Mn+-SOD + O2 還原反應：Mn+-SOD + O2− + 2H+ → M(n+1)-SOD + H2O2. 其中 M 可以是 Cu (n = 1)；Mn (n = 2)；Fe (n = 2)；Ni (n = 2)，亦即超氧化物歧化酶可以是銅/鋅、錳或鐵、或鎳作為酵素活性中心的金屬離子：它們在此反應中，金屬離子 M 的氧化態在 n 和 n+1 之間往返變化。關於此三大類 SOD 的敘述如下：. 2.

(16) 一、銅/鋅超氧化物歧化酶，Cu/ZnSOD 1939 年 Mann 與 Keilin 從牛的紅血球及肝細胞中分離出含有鋅及銅的蛋白質，但不被認為具有酵素的功能，因此這種蛋白質被當做只具有儲存金屬的功用。直至 1969 年 McCord 與 Fridovich 發現此種含銅鋅的蛋白質具有清除超氧自由基的功能，因此將它命名為超氧歧化酶，隨後陸續在各種生物體內發現有銅鋅型超氧歧化酶的存在。. Fig. 1-1 Cu/ZnSOD 的蛋白質結構與活性中心 2,3. 大多數從真核細胞內分離出的 Cu/ZnSOD 酵素呈淡藍色，分子量約為 32 kDa，具有兩個相同次單體(subunit)，每個次單體都有一個活性中心，含有一個銅離子與鋅離子。由 X- 光單晶繞射解析此 Cu/ZnSOD 蛋白質分子結構，可發現銅離子在活性中心是由四個 His 上的氮配位，其中有一個 His 與鋅離子做橋梁連結，另外還有兩個 His 及一個 Asp 與鋅離子鍵結。銅離子在此酵素中扮演氧化和還原 O2−的角色，而鋅離子的主要 3.

(17) 功能是穩定酵素的結構。Cu/ZnSOD 進行 O2−歧化反應的反應機構如 Scheme 1-1 所示。. Scheme 1-1 Cu/Zn-SOD 進行氧化還原的反應機構 3. 若是將銅離子替換成其他金屬離子，酵素會失去活性，但若是將鋅離子替換成 Co2+、Hg2+或 Cd2+，則酵素仍具有部分活性 4。. 二、含錳或鐵超氧化物歧化酶，Mn or FeSOD MnSOD 最早由 Keele 等人在 1970 年由大腸桿菌中分離出來，顏色為淡紅色，此酵素主要存在於原核細胞與真核細胞的粒腺體中，是粒線體中主要的抗氧化酵素，負責轉化粒線體中的超氧離子。. Fig. 1-2 MnSOD 的蛋白質結構與活性中心 5 4.

(18) MnSOD 的每個單體分子量約 19~24 kDa，每個單元體中含有一個錳離子。錳離子與三個 His 及一個 Asp 鍵結，並與兩個 His、一個 Trp 及一個 Tyr 組合成活性中心。MnSOD 進行氧化還原的反應機構如 Scheme 1-2 所示。. Scheme 1-2 MnSOD 進行氧化還原的反應機構 6. FeSOD 第一是被分離出來也是從大腸桿菌中，分布於原核細胞基質 (cell matrix)、藻類中，在動物組織中極少發現 FeSOD 的存在。. Fig. 1-3 Fe-SOD 的蛋白質結構與活性中心 7, 8. 5.

(19) FeSOD 胺基酸序列上與 MnSOD 相似，顏色為淡黃色，每個單位體分子量約 18.5~22 kDa，鐵離子與三個 His 及一個 Asp 鍵結。FeSOD 進行氧化還原的反應機構如 Scheme 1-3 所示。. Scheme 1-3 FeSOD 進行氧化還原的反應機構. 三、含鎳超氧化物歧化酶 NiSOD 是在 1996 年由 Youn 等人於鏈黴菌(Streptomyces) 及藍綠藻( cyanobacteria)中發現，由 X-光單晶繞射解析後得知其為四個蛋白質單體構成，分子量約 53.7 kDa。. Fig. 1-4 NiSOD 的蛋白質結構與活性中心 9. 6.

(20) 還原態 NiSOD 活性中心的配位環境如 Scheme 1-4 左側所示，在鎳離子中心赤道面的平行四邊形上，配位著 His 上末端胺的氮及骨架上醯胺的氮以順式位向(cis arrangement)佔據平面四邊形的兩個角，與兩個亦為順式位向配位於平面四邊形另外兩個角的 Cys 硫醇上的硫，形成 NiIIN2S2 平面四邊形的結構。在氧化態 NiSOD 的活性中心，除了原本平面四角形的結構，軸位上 His 咪唑的氮會配位到鎳離子中心，形成 NiIIIN3S2 平面四角錐的結構如 Scheme 1-4 右側所示。. Scheme 1-4 NiSOD 進行氧化還原的反應機構. 目前文獻上推測 NiSOD 的反應機制之一如 Scheme 1-5 所示，當 O2−進入還原態 NiSOD 與鎳離子鍵結後，藉由活性中心周圍的 Tyr9、 Cys2 與 Cys6 上的氫鍵穩定 O2−，接著進行還原反應，將 O2−還原成 H2O2 釋出，同時正二價的鎳中心氧化成三價鎳離子，因金屬中心缺電子的關係，His1 上咪唑的氮配位置鎳離子中心。接著氧化態 NiSOD 的三價鎳離子中心繼續與 O2−反應，同樣藉由 Tyr9、Cys2 與 Cys6 上的氫鍵穩定鍵結在鎳離子上的 O2−，接著進行氧化反應使 O2−氧化成 7.

(21) O2 釋出，同時配位在軸位的 His1 離開鎳離子中心，鎳離子還原為二價平面四邊形的構形，完成了 NiSOD 催化 O2−為 H2O2 及 O2 的循環。. Scheme 1-5 NiSOD 於文獻上推測的反應機構 10. 經由理論計算來解釋 NiSOD 活性中心的反應性，還原態 NiSOD 活性中心之氮及硫原子的 p 軌域與鎳離子的 d 軌域進行 π interacction 的鍵結，使得 π* 軌域填入成對電子，藉由氮及硫原子之 π interacction，造成 π*軌域能量較高而不穩定。因此當 O2−進入時，π* 軌域的電子會轉移至 O2−，配合 2 個質子，使 O2−還原成 H2O2，鎳離 8.

(22) 子中心則氧化成正三價，形成氧化態 NiSOD。在氧化態 NiSOD 的情況下，則是當軸位 His 的氮配位後，以其 p 軌域與鎳離子中心的 d 軌域進行 σ interaction 鍵結，使 1 個未成對電子填入 σ*軌域。當 O2−進入後會提供一個電子還原三價的鎳離子中心，且軸位的 His 則會離開鎳離子中心，而成為還原態 NiSOD，而 O2−氧化成 O2。. Fig. 1.5 Ni-SOD 於理論計算的氧化態與還原態鍵結軌域 11. 9.

(23) 第三節含鎳超氧化物歧化酶擬態化合物的相關文獻探討由目前文獻發表的蛋白質結構可知，還原態 NiSOD 的鎳離子中心較為穩定且傾向以平面四邊形的構型存在，在合成擬態化合物上相對比較穩定，因此在過去的文獻上大多著重於還原態 NiSOD 擬態化合物的探討，而氧化態 NiSOD 的探討相對較少。接著分別就過去的文獻，針對結構性還原態 NiSOD 擬態化合物、功能性還原態 NiSOD 擬態化合物以及結構性氧化態 NiSOD 擬態化合物作介紹：. 一、結構性還原態 NiSOD 擬態化合物關於還原態 NiSOD 的擬態化合物，大多是以 N2S2 的配位基，與二價鎳配位形成平面四邊形的錯合物，來做為還原態 NiSOD 的結構模擬及光譜性質的探討。. Fig. 1-6 結構性還原態 Ni-SOD 擬態化合物之一 12, 13. 10.

(24) 由 Krüger 及 Holm 等人於西元 1987 年. 12. 及 1998 年. 13. 發表. [Ni(phmi)]2- 及 [Ni(ema)]2-、[Ni(phma)]2- 與 [Ni(emi)]2- ( Fig. 1-6 )的文獻中可知，將 N2S2 配位基與鎳二價金屬離子鍵結，其中兩 amidate 的 N 配位分別模擬還原態 Ni-SOD 活性中心之 His1 上末端 amine 的 N 及 backbone 上 amide 的 N；兩 S 則分別模擬兩個 Cys2 與 Cys6 上 thiolate 之 S，形成平面四方的構形，結構上與還原態 Ni-SOD 活性中心之結構皆具有一定程度的相似度，且因這類型配位基的硫與氮上的氫有機會被去質子化使配位基為負三、四價，有機會迫使鎳金屬中心氧化，形成高價氧化態的錯合物。. Fig. 1-7 結構性還原態 Ni-SOD 擬態化合物之二 14. 2010 年由 Shearer 設計兩個二價鎳結構性還原態 NiSOD 擬態錯合物 (Fig. 1-7)14，並藉由光譜及理論計算的研究，進行與酵素活性中心間的比較及探討。其配位方式與還原態 NiSOD 相當相似，僅一個 amidate 與 amine 的差別，較能符合 NiSOD 於氧氣下穩定存在之性質。. 11.

(25) Fig. 1-8 結構性還原態 Ni-SOD 擬態化合物左至右分別為 TpPh,MeNiS2CNPh2、TpPh,MeNiS2CNEt2 與 TpPh,MeNiS2COEt15. 在 2008 年由 Jensen 利用 hydrotris(3-phenyl-5-methylpyrazoyl)boratonickel(II)分別與 organoxanthate 及 dithiocarbamate 配位形成含氮硫五牙基的二價鎳錯合物 (Fig. 1-8)15，並從氧化還原電位探討還原態 Ni-SOD 氧化成氧化態 Ni-SOD 時可能經歷之中間態 18。但在此階段仍未能得到 NiIIIN3S2 的結構性氧化態 Ni-SOD 擬態化合物。 Harrop 在 2011 年發表的擬態化合物(Fig. 1-9)16，同樣是以 N2S2 為基本架構，再修飾配位基成 N3S2，將其與鎳離子配位形成一 N2S2 平面四邊形構形的錯合物。此錯合物在結構及電性上都與 NiSOD 活性中心相似，然而當加入氧化劑 FcPF6 後，卻得到 N3S 配位至二價鎳而另一個硫原子與另一分子的硫形成 disufide 而形成雙核錯合物。雖然反應過程中，可以利用 EPR 在 4 K 環境下，短暫偵測到同時具有 NiIII 及 radial 的混合訊號，但未能直接分離出五配位之三價鎳的氧化態擬態化合物。. 12.

(26) Fig. 1-9 結構性還原態 Ni-SOD 擬態化合物之四 16. 二、結構性氧化態 NiSOD 擬態化合物有部分研究發現，若使用如 salen-type 或前述 N2S2 的配位基，因具有高負電性，在與二價鎳離子配位後，若使用氧化劑將其氧化，將會使配位基上的一個電子被移除形成 ligand radial。但若額外添加吡啶或咪唑等分子，有機會使得鎳金屬中心由二價氧化成三價，可用 EPR 光譜佐證此現象。. 13.

(27) Fig. 1-10 由 EPR 光譜測定結構性氧化態 Ni-SOD 擬態化合物之一 17. 如 Krüger 及 Holm 於 1987 年及 1998 年所發表的一系列二價鎳錯合物 [Ni(phmi)]2- 及 [Ni(ema)]2-、[Ni(phma)]2- 與 [Ni(emi)]2-，於溶液中加入 pyridine 後進行 Electron paramagnetic resonance ( EPR ) 的測量，得到自旋量子數為 1/2 的 NiIII 訊號，並且因為 pyridine 的氮原子與鎳中心未成對電子偶合(coupling)的關係，使其具有 triplet 的超精細結構 (super-hyperfine coupling) (Fig. 1-10)17。顯示此 NiIII 可做為結構性氧化態 NiSOD 擬態化合物，因其配位方式與氧化態 NiSOD 皆為 NiIIIN3S2。. Fig. 1-11 由 EPR 光譜測定結構性氧化態 Ni-SOD 擬態化合物之二 18. 14.

(28) 2010 年由 Duboc 所合成的二價鎳錯合物(Fig. 1-11)18，也可以得到相似的結果，其中兩個氮是由配位基上 bipyridine 提供，當含錯合物的溶液加入咪唑後，經由電化學方式將其氧化，從 EPR 光譜上即可偵測 NiIII 之訊號。並藉由 CV 光譜說明其 NiSOD 擬態化合物在外加適當電壓下，其氧化態與還原態可進行可逆的轉換。. 三、還原態 NiSOD 之活性擬態化合物由於 NiSOD 被發現的時間較晚，對此酵素進行擬態化合物相關研究亦較少，且多以結構模擬為主。Darensbourg 及 Laurence 所發表的研究結果是目前少數可消耗超氧化物，並展現活性的結果。Shearer 則是將酵素蛋白質片段進行修飾，探討胜肽鏈所形成的化合物的活性與酵素間做比較。. Fig. 1-12 功能性還原態 Ni-SOD 擬態化合物之一 19. 由 Darensbourg 在 2009 年發表的正二價鎳錯合物 [(mmp-mdach)Ni(Im)]Cl ( Fig. 1-12)19，藉由 nitroblue tetrazolium (NBT) assay 得知，此擬態化合物確實可消耗超氧化物 KO2，但是經由紅外線光譜儀及質 15.

(29) 譜的偵測，發現反應後得到的新物種並非是期望得到的鎳三價錯合物，而是配位基上硫原子被氧化形成 sufenato 及 sulfinato 錯合物。. Fig. 1-13 功能性還原態 Ni-SOD 擬態化合物之二 20. Laurence 在 2010 年發表的擬態化合物，是利用三個胺基酸 asparagine-cysteine-cysteine (NCC)組合成的胜肽化合物做為配位基，與鎳離子配位形成的 NiSOD 擬態化合物(Fig. 1-13)20。因其配位環境與 NiSOD 活性中心相似，在利用 SOD activity assay 的活性測試上，表現出具有對超氧化物的反應性，所得到的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)為 4.1 × 10-5 M。將上述研究與 Shearer 所發表擷取 NiSOD 前 12 個胺基酸片段組成的[Ni(SOD)M1]做比較 21，發現活性上以[Ni(SOD)M1]較佳，IC50 為 2 × 10-7 M。與從牛肝紅血球取得到 SOD (一般為 Cu/ZuSOD)做比較 22， IC50 則為 2 × 10-7，表示生物體中 SOD 酵素歧化超氧離子的效果最佳。本實驗室江建緯學長所進行的研究. 23. ，利用含氮氧五牙配位基. H2BDPP，配位基在沒去質子化的情況下與鎳離子形成的二價錯合物，能夠將 O2−還原成 H2O2，此時二價鎳錯合物則氧化成三價鎳錯合 16.

(30) 物，並且可以得到此三價鎳錯合物的晶體結構，成功地模擬氧化態 NiSOD。此三價鎳錯合物又可與 O2−反應產生 O2，本身還原成二價鎳錯合物，成功的模擬了 NiSOD 的催化循環。. Scheme 1-6 Ni(BDPP)擬態化合物之反應機構. 因此本研究中以 H2BDPP 為基礎，合成將 H2BDPP 上吡咯 4 號位置修飾為羥基的 H2BDPPOH，以及設計同樣為 N3O2 的 BMPORP 系列配位基，比較配位基上氧原子提供電子能力的不同，是否會影響三價鎳錯合物的穩定性，再進一步探討錯合物是否具有 SOD 活性。. 17.

(31) 第二章. 實驗部分. 第一節實驗儀器及藥品一、實驗儀器 1、紫外光-可見光光譜儀 (Ultraviolet/Visible/Spectrophotometer) 機型：Agilent 8453 Spectrophotometer 測量方法：將樣品溶於有機溶劑中，放入石英偵測容器中測定。 2、核磁共振光譜儀(NMR) 機型：Burker AVANCE 400 NMR 測量方法：將樣品溶於 d-溶劑中測定 1H 或 13C 光譜。 3、元素分析儀(Elemental Analysis) 機型：德國 Heraeus varioIII-NCH Analyzer 測量方法：委由國科會台灣大學貴儀中心陸靖蔚小姐代為測定。 4、X-光單晶結構解析(X-ray diffractometer) 繞射點數據收集及晶體之分子結構解析機型：Nonius Kappa CCD Axis 四環單晶繞射儀 Bruker AXS Kappa ApexⅡ四環單晶繞射儀測量方法：委由台灣師範大學貴儀中心郭頂審先生代為收集繞射點數據及解析結構。 18.

(32) 5、循環伏安儀 (cyclic voltammetry) 機型：Epsilon EC-V160 測量方法：使用 0.1 M 的 TBABF4 溶液，配置成樣品濃度為 0.001 M 的混合液。工作電極為 2 mm 玻璃碳電極，參考電極為銀電極，補助電極為白金電極。. 二、實驗藥品 1、溶劑甲醇 (Methanol)：Mallinckrodt chemicals，AR 級乙醚 (Diethyl ether)：Merck，GR 級二氯甲烷 (Dichloromethane)：Merck，GR 級乙腈 (Acetonitrile)：Merck，GR 級四氫呋喃 (Tetrahydrofuran)：Merck，GR 級己烷 (Hexane)：Mallinckrodt chemicals，AR 級戊烷 (Pentane)：TEDIA，AR 級二次超純水 (Water)：取自系上 Milli-RO 60 water purification system 氘化氯仿 (Chloroform-d1, CD3Cl)：CIL 氘化甲醇 (Methanol-d4, CD3OD)：CIL. 19.

(33) 2、溶劑採用試藥級溶劑，在氮氣環境下乾燥蒸餾使用，純化方法如下 (1) 甲醇 / Methanol, CH3OH： J.T.Baker 公司 ACS 級產品，於氮氣下加入 10 公克鎂粉及 1 克的碘一起溶在 100 毫升的甲醇中，一開始溶液顏色為褐色，在氮氣中迴流 5 個小時後，顏色會變為鐵灰色，最後於氮氣下加入 1.4 公升的甲醇，在氮氣中迴流蒸餾至少 24 小時去除水分後，再行取用。 (2) 四氫咈喃 / Tetrahydrofuran, THF, C4H8O： Merck 公司 ACS 級產品，於氮氣下加入切成細碎片狀的鈉金屬，迴流至少 12 小時，以二苯酮 (benzophenone) 為指示劑，加熱迴流溶液呈紫色狀態時，再行取用。 (4) 乙腈 / Acetonitrile, ACN, CH3CN： Merck 公司 ACS 級產品，使用 MBRAUN 公司之 MB-SPS COMPACT 除水後再行取用。 (5) 乙醚 / Ethyl Ether, C4H10O： Merck 公司 ACS 級產品，使用 MBRAUN 公司之 MB-SPS COMPACT 除水後再行取用。 (6) 正己烷 / n-Hexane, C6H14： J.T.Baker 公司 ACS 級產品，使用 MBRAUN 公司之 MB-SPS COMPACT 除水後再行取用。 20.

(34) (7) 二氯甲烷 / Methylene dichloride, DCM, CH2Cl2： Merck 公司 ACS 級產品，使用 MBRAUN 公司之 MB-SPS COMPACT 除水後再行取用。 (8)正戊烷 / Pentane, C5H12： Merck公司ACS級產品，於氮氣下加入切成細碎片狀的鈉金屬，迴流至少12小時，以二苯酮 (benzophenone) 為指示劑，加熱迴流溶液呈紫色狀態時，再行取用。 3、合成配位基所使用的藥品 (1) trans-4-Hydroxy-L-proline：試藥級，ACROS。 (2) Triethylamine, NEt3：試藥級，ACROS。 (3) Sodium chloride, NaCl：試藥級，島久。 (4) Ethyl chloroformate：試藥級，ACROS。 (5) Chlorotrimethylsilane , Me3SiCl：試藥級，ACROS。 (6) Chlorophenylsilane , Ph3SiCl：試藥級，島久。 (7)Bromobenzene：試藥級，ACROS。 (8) 2,6-Pyridinedimethanol：試藥級，ACROS。 (9) Hydrobromic acid, HBr：試藥級，ACROS。 (10) Sodium hydroxide, NaOH：試藥級，島久。 (11) Potassium carbonate, K2CO3：試藥級，島久。 21.

(35) 4、合成錯合物所使用的藥品 (1) Nickel(II) perchlorate hexahydrate, Ni(ClO4)2·6H2O：Aldrich，98%。 (2) Sodium hydride, NaH：試藥級，ACROS。 (3) ferrocenium hexafluorophoshate：試藥級，ACROS。. 5、進行催化反應所使用的藥品 (1) Potassium superoxide, KO2：試藥級，ACROS。 (2) Dioxygen, 16O2：豐明氣體. 三、實驗條件需要在氮氣條件下反應者，一律使用 Schlenk technique 或在手套箱 ( N2(g)-filled glove box maintained at or below 0.1 ppm of O2 and 1 ppm of H2O )下操作。使用的玻璃器材、雙頭鋼針、鐵轉接頭、鋼針都需放置在設定 120 ºC 的烘箱中烘烤過，使用時才拿出來。由手套箱秤取藥品時，必需以血清塞、銅線及 Para film 封住反應瓶或樣品瓶瓶口，再送出手套箱。若要將反應瓶側管接真空系統時，需先將側管部分抽真空，並以火焰槍烤過，再灌入氮氣回壓，重複上述動作三次後，最後在灌入氮氣的條件下，轉開轉閥連接反應瓶與真空系統，進行後續實驗操作。若是樣品瓶或定量瓶，則要先取另一個空樣品瓶塞上血清塞、銅線及 Para film 封口後，以真空系統接上鐵製轉接頭接鋼針的方式 22.

(36) 插入此樣品瓶，待抽真空灌氮氣回壓三次後，再於氮氣下將鋼針轉插到含藥品的瓶中，或是以真空系統使用轉接頭接鋼針方式持續吹出氮氣約 5 秒後，再將鋼針轉插到含藥品的藥品瓶，進行後續實驗動作。在空氣條件下進行的反應，其過程在空氣下操作，使用一般試藥級溶劑，溶劑的轉移以滴管吸取加入，養經過程則是置於未經除水除氧的養晶瓶內。. 23.

(37) 第二節配位基與錯合物的合成與鑑定一、配位基 BMPOHP 之合成. 1. 2,6-Bis(bromomethyl)pyridine. 秤取 2,6-pyridinedimethanol 5 公克(35.9 毫莫耳)於 250 毫升圓底瓶，再倒入溴酸 100 毫升，加熱迴流反應 5 小時。秤取 4 公克氫氧化鈉加入 100 毫升二次蒸餾水配置成 1N 氫氧化鈉水溶液，逐滴加入反應瓶中使溶液呈中性。接著加入飽和氯化鈉水溶液 250 毫升萃取，前後共萃取 5 次，有機層使用無水硫酸鎂除水，過濾後將濾液使用迴旋濃縮機抽乾可以得到白色粗產物。加入適量的二氯甲烷溶解，使用二氯甲烷為沖提液進行管住層析法分離，再將收集液使用迴旋濃縮機抽乾可以得到白色固體 2,6-Bis(bromomethyl)pyridine 4.367 克，產率 46%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ7.74 (t, 1H, Py)，7.39 (d, 2H, Py)，4.53 (s, 4H, CH2) ppm，詳細 NMR 光譜圖於附錄。 24.

(38) 2. (2S,4R)-4-Hydorxy-2-pyrrolidinecarboxylic. acid. methyl. ester. hydrochloride. 秤取 trans-4-hydroxy-L-proline 5.000 克(38.13 毫莫耳)於 250 毫升圓底瓶，並將 100 毫升甲醇倒入反應瓶中。在冰浴下緩慢加入 Thionyl chloride 3.5 毫升(49.40 毫莫耳)，再將冰浴移除使反應溶液升溫至室溫後，加熱迴流反應 16 小時。反應結束後，利用迴旋濃縮機將溶液抽乾，加入甲苯 60 毫升溶解粗產物，於真空系統下加熱抽乾產物，可以得到白色固體 (2S,4R)-4- Hydorxy-2-pyrrolidinecarboxylic acid methyl ester hydrochloride 6.92 克，產率為 99%。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)：δ4.63-4.58(m, 2H, CH2)，3.86(s, 3H, OCH3)，3.32-3.25(m, 1H, CH)，2.49-2.39(m, 1H)， 2.26-2.17(m, 1H) ppm，詳細 NMR 光譜圖於附錄。. 25.

(39) 3. 2,6-Bis(((2S,4R)-4-hydroxy-2-(methyloxycarbonyl)-1-pyrrolidinyl)met hyl)- pyridine (BMPOHP). 秤取 2,6-Bis(bromomethyl)pyridine 20.6 克(7.78 毫莫耳)和(2S,4R)-4Hydorxy-2-pyrrolidinecarboxylic acid methyl ester hydrochloride 2.81 克 (15.55 毫莫耳)於 100 毫升單頸圓底瓶，抽真空後灌入氮氣，重複三次。加入除水二氯甲烷將其溶解，在冰浴下加入二乙胺 5.42 毫升(38.88 毫莫耳)，將反應混合物於室溫下反應 2 天。反應結束後，以迴旋濃縮機抽乾溶液，可以得到黃色油狀物，使用管住層析法分離產物，沖提液為甲醇跟乙酸乙酯的混合液(3:1)，並加入 5%的三乙胺鹼化管柱，將收集液使用迴旋濃縮機抽乾，可以得到黃色油狀產物，產率 47%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ7.63-7.57(t, 1H)，7.09-7.05(d, 2H)，4.34-4.29(t, 2H)，4.20-4.06(q, 4H)，4.00-3.89(t, 2H)，3.67(s, 6H)，3.49-3.42(dd, 2H)，3.04-2.98(d, 2H)， 2.28-2.20(m, 2H)，2.18-2.09(m, 2H) ppm。詳細 NMR 光譜圖於附錄。. 26.

(40) 二、配位基 BMPOTMSP 之合成. 秤取 BMPOHP 0.4 克(1.02 毫莫耳)於 100 毫升單頸圓底瓶，抽真空後灌入氮氣，重複三次。加入除水二氯甲烷 50 毫升將其溶解之後，加入三乙胺 0.35 毫升(2.54 毫莫耳)。之後在冰浴下緩慢加入 Chlorotrimethylsilane 0.46 毫升(2.54 毫莫耳)，反應 16 小時。反應結束之後加入二次蒸餾水 50 毫升，並用二氯甲烷 50 毫升萃取，前後共萃取 3 次，有機層使用無水硫酸鎂除水，過濾後將濾液使用迴旋濃縮機抽乾，可以得到黃色油狀物。使用管住層析法分離產物，沖提液為乙酸乙酯跟己烷的混合液(10:1)，將收集液使用迴旋濃縮機抽乾，可以得到黃色油狀產物，產率 80%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ7.54-7.47(t, 1H)，7.24-7.19(d, 2H)，4.36-4.29(p, 2H)， 3.94-3.89(d, 2H) ， 3.75-3.68(d, 2H) ， 3.61-3.56(d, 2H) ， 3.54(s, 6H) ， 3.23-3.16(dd, 2H)，2.14-2.04(m, 2H)，1.98-1.89(m, 2H)，-0.08(s, 18H) ppm。詳細 NMR 光譜圖於附錄。. 27.

(41) 三、配位基 BMPOTPSP 之合成. 秤取 BMPOHP 0.4 克(1.02 毫莫耳)於 100 毫升單頸圓底瓶，抽真空後灌入氮氣，重複三次。加入除水二氯甲烷 50 毫升將其溶解之後，加入三乙胺 0.35 毫升(2.54 毫莫耳)。之後在冰浴下緩慢加入 Chlorotriphenylsilane 0.75 克(2.54 毫莫耳)，反應 16 小時。反應結束之後加入二次蒸餾水 50 毫升，並用二氯甲烷 50 毫升萃取，前後共萃取 3 次，有機層使用無水硫酸鎂除水，過濾後將濾液使用迴旋濃縮機抽乾，可以得到黃色油狀物。使用管住層析法分離產物，沖提液為乙酸乙酯跟己烷的混合液(10:1)，將收集液使用迴旋濃縮機抽乾，可以得到黃色油狀產物，產率 70%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ7.68-7.63(d, 12H)，7.62-7.56(t, 1H)，7.47-7.32(m, 20H)， 4.76-4.68(p, 2H)，4.12-4.06(d, 2H)，3.95-3.89(d, 2H)，3.88-3.82(t, 2H)，3.62(s, 6H)，3.36-3.29(dd, 2H)，2.80-2.73(dd, 2H)，2.29-2.21(m, 2H)，2.20-2.11(m, 2H) ppm。詳細 NMR 光譜圖於附錄。. 28.

(42) 四、配位基 H2BDPPOH 之合成. 此配位基合成步驟是參考本實驗室畢業的博士生江建緯學長開發的合成方法，步驟如下： 1. (2S,4R)-1-Ethyl-2-methyl-4-hydroxypyrrolidine-1,2-dicarboxylate. 秤取 trans-4-hydroxy-L-proline 5.000 克(38.13 毫莫耳)與碳酸鉀 8.432 克(61 毫莫耳)於含磁石的 250 毫升圓底瓶中，加入 100 毫升的甲醇，形成白色的混濁溶液。架一個冰浴水盆使圓底瓶維持在 0 ℃，在冰浴下以針筒緩慢加入醯氯甲酸乙酯 11.3 毫升(117.94 毫莫耳)，讓溫度維持在 0 ℃下反應 2 小時，再將冰浴水盆移去，在室溫下反應 16 小時。反應完畢後，以迴旋濃縮機將溶劑抽乾，加入二次蒸餾水 100 毫升，以二氯甲烷 200 毫升萃取，前後共萃取 3 次，收集有機層以飽和氯化鈉水溶液 100 毫升再萃取一次，接著有機層利用無水硫酸鎂除水，過濾後將濾液抽乾後即可得到透明油狀物 (2S,4R)-1-Ethyl-2-methyl-4-hydroxy-pyrrolidine-1,2-. 29.

(43) dicarboxylate 11.011 克，產率為 88%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ 4.50-4.45 (m,2H)，4.16-4.13 (m,2H)，3.76-3.72 (m,3H)，3.67-3.62 (m,2H)， 2.12-.05 (m,3H)，1.30-1.17(m,3H) ppm，詳細 NMR 光譜圖於附錄。. 4. (2S,4R)-Ethyl-4-hydroxy-2-(hydorxydiphenylmethyl)pyrrolidine-1carboxylate. 秤取 (2S,4R)-1-Ethyl-2-methyl-4-hydroxypyrrolidine-1,2-dicarboxylate 3.258 克(15 毫莫耳)置於含磁石的 500 毫升圓底瓶中，將圓底瓶抽真空五分鐘後灌入氮氣回壓，重複 3 次，在氮氣的環境下加入 20 毫升的四氫呋喃使其溶解。在冰浴下攪拌十分鐘後，以針筒抽取 1.0 M PhMgBr 四氫呋喃溶液 60 毫升(60 毫莫耳)緩慢滴入反應瓶中，反應溶液於冰浴環境下反應兩小時。反應完畢後，在冰浴下緩慢加入飽和氯化銨水溶液至反應瓶終止反應，直到溶液顏色由灰黑色轉為白色混濁溶液。接著使用迴旋濃縮機將四氫呋喃抽乾，剩餘水層以二氯甲烷 100 毫升萃取，前後共萃取 3 次，有機層以無水硫酸鎂除水，過濾後將濾液利用迴旋濃縮機抽乾並使用管住層析法純化產物，沖提液為乙酸乙酯跟己烷的混合液(1:1)，可以得到無色油狀產物 (2S,4R)-Ethyl-4-hydroxy-2-(hydorxy-diphenylmethyl)pyrrolidine1-carboxylate 2.344 克，產率為 46%。1HNMR (400 MHz, CDCl3)：δ 7.42-7.24 30.

(44) (m, 10H)，5.11-5.07 (dd, 1H)，4.08-3.91 (m, 3H)，3.56-3.53 (d, 1H)，3.03-3.02 (m, 1H)，2.18-2.13 (m, 1H)，2.08-2.04 (m, 1H)，1.44-1.43 (m, 1H)，1.17-1.14(t, 3H) ppm，詳細 NMR 光譜圖於附錄。. 5. (2S,4R)-4-Hydroxy-2-(hydroxydiphenylmethyl)pyrrolidine. 秤取 (2S,4R)-Ethyl-4-hydroxy-2-(hydorxydiphenylmethyl)pyrrolidine-1carboxylate 2.300 克(6.74 毫莫耳)及氫氧化鉀 12.479 克(222.42 毫莫耳)置於 500 毫升圓底瓶中，倒入乙醇 250 毫升，加熱迴流兩天。反應完畢後以迴旋濃縮機將溶液抽乾，加入二次蒸餾水將產物溶解，以濃鹽酸調整水溶液 pH 值到中性。再以二氯甲烷 300 毫升萃取，前後共萃取 3 次，有機層以無水硫酸鎂除水，過濾後將濾液利用迴旋濃縮機抽乾後可以得到淡黃色油狀物(2S,4R)-4-Hydroxy-2-(hydroxydiphenylmethyl)- pyrrolidine 1.792 克，產率為 98%。1HNMR (400 MHz, CDCl3)：δ 7.60-7.47 (m, 4H)，7.38-7.15 (m, 6H)，4.66-4.60 (m, 1H)，4.37-4.35 (m, 1H)，3.18-3.15 (m, 1H)，3.02-2.96 (m, 1H)，1.91-1.44 (m, 3H) ppm，詳細 NMR 光譜圖於附錄。. 31.

(45) 6. 2,6-Bis(((2S,4R)-4-hydorxy-2-(diphenylhydroxymethyl)-1pyrrolidiny)methyl)pyridine (H2BDPPOH). 秤取(2S,4R)-4-Hydroxy-2-(hydroxydiphenylmethyl)pyrrolidine 0.772 克(2.86 毫莫耳)、2,6-bis(bromomethyl)pyridine 0.376 克(1.43 毫莫耳)與碳酸鉀 0.395 克(2.86 毫莫耳)至 250 毫升圓底瓶中，加入 150 毫升乙醇後迴流三天。反應完畢後以迴旋濃縮機將溶液抽乾，加入二次蒸餾水 150 毫升，並以二氯甲烷 200 毫升萃取，前後共萃取 3 次。有機層以無水硫酸鎂除水，過濾後濾液使用迴旋濃縮機抽乾後可以可到白色固體的混合物。以少量的二氯甲烷將混合物溶解，並加入大量正己烷使固體析出沉澱，將上層澄清溶液移除後，再加入正己烷，反覆清洗三次，最後抽乾可以得到白色固體產物 H2BDPPOH 0.659 克，產率為 72%。1HNMR (400 MHz, CDCl3)：δ 7.63-7.61 (d, 4H)，7.55-7.53(d, 4H)，7.47-7.45(t, 1H)，7.27-7.22(m, 6H)，7.17-7.14(m, 4H)，6.51-6.50(d, 2H)，5.72-5.71 (d, 2H)，4.82 (s, 2H)，4.52-4.48 (dd, 2H)， 4.25-4.24(s, 2H)，3.60-3.47 (dd, 4H, PyCH2)，3.34-3.31(dd, 2H)，3.18-3.15(d, 2H)，1.96-1.91(m, 2H)，1.87-1.80(m, 2H) ppm。13CNMR (400 MHz, CDCl3)： δ 158.08，148.07，145.47，137.57，128.17，128.02，126.43，126.39，125.63， 32.

(46) 125.31，71.83，69.25，66.60，62.65，59.25，39.25 ppm，詳細 NMR 光譜圖於附錄。Anal. Calcd for C41H43N3O4：C,76.73；H, 6.75；N, 6.55. Found： C,76.262；H, 6.964；N, 6.851。. 五、錯合物 [NiII(BMPOHP)](ClO4)2 (1)的合成取一個 50 毫升梨形反應瓶，秤取 BMPOHP 0.0786 克(0.2 毫莫耳)後將其抽真空再回填氮氣，重複此動作三次，接著將其回填氮氣之後加入除水乙腈約 10 毫升溶解。另外在手套箱中秤取[Ni(CH3CN)6](ClO4)2 0.1008 克 (0.2 毫莫耳 ) 在樣品瓶中，加入約 10 毫升的乙腈溶解，再將 [Ni(CH3CN)6](ClO4)2 溶液導入反應瓶內，反應兩小時。反應結束後以真空系統抽乾得到紫色固體。加入乙腈約 5 毫升回溶後，之後以大量的乙醚使紫色固體析出，靜置後將上層溶液導出，再用乙醚清洗固體三次之後，使用真空系統抽乾，再加入約 2 毫升乙腈溶解固體，濾液即可佐以乙醚在室溫下以緩慢擴散法養晶，可以得到紫色片狀晶體 0.503 公克，產率為 60%。 Anal. Calcd for C19H33Cl2N3NiO17： C, 32.37； H, 4.72； N, 5.96. Found： C, 32.92.； H, 4.30； N, 6.10。. 六、錯合物 [NiII(BMPOTMSP)](ClO4)2 (2)的合成取一個 50 毫升梨形反應瓶，秤取 BMPOTMSP 0.167 克(0.2 毫莫耳)後將其抽真空再回填氮氣，重複此動作三次，接著將其回填氮氣之後加入除水 33.

(47) 乙腈約 10 毫升溶解。另外在手套箱中秤取[Ni(CH3CN)6](ClO4)2 0.397 克 (0.8 毫莫耳 ) 在樣品瓶中，加入約 10 毫升的乙腈溶解，再將 [Ni(CH3CN)6](ClO4)2 溶液導入反應瓶內，反應兩小時。反應結束後以真空系統抽乾得到紫色固體。加入乙腈約 5 毫升回溶後，之後以大量的乙醚使紫色固體析出，靜置後將上層溶液導出，再用乙醚清洗固體三次之後，使用真空系統抽乾，再加入約 2 毫升乙腈溶解固體，濾液即可佐以乙醚在室溫下以緩慢擴散法養晶，可以得到紫色片狀晶體 0.503 公克，產率為 54%。 Anal. Calcd for C31H52Cl3N6NaNiO18Si2： C, 35.77； H, 5.03； N, 8.07. Found： C, 35.77； H, 4.66； N, 8.03。. 七、錯合物 [NiII(BMPOTPSP)](ClO4)2 (3)的合成取一個 50 毫升梨形反應瓶，秤取 BMPOHP 0.242 克(0.2 毫莫耳)後將其抽真空再回填氮氣，重複此動作三次，接著將其回填氮氣之後加入除水乙腈約 10 毫升溶解。另外在手套箱中秤取[Ni(CH3CN)6](ClO4)2 0.397 克(0.8 毫莫耳)在樣品瓶中，加入約 10 毫升的乙腈溶解，再將[Ni(CH3CN)6](ClO4)2 溶液導入反應瓶內，反應兩小時。反應結束後以真空系統抽乾得到紫色固體。加入乙腈約 5 毫升回溶，之後以大量的乙醚使紫色固體析出，靜置後將上層溶液導出，再用乙醚清洗固體三次，使用真空系統抽乾，再加入約 2 毫升乙腈溶解固體，濾液即可佐以乙醚在室溫下以緩慢擴散法養晶，可. 34.

(48) 以得到紫色片狀晶體 0.503 公克，產率為 50% 。 Anal. Calcd for C55H55Cl2N3NiO14Si2： C, 56.57； H, 4.75； N, 3.60. Found： C, 56.08； H, 4.93； N, 3.45。. 八、錯合物 [NiII(BDPPOH)] (4)的合成取一個 50 毫升梨形反應瓶，秤取 H2BPDDOH 0.506 克(0.8 毫莫耳)後將其抽真空再回填氮氣，重複此動作三次之後送入手套箱，接著將其回填氮氣之後加入除水四氫呋喃約 10 毫升溶解。在手套箱中秤取 NaH 0.042 克 (1.74 毫莫耳)後加入反應溶液中，於室溫下反應一小時後使用真空系統抽乾溶液。在手套箱中秤取[Ni(CH3CN)6](ClO4)2 0.397 克(0.8 毫莫耳)後加入反應瓶中，將混合物以約 15 毫升除水乙腈溶解後，反應溶液從藍色轉為綠色。反應 2 小時後以真空系統抽乾得到綠色固體。加入二氯甲烷約 5 毫升回溶後，使用 celite 過濾，濾液使用真空抽乾，再加入約 2 毫升四氫呋喃及數滴二氯甲烷溶解固體，即可做為母液佐以戊烷在室溫下以緩慢擴散法養晶，可以得到綠色片狀晶體 0.503 公克，產率為 76%。Anal. Calcd for C45H51N3NiO6： C, 68.54； H, 6.52； N, 5.33. Found： C, 69.009； H, 6.755； N, 5.566。. 35.

(49) 九、錯合物 [NiIII(BDPPOH)]PF6 (5)的合成取一個 50 毫升梨形反應瓶，於手套箱秤取[NiII(BDPPOH)] 0.506 克(0.8 毫莫耳)與 ferrocenium hexafluorophoshate 0.066 公克(0.2 毫莫耳後加入乙腈約 20 毫升溶解。於冰浴下反應一小時。反應結束後，使用真空系統抽乾溶液，得到深棕色固體，加入約 2 毫升的乙腈溶解固體，以大量的乙醚使深棕色固體析出，靜置後將上層溶液導出，再用乙醚清洗固體三次，以真空系統抽乾得到深棕色產物，產率 80% 。 Anal. Calcd for C43H50F6N4NiO7P： C, 55.03； H, 5.37； N, 5.97. Found： C, 55.12； H, 5.66； N, 6.10。. 36.

(50) 第三節三價鎳擬態錯合物之反應一、[NiIII(BDPPOH)]PF6 (5)與 KO2 之反應(用於 GC 偵測) 秤取[NiIII(BDPPOH)]PF6 (5) 0.0469 克(0.05 毫莫耳)於一樣品瓶中，將其抽真空後灌入氮氣，重複三次，灌入氮氣後加入 1.5 毫升除水乙腈溶解。再秤取 KO2 0.074 克(1.0 毫莫耳)於另一樣品瓶，並抽真空後灌入氮氣，重複三次，在負壓的情況下以針筒抽取 17 毫升的氮氣注入樣品瓶中，之後加入 1.5 毫升的除水乙腈，再將 1.5 毫升的錯合物(5)溶液注入樣品瓶中，此時溶液顏色由深棕色轉變為淡綠色。以 GC 偵測並得知產生的氧氣的體積。. 二、[NiIII(BDPPOH)]PF6 (5)與 KO2 之反應(用於 UV/vis 偵測) 秤取[NiIII(BDPPOH)]PF6 (5) 0.0047 克(0.005 毫莫耳) 於一 25ml 秤量瓶中，加入乙腈溶解配置成 2╳10-4M 溶液。再秤取 KO2 0.022 克(0.03 毫莫耳) 於 UV cell，並抽真空後灌入氮氣，重複三次，在通入氮氣情況下以針筒抽取(5)的乙腈溶液注入 UV cell 中，間隔一分鐘測量一次溶液的 UV 變化。. 37.

(51) 第三章. 結果與討論. 本實驗室江建緯學長所合成之 NiSOD 擬態化合物的研究，設計及合成立體阻障大之含氮氧五牙配位基 H2BDPP，配位於鎳離子後得到一系列的 NiN3O2 錯合物。這些錯合物與 KO2 反應後，能夠使 O2—還原成 H2O2，亦氧化成 O2 釋出，同時錯合物可以在 NiII 和 NiIII 之間做轉換，成功地利用此含氮氧五牙配位基鎳錯合物來當作 NiSOD 的功能性擬態化合物，推測其反應機構如 Scheme 1-6 所示。本研究則以 H2BDPP 為基礎，利用 trans-4-hydroxy-L-proline 為起始物，設計一系列 C2 對稱且含有酯類官能基的 BMPORP 配位基。另外亦修飾合成 H2BDPP 上吡咯 4 號位置為羥基的 H2BDPPOH，當配位基配位至鎳離子中心後形成 NiIIN3O2 平面四角錐的錯合物，即可利用循環伏安法測量其氧化還原電位，並藉以評估適當的氧化劑，再將之氧化成具氧化態 NiSOD 結構性之三價鎳擬態化合物，再進行後續研究。. 38.

(52) 第一節配位基的合成與探討一、 BMPORP 系列之配位基 BMPORP 系列之配位基是以 trans-4-hydroxy-L-proline 為起始物，先與 thionyl chloride 於甲醇中將羧基進行酯化反應成甲酯，之後與 2,6-bis(bromomethyl)pyridine 進行取代反應即可得到配位基 BMPOHP 。將 BMPOHP 分別加入 chlorotrimethylsilane 和 chlorotriphenylsilane 修飾配位基中吡咯 4 號位置的羥基，可分別得到配位基 BMPOTMSP 與 BMPOTPSP， (Scheme 3-1)。. Scheme 3-1 BMPORP 系列配位基的合成步驟. 39.

(53) 二、配位基 H2BDPPOH 配位基 H2BDPPOH 的合成方式是參考江建緯學長所開發之 H2BDPP 的合成方式進行修飾，如 Scheme 3-3 所示。由於吡咯上含有羥基，過程中若在鹼性條件下進行反應會將產物去質子化，使其對有機溶劑的溶解度較差，而造成分離純化的困難度，所以在進行分離純化前，要先將粗產物的溶液中和成中性的環境。. Scheme 3-2 BDPPOH 的合成步驟. 40.

(54) 第二節鎳金屬錯合物的合成與探討一、二價鎳錯合物之 X-ray 結構解析 1、 [Ni(BMPOHP)](ClO4)2 (1) 二價鎳錯合物[Ni(BMPOHP)](ClO4)2 (1)的合成是由 1 當量的起始物 [Ni(CH3CN)6](ClO4)2 與 1 當量的 BMPOHP，在除水乙腈下反應 2 小時，溶液顏色由寶藍色轉為紫色。將乙腈溶液抽乾，利用真空系統將反應溶液濃縮後，緩緩加入大量的除水乙醚使紫色固體沉澱。將溶液靜置後，將上層澄清溶液導出，再重複用乙醚清洗紫色固體，直至上層溶液透明無色。利用真空系統將紫色固體抽乾後，加入適當乙腈將固體溶解，並使用乙腈/乙醚溶劑組合，利用緩慢擴散法於室溫下進行結晶，隔天可以得到紫色塊狀晶體。經 X-ray 結構解析後得其結構圖如 Fig. 3-1 所示。錯合物 1 的重要鍵長鍵角列在 Table 3-1。. Fig. 3-1 [Ni(BMPOHP)](ClO4)2 (1)的 X-ray 結構解析圖. 41.

(55) 錯合物 1 的晶體呈紫色，屬於單斜晶系(Monoclinic)，空間群為 P21，晶格常數 a = 9.2277(14) Å ，b = 13.810(2) Å ，c = 12.0015(18) Å ，= 90°， = 110.700(2)°， = 90°。每單位晶格內含有一個錯合物 1(Z = 1)，R1 = 0.0561， wR2 = 0.1394，其他相關數據請參見附錄。. Table 3-1 [Ni(BMPOHP)](ClO4)2 (1)的重要鍵長與鍵角數據 Bond lengths [Å ] N(1)-Ni(1). 2.175(5). N(4)-Ni(1). 2.024(5). N(2)-Ni(1) N(3)-Ni(1). 1.974(5) 2.136(5). O(3)-Ni(1) O(6)-Ni(1). 2.091(4) 2.108(4). Bond angles [°] N(2)-Ni(1)-N(4) N(2)-Ni(1)-O(3) N(4)-Ni(1)-O(3) N(2)-Ni(1)-O(6). 176.3(2) 86.67(18) 90.64(19) 92.48(17). O(3)-Ni(1)-N(3) O(6)-Ni(1)-N(3) N(2)-Ni(1)-N(1) N(4)-Ni(1)-N(1). 92.84(18) 81.69(17) 79.1(2) 98.1(2). N(4)-Ni(1)-O(6) O(3)-Ni(1)-O(6) N(2)-Ni(1)-N(3) N(4)-Ni(1)-N(3). 90.44(18) 174.53(19) 80.2(2) 102.4(2). O(3)-Ni(1)-N(1) O(6)-Ni(1)-N(1) N(3)-Ni(1)-N(1). 83.60(18) 101.56(17) 159.21(18). 2、 [Ni(BMPOTMSP)](ClO4)2 (2) 二價鎳錯合物[Ni(BMPOTMSP)](ClO4)2 (2)的合成是由 1 當量的起始物 [Ni(CH3CN)6](ClO4)2 與 1 當量的 BMPOTMSP，在除水乙腈下反應 2 小時，溶液顏色由寶藍色轉為紫色。將乙腈溶液抽乾，利用真空系統將反應溶液濃縮後，緩緩加入大量的除水乙醚使紫色固體沉澱。將溶液靜置後，將上層澄清溶液導出，再重複用乙醚清洗紫色固體，直至上層溶液透明 42.

(56) 無色。利用真空系統將紫色固體抽乾後，加入適當乙腈將固體溶解，並使用乙腈/乙醚溶劑組合，利用緩慢擴散法於室溫下進行結晶，隔天可以得到紫色塊狀晶體。經 X-ray 結構解析後得其結構圖如 Fig. 3-2 所示。錯合物 2 的重要鍵長鍵角列在 Table 3-2。. Fig. 3-2 [Ni(BMPOTMSP)](ClO4)2 (2)的 X-ray 結構解析圖. 錯合物 2 的晶體呈紫色，屬於單斜晶系(Monoclinic)，空間群為 P21，晶格常數 a = 11.2820(7) Å ，b = 14.5056(9) Å ，c = 11.8195(8) Å ，= 90°， = 99.9830(10)°， = 90°。每單位晶格內含有一個錯合物 2(Z = 2)，R1 = 0.0404， wR2 = 0.1054，其他相關數據請參見附錄。. 43.

(57) Table 3-2 [Ni(BMPOTMSP)](ClO4)2 (2)的重要鍵長與鍵角數據 Bond lengths [Å ] N(1)-Ni(1) N(2)-Ni(1) N(3)-Ni(1). 2.148(3) 1.981(3) 2.151(3). N(4)-Ni(1) O(3)-Ni(1) O(6)-Ni(1). 2.045(3) 2.068(2) 2.077(2). Bond angles [°] N(2)-Ni(1)-N(4). 177.89(14). O(3)-Ni(1)-N(1). 82.94(10). N(2)-Ni(1)-O(3) N(4)-Ni(1)-O(3) N(2)-Ni(1)-O(6) N(4)-Ni(1)-O(6) O(3)-Ni(1)-O(6) N(2)-Ni(1)-N(1) N(4)-Ni(1)-N(1). 92.28(11) 85.95(11) 88.26(11) 93.55(11) 177.93(10) 80.30(12) 100.59(12). O(6)-Ni(1)-N(1) N(2)-Ni(1)-N(3) N(4)-Ni(1)-N(3) O(3)-Ni(1)-N(3) O(6)-Ni(1)-N(3) N(1)-Ni(1)-N(3). 95.19(10) 80.29(11) 98.84(12) 98.73(10) 83.33(10) 160.57(11). 3、 [Ni(BMPOTPSP)](ClO4)2 (3) 二價鎳錯合物[Ni(BMPOTPSP)](ClO4)2 (3)的合成是由 1 當量的起始物 [Ni(CH3CN)6](ClO4)2 與 1 當量的 BMPOTPSP，在除水乙腈下反應 2 小時，溶液顏色由寶藍色轉為紫色。將乙腈溶液抽乾，利用真空系統將反應溶液濃縮後，緩緩加入大量的除水乙醚使紫色固體沉澱。將溶液靜置後，將上層澄清溶液導出，再重複用乙醚清洗紫色固體，直至上層溶液透明無色。利用真空系統將紫色固體抽乾後，加入適當乙腈將固體溶解，並使用乙腈/乙醚溶劑組合，利用緩慢擴散法於室溫下進行結晶，隔天可以得到紫色塊狀晶體。經 X-ray 結構解析後得其結構圖如 Fig. 3-3 所示。 44.

(58) 錯合物 3 的重要鍵長鍵角列在 Table 3-3。. Fig. 3-3 [NiII(BMPOTPSP)](ClO4)2 (3)的 X-ray 結構解析圖. 錯合物 3 的晶體呈紫色，屬於三斜晶系(Triclinic)，空間群為 P1，晶格常數 a = 8.801(3) Å ，b = 9.605(4) Å ，c = 39.729(16) Å ，= 87.382(8)°， = 86.957(4)°， = 89.714(4)°。每單位晶格內含有一個錯合物 3(Z = 1)， R1 = 0.0944，wR2 = 0.2240，其他相關數據請參見附錄。. 45.

(59) Table 3-3 [Ni(BMPOTPSP)](ClO4)2 (3)的重要鍵長與鍵角數據 Bond lengths [Å ] N(1)-Ni(1) N(2)-Ni(1) N(3)-Ni(1). 2.125(7) 1.955(6) 2.139(7). N(4)-Ni(1) O(3)-Ni(1) O(6)-Ni(1). 2.044(6) 2.066(6) 2.066(6). Bond angles [°] N(2)-Ni(1)-N(4). 179.7(4). O(3)-Ni(1)-N(1). 82.2(2). N(2)-Ni(1)-O(3) N(4)-Ni(1)-O(3) N(2)-Ni(1)-O(6) N(4)-Ni(1)-O(6) O(3)-Ni(1)-O(6) N(2)-Ni(1)-N(1) N(4)-Ni(1)-N(1). 91.3(2) 88.5(2) 89.4(2) 90.8(3) 178.8(3) 79.8(3) 100.4(3). O(6)-Ni(1)-N(1) N(2)-Ni(1)-N(3) N(4)-Ni(1)-N(3) O(3)-Ni(1)-N(3) O(6)-Ni(1)-N(3) N(1)-Ni(1)-N(3). 97.0(3) 80.0(3) 99.8(3) 97.8(2) 83.3(3) 159.8(2). 4、Ni(BDPPOH) (4) 二價鎳錯合物 Ni(BDPPOH) (4)的合成是由 1 當量的五牙配位基 H2BDPPOH 與 2.1 當量的 NaH，在除水乙腈下反應 1 小時，再加入 1 當量的[Ni(CH3CN)6](ClO4)2 並反應 2 小時，溶液顏色由寶藍色轉為綠色。將乙腈溶液抽乾，以適量的除水二氯甲烷回溶，將溶液用 celite 過濾之後將濾液抽乾可以得到綠色固體。使用四氫呋喃和二氯甲烷混合液 /戊烷為溶劑組合，利用室溫擴散法養晶，隔天可以得到紫色塊狀晶體，經 X-ray 結構解析後得其結構圖如 Fig. 3-3 所示。錯合物 4 的重要鍵長鍵角列在 Table 3-4。 46.

(60) Fig. 3-4 Ni(BDPPOH) (4)的 X-ray 結構解析圖. 錯合物 4 的晶體呈紫色，屬於單斜晶系(Monoclinic)，空間群為 P21，晶格常數 a = 9.3463(7) Å，b = 20.6584(19) Å，c = 10.9541(9) Å，= 90°， = 95.891(5)°， = 90°。每單位晶格內含有一個分子(Z = 2)，R1 = 0.0450，wR2 = 0.1151，其他相關數據請參見附錄。. Table 3-4 [Ni(BDPPOH)] (4)的重要鍵長與鍵角數據 Bond lengths [Å ] N(1)-Ni(1) N(2)-Ni(1) N(3)-Ni(1). 2.167(3) 1.975(2) 2.157(3). O(3)-Ni(1) O(4)-Ni(1). 1.943(2) 1.920(2). Bond angles [°] O(4)-Ni(1)-O(3). 136.55(10). N(2)-Ni(1)-N(3). 81.38(14). O(4)-Ni(1)-N(2) O(3)-Ni(1)-N(2) O(4)-Ni(1)-N(3) O(3)-Ni(1)-N(3). 120.41(11) 102.80(10) 105.23(11) 84.22(11). O(4)-Ni(1)-N(1) O(3)-Ni(1)-N(1) N(2)-Ni(1)-N(1) N(3)-Ni(1)-N(1). 85.18(11) 97.71(11) 81.53(14) 162.80(10). 47.

(61) 錯合物 1 ~ 4 的鍵長中可以看出，，鎳離子跟軸位上氮的鍵長比鎳離子跟赤道位上吡啶上氮的鍵長短，可知配位基上吡啶的氮與鎳離子的鍵結較強，是由於金屬鎳離子會與軸位吡啶有 π backdonation 的作用增加鎳氮之間的鍵結。此外，將 NiBMPORP 系列錯合物 1 ~ 3 和 NiBDPPOH (4) 赤道面的氮與鎳之鍵長做比較，可以看出錯合物 1 ~ 3 的鎳氮鍵長較長 (2.0 Å )，而錯合物 4 的鎳氮鍵長較短為(1.9 Å )，造成這種差異是因為錯合物 1 ~ 3 的配位基為中性與鎳離子配位形成六配位的錯合物，其氮和氧原子與鎳離子間的作用力較小，所以鍵長較長。錯合物 4 則是利用去質子化後的配位基跟鎳離子配位，氧與鎳離子之間的作用力較強，造成鍵長較短。. Table 3-5 錯合物 1、2、3、4 的重要鍵長數據鍵長 [Å ] avg. Namine-Ni Npy-Ni avg. O-Ni. 1 2.156(5) 1.974(5) 2.010(4). 2 2.150(3) 1.981(3) 2.072(2). 3 2.132(7) 1.955(6) 2.066(6). 4 2.162(3) 1.975(2) 1.922(2). 將錯合物 4 與本實驗室江建緯學長所合成的擬態化合物 Ni(BDPP) 比較，錯合物 4 的 τ = 0.44，而 Ni(BDPP)的 τ = 0.39，錯合物 4 為較扭曲的平面四角錐結構。由於錯合物 4 的鎳離子與軸位吡啶上的氮的鍵長較 Ni(BDPP)長，估推測在形成三價鎳錯合物時，軸位的氮原子對於穩定三. 48.

(62) 價鎳離子的效果較差。. Table 3-6 錯合物 4 與 Ni(BDPP)的重要鍵長數據鍵長 [Å ]. 4. Ni(BDPP). avg. Namine-Ni Npy-Ni avg. O-Ni. 2.162(3) 1.975(2) 1.922(2). 2.149(2) 1.969(2) 1.935(2). 二、錯合物氧化還原電位之比較錯合物 Ni(BMPOHP)](ClO4)2 (1)在乙腈下進行循環伏安法測量，掃描速率為 100 mVs-1，CV 圖中顯示一組不可逆(irreversible)的氧化還原峰，. Current (μA). 其電位為 E = -1.019 V vs Ag/Ag+(Fig. 3-5)。. Potential (V vs Ag/Ag+). Fig. 3-5 [Ni(BMPOHP)](ClO4)2 (1)的 CV 圖. 錯合物[Ni(BMPOTMSP)](ClO4)2 (2)在乙腈下進行循環伏安法測量，掃描速率為 100 mVs-1，CV 圖中顯示一組不可逆(irreversible)的氧化還原 49.

(63) Current (μA). 峰，其電位為 E = -1.047 V vs Ag/Ag+(Fig. 3-6)。. Potential (V vs Ag/Ag+). Fig. 3-6 [Ni(BMPOTMSP)](ClO4)2 (2)的 CV 圖. 錯合物[Ni(BMPOTPSP)](ClO4)2 (3)在乙腈下進行循環伏安法測量，掃描速率為 100 mVs-1，CV 圖中顯示一組不可逆(irreversible)的氧化還原. Current (μA). 峰，其電位為 E = -1.090 V vs Ag/Ag+(F 收 3-7)。. Potential (V vs Ag/Ag+). Fig. 3-7 [Ni(BMPOTPSP)](ClO4)2 (3)的 CV 圖 50.

(64) 錯合物 Ni(BDPPOH) (4)在乙腈下進行循環伏安法測量，掃描速率為 100 mVs-1，CV 圖中顯示一組可逆(reversible)的氧化還原峰，其半電位為. Current (μA). E1/2 = 0.520 V vs Ag/Ag+ (NiII/NiIII)，E = 0.103 V，ipa/ipc = 0.726(Fig. 3-8)。. Potential (V vs Ag/Ag+). Fig. 3-8 Ni(BDPPOH) (4)的 CV 圖. 由電化學的結果得知，NiBMPORP 系列的錯合物 1 ~ 3 並沒有可逆的氧化還原峰，但是錯合物 4 有一可逆的氧化還原峰，這樣的差異是因為配位基配位的能力不同所造成。若二價鎳要進行氧化反應失去一個電子形成三價鎳錯合物時，鎳離子處於較缺電子的情況，而 NiBMPORP 系列的錯合物 1 ~ 3 是利用酯類官能基上氧原子的孤對電子對與鎳離子配位，酯類上氧原子提供電子能力較弱，無法提供足夠的電子穩定缺電子的三價鎳離子，因此無法形成三價鎳的錯合物，所以在電化學中偵測不到可逆的氧化還原峰。而錯合物 4 是利用去質子化後帶負電的烷氧跟與 51.

(65) 鎳離子配位，相較於用酯類官能基的氧原子能夠提供較多的電子去穩定中心金屬離子，將有機會形成鎳三價的錯合物，所以有可逆的氧化還原訊號。. Table 3-7 錯合物 4 與酵素及其他擬態化合物的半電位比較 Sample. E1/2 (mV vs Ag/AgCl). Ref.. WT-NiSOD. 93. 24. Y9F-NiSOD D3A-NiSOD. 97 108. 24 24. Ni(BDPP). 308 in CH2Cl2 520 in CH3CN 520 705 720. 23 This work 21 21 20. OH. Ni(BDPP ) (4) [NiII(SODM2)] [NiII(SODM1)] NiII-NCC. 將錯合物 4 與本實驗室江建緯學長所合成的擬態化合物 Ni(BDPP) 比較，錯合物 4 在 CH3CN 下測得的半電位為 520 mV，數值較 Ni(BDPP) 的 308 mV 為正，表示錯合物 4 比 Ni(BDPP)不易氧化成三價鎳錯合物，這個結果與結構上軸位吡啶與鎳離子的距離比較的結果一致。另一方面，錯合物 4 的半電位坐落在酵素與文獻上具 SOD 活性的擬態化合物之間，意味著其將會達到三價的氧化態，顯示錯合物 4 有機會如 SOD 進行對超氧化物的反應。. 52.

(66) 三、三價鎳錯合物[Ni(BDPPOH)]PF6 (5)合成與探討由電化學的結果得知，錯合物 4 有可逆的氧化還原訊號，有機會氧化成 NiIII 的氧化態，由二茂鐵(ferrocene，Fc)的氧化還原電位(E1/2 = 0.598 V)與錯合物 4 的電位比較，可知利用 Ferrocenium 就可將錯合物 4 氧化為三價鎳的錯合物。故利用紫外/可見光光譜、電化學及 EPR 證實錯合物 4 加入[CP2Fe]PF6 可氧化成三價鎳錯合物[Ni(BDPPOH)]PF6 (5)，並藉 DFT 理論計算方法了解其可能的結構與分子軌域分布。. 1、紫外/可見光光譜分析將錯合物 4 在乙腈下加入[CP2Fe]PF6 反應，並利用紫外/可見光吸收光譜測定，有 380 及 480 nm 的吸收峰產生(Fig. 3-8)。進行錯合物 4 與不同當量[CP2Fe]PF6 的滴定實驗時，可見原本的特徵吸收峰 344 nm 會因 [CP2Fe]PF6 當量數的增加逐漸轉為 380 及 480 nm 的特徵吸收峰，且在加入 1 當量的[CP2Fe]PF6 時，吸收度達到最大值，由此現象可知錯合物 4 與[CP2Fe]PF6 進行反應得到的產物，是由 1 當量的電子由錯合物 4 轉移到[CP2Fe]+的過程，所以可以推斷 380 及 480 nm 吸收為三價鎳錯合物 5 的特徵吸收峰。. 53.

(67) Fig. 3-9 錯合物 4 與[CP2Fe]PF6 進行反應的 UV/vis 吸收光譜圖 (內圖為 380 nm 在加入不同當量[CP2Fe]PF6 的吸收度變化). 2、氧化還原電位之探討將[Ni(BDPPOH)]PF6 (5)在乙腈下進行循環伏安法的測量，掃描速率為 100 mVs-1，CV 圖中顯示為一組可逆(reversible)的氧化還原峰，其半電位. Current (μA). 為 E1/2 = 0.103 V vs Ag/Ag+ (NiII/NiIII)，E = 0.078 V，ipa/ipc = 0.811。. Potential (V vs. Ag/Ag+). Fig. 3-10 [Ni(BDPPOH)]PF6 (5)的 CV 圖. 錯合物 5 同樣也有一組可逆的氧化還原訊號，與錯合物 4 對照，此訊號亦為 NiII/NiIII 轉換的訊號，可以藉此推斷錯合物 5 為 NiIII 的錯合物。 54.

(68) 錯合物 5 的氧化還原電位與錯合物 4 的不同，是由於錯合物 5 帶有 PF6− 陰離子，在測量過程中會產生 AgPF6 鹽類，使得氧化還原電位偏移。. 3、電子順磁共振光譜(EPR) 由於三價鎳為 d7 電子組態，具有一個未成對的電子，因此三價鎳錯合物在電子順磁共振光譜中可以偵測到 EPR 訊號。影響錯合物電子順磁共振光譜形狀的因素有：(a)電子組態的性質，(b)金屬離子周圍有效配位基場 (ligand field) 的對稱性， (c) 晶格中個別金屬離子之發色團 (chromophore)區域分子軸在單位晶格中之方位關係。其中以金屬離子周圍有效配位基場的對稱性影響最為重要，依照對稱性的不同，會有 isotropic (gx = gy = gz)、axial (gx = gy ≠ gz)和 rombic (gx ≠ gy≠ gz)三種光譜表現。. 55.

(69) Exp.. Sim.. g factor OH. Fig. 3-11 [Ni(BDPP )]PF6 (5)的 EPR 圖譜及模擬的圖譜. 錯合物 5 的 EPR 光譜是以測定玻璃態電子順磁共振光譜(glass EPR)進行，選用二氯甲烷為溶劑，將溶液冷凍到 77 K 形成玻璃態進行測量(Fig. 3-11)。經由 easyspin 模擬後的圖譜得知 g1 = 2.165, g2 = 2.127, g3 = 1.990, Azz = 30.0 G，以及在 g = 2.06 G 的位置有個自由基的訊號，訊號強度為 0.14%。在 g3 = 1.990 的位置有 triplet 分裂的超精細結構(super-hyperfine coupling)，是由於鎳離子上未成對電子與軸位吡啶上的氮之間有偶合現象(Coupling)，又氮核的 I 值為 1，所以分裂成 3 支(2I + 1 = 3)超精細結構。. 56.

(70) 4、理論計算之探討經由 DFT 理論計算對錯合物 5 結構優化的結果，得到 τ = 0.09，幾何結構比錯合物 4 更接近平面四角椎的構形。錯合物 5 鎳離子的 d 軌域能階分佈如 Fig. 3-12 所示，三價鎳為 d7 電子組態，在強場的情況下，dyz、 dxz 和 dxy 軌域各佔有 2 個電子，未成對電子坐落在 dz2 上，而 LUMO 為 dx2-y2。. Fig. 3-12 [NiIII(BDPPOH)]PF6 (5)之鎳離子 d 軌域的能階分布圖. 從錯合物 5 的電子密度分布(Fig. 3-13)，可以看出未成對電子主要集中在中心金屬的 dz2 與軸位吡啶上氮的 Pz 軌域上，表現出軸位吡啶上的氮的確與中心金屬有很強的作用力，這也說明了在 EPR 上所觀察到的偶合現象，詳細的電子密度分布如 Table 3-8 所示。 57.

(71) Fig.3-13 [Ni(BDPPOH)]PF6 (5)的電子密度分布. Table 3-8 Ni(BDPPOH)]PF6 (5)的電子密度分布 Ni dz2 dx2-y2 dxz dyz dxy Npy. 0.708 0.221 0.005 -0.066 0.044 0.242. N1 N2 O1 O2. -0.004 0.002 -0.134 -0.104. 58.

(72) 第三節鎳金屬錯合物與超氧化物反應的探討還原態 NiSOD 所進行的反應是在有質子來源的條件下，將 O2—還原成 H2O2 並形成氧化態 NiSOD，NiII(BDPPOH) (4)的配位基上具有羥基有機會當作質子來源，又由電化學得知錯合物 4 可以氧化成穩定的正三價鎳錯合物，於是嘗試著使用錯合物 4 與 KO2 反應，很可惜地由 UV/vis 偵測反應進行發現兩者並沒有發生反應，而無法進行反應的原因推論為配位基上羥基的酸性不夠強，無法提供質子來進行反應。因此，將錯合物 4 氧化成三價鎳錯合物[Ni(BDPPOH)]PF6 (5)，再利用錯合物 5 與 KO2 反應，以模擬氧化態 NiSOD 的反應性。. 一、氧化態 NiSOD 之活性模擬將錯合物 5 與 KO2 反應，反應的溶液由原本錯合物 5 的紅棕色轉變為綠色，並且有氣泡產生，推測為氧氣生成。將反應後的綠色溶液過濾抽乾後，並以四氫呋喃溶解後，佐以戊烷在室溫下以緩慢擴散法養晶，可以得到綠色晶體，將此綠色晶體經由 X-ray 解析後，發現為氧化前的錯合物 4。另外也利用 UV/vis 吸收光譜進行錯合物 5 與 KO2 的反應，將錯合物 5 配置成 2 × 10-4 M 的乙腈溶液，在 330、380 以及 480 nm 有特徵吸收峰。當加入 KO2 與之進行反應後，原本的特徵吸收峰隨時間減弱，並在 59.

(73) 350 nm 有新的吸收峰生成，反應 18 分鐘後只剩下 350 nm 的吸收峰，此為錯合物 4 的特徵吸收峰。. Fig. 3-14 [Ni(BDPPOH)]PF6 (5)與 KO2 進行反應的 UV/vis 吸收光譜圖. 為了對反應過程中產生的氣體進行定性及定量的分析，利用林震煌老師所開發之哨式 GC 偵測儀進行反應氣體生成之量測(fig. 3-15)。將測量的結果利用理想氣體方程式推算，在有錯合物 5 會比空白試劑多產生 0.017 毫莫耳的氧氣，產率為 34%。. 60.

(74) Frequency (Hz) Frequency (Hz). Time (s). Time (s). Fig. 3-15 (a)空白試劑 (b)錯合物 5 與 KO2 進行反應的 GC 訊號圖 (內圖為氧氣量與頻率變化量的檢量線). 由此實驗得知，錯合物 5 與 KO2 反應後的確能還原生成錯合物 4 並將 O2—氧化成 O2，成功模擬氧化態 NiSOD 的反應。 61.

(75) 二、超氧化物歧化酶活性測試超氧化物歧化酶的活性測試是利用黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase， XO)在氧化黃嘌呤形成尿酸的過程中，會消耗氧氣形成過氧化氫以及超氧離子，所產生出來的超氧離子跟溶液中的顯色劑 2-(4-Iodophenyl)3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium (WST-1) 反應形成 formazan 並在紫外/可見光光譜 450 nm 的位置有吸收峰。若測試的藥劑具有氧化物歧化酶活性時，此藥劑會與 WST-1 競爭，消耗超氧離子而減少 formazan 的產生，當外加藥劑的濃度使 formazan 產生的量為空白試劑的一半時，此濃度即為半抑制濃度 (half maximal inhibitory concentration，IC50)。. Scheme 3-3 超氧化物歧化酶活性測試之反應過程. 然而經由超氧化物歧化酶活性測試的實驗發現錯合物 5 對超氧離子 62.

(76) 的半抑制濃度為 1.8 × 10-4 M，效果不如文獻中發表的胜肽鍵化合物 (Table 3-6)。錯合物 5 為三價鎳錯合物，跟 O2—反應後會被還原成錯合物 4，雖然直接將錯合物 4 加入 O2—不會進行反應，但是卻可測得錯合物 5 的半抑制濃度，故可知錯合物 5 仍有機會進行催化循環，幫助循環完成的原因可能是由於錯合物 5 吡咯上 4 號位置的羥基使其對水的溶解度變好，讓錯合物 5 在反應進行中將 O2—先氧化成 O2，並生成的錯合物 4，溶劑中的水成為質子的來源，配合所生成的錯合物 4 將 O2 — 還原成 H2O2，以完成催化循環。. Table 3-9 文獻上酵素及模擬化合物的半抑制濃度酵素. IC50 (M). Ref. Bovine erythrocyte. 4.0 × 10-8. 22. 蛋白質擬態化合物 NiII-NCC NiII(SODM1) NiII(SODM2) Ni(BDPPOH)PF6 (5). 4.1 2.1 1.1 1.8. × × × ×. 63. 10-5 10-7 10-6 10-4. 20 21 21 This work.