四、結果與討論 - 聚唑啉/線性聚乙烯亞胺雙團聯共聚物製備奈米基因載體之研究

4-1. 合成 PEOz-b-P(EOz-co-EI)雙團聯共聚物

陽離子開環聚合為一種活性聚合(living polymerization)反應，其特點為所得到的高分子分子量分佈較為均一，聚合度近似單體與起始劑的莫耳比。此外陽離子開環聚合常用來將cyclic imino ether 經由開環聚合成線性的 poly(N-acylalkylenimine) ，因此雜環分子 2-substituted-2-oxazoline 亦藉此方式得到 poly(N-acyl-ethylenimine)。

一般用於聚合2-substituted-2-oxazoline 之起始劑可分為兩種，單官能基起始劑如methyl iodide、MeOTs (methyl p-toluenesulfonate)等，在反應時會產生一個活性端(living end) ，即高分子末端的碳陽離子 (carbanium)，分子鏈的成長只在單一方向。於反應終止時，由於離子的活性不會消失，加入另一種單體反應仍會繼續進行，可得到雙團聯共聚物。此外也可用親核性化合物(nucleophile)作為終止劑，在高分子的末端導入官能基，與另一末端有官能基的高分子經由官能基之間的反應形成共價鍵來合成雙團聯共聚物，這種反應稱為 coupling reaction。而雙官能基起始劑像 bis(oxazolinium tosylate), 1,4-dibromo- 2-butene 等的分子則具有兩個活性端，因而高分子的兩末端能同時成長，被利用來合成三團聯共聚物(triblock copolymer)。

本研究在雙團聯共聚物的合成上採用coupling reaction的方式並透過雙硫鍵(disulfide bond)來連接兩高分子poly(2-ethyl-2-oxazoline) 及poly(2-ethyl-2-oxazoline-co-ethylenimine)。由於細胞內之glutathione 濃度為細胞外濃度的50~1000 倍，因此雙硫鍵在細胞內會被還原而斷裂，但其在胞外環境中則相當安定^48,49，不致影響到。一般coupling reaction常以官能基羧酸(carboxylic group)與胺基(amino group)的反應形成醯胺(amide)鍵，或羧酸與羥基(hydroxyl group)反應生成酯(ester) 鍵作為共價鍵結，但若使用此類的鍵結方式於本研究上，因 P(EOz-co-EI) 在分子主鏈上有二級胺，將導致 PEOz 不僅會與

P(EOz-co-EI)的末端產生鍵結，也會接在主鏈上，形成接枝共聚物 (graft copolymer)，並增加P(EOz-co-EI)與DNA之間的立體障礙，降低包覆DNA的效率。由於硫醇基(sulfhydryl group)之反應具專一性，僅會與碳雙鍵(double bond)、雙硫鍵等官能基反應，因此可利用在兩高分子末端分別導入硫醇基與雙硫鍵來合成雙團聯共聚物。

基於要得到雙團聯共聚物，所以選擇單官能基起始劑 MeOTs 對 2-ethyl-2-oxazoline 進行聚合，為了在高分子末端引入官能基，需在氮氣環境下進行聚合反應使高分子末端的碳陽離子能夠保持活性，並在反應終止時加入 KSAc(protassium thioacetate)導入硫醇基，使 PEOz 末端帶有thioacetate 的官能基。由於硫醇基在空氣中容易因氧化反應而產生偶合(dimerization)，而 thioacetate 可視為被乙醯基(acetyl)保護之硫醇基，因此thioacetate 常用於硫醇類化合物的製備。將 PEOz 於酸性或鹼性環境下進行水解可以得到線性聚乙烯亞胺，為使 thioacetate 在線性聚乙烯亞胺的合成中不被水解產生硫醇基進而造成高分子偶合，同時提供雙硫鍵以與硫醇基反應，因此 PEOz 先以含氨之甲醇溶液在氮氣下將保護基脫去，再與2,2'-dithiodipyridine 反應，

經由 disulfide exchange 把末端官能基由 thioacetate 轉換為 2-pyridyldithio，之後於鹽酸溶液中進行水解使側鏈丙醯基(propionyl group)斷裂成為線性聚乙烯亞胺，即 P(EOz-co-EI)。最後將 PEOz 以含氨之甲醇溶液使thioacetate 還原成硫醇基，與 P(EOz-co-EI)末端的 2-pyridyldithio 反應形成雙硫鍵之共價鍵結並得到 PEOz-b-P(EOz-co-EI)雙團聯共聚物。

4-1-1.¹H-NMR結構鑑定

本研究在官能基的鑑定上以另外合成之分子量約 600 的 PEOz 寡聚合物作為基準。

(1). PEOz-SAc 寡聚合物

將純化後末端帶有thioacetate官能基的PEOz寡聚合物溶於CDCl3

中，經¹H-NMR測定後結果如圖 4-1。從圖中可看出高分子PEOz有三個吸收峰，分別為：-N(COCH₂CH₃)-, δ=0.981 ppm；-N(COCH CH₂ ₃)-, δ=2.353 ppm；-N(COCH2CH3)CH CH2 2-, δ=3.422 ppm，而末端甲基則是在 2.995 ppm。由PEOz結構上三個吸收峰的積分面積可知，

thioacetate上甲基的氫與PEOz側鏈上亞甲基的氫位置重疊，另外也可看到thioacetate所造成主鏈末端位移至 2.915 ppm，顯示官能基確實鍵結在高分子上。

(2). PEOz-Py 寡聚合物

圖 4-2 為純化後末端帶有 2-pyridyldithio官能基的PEOz寡聚合物溶於CDCl3後經¹H-NMR測定的結果。從圖中可知PEOz結構上三個吸收峰的積分面積比例回復到結構中氫原子數之比例，而在 7.042 ppm、7.614 ppm、8.392 ppm三處出現pyridine環的吸收峰，代表 thioacetate與氨完全反應，生成硫醇基後與 2,2'-dithiodipyridine進行 disulfide exchange得到 2-pyridyldithio官能基，官能基之轉化率可由 pyridine環與高分子末端之甲基(a)積分面積比值求得，轉化率約 94%。

(3). P(EOz-co-EI) 寡聚合物

圖4-3 為純化後末端帶有 2-pyridyldithio官能基的P(EOz-co-EI)寡聚合物溶於CDCl3後經¹H-NMR測定的結果。PEOz經水解後在主鏈氮原子上的乙醯基會脫去，形成二級胺結構，所以在圖中可看到 ethylenimine(-NHCH2CH2-)在 2.766 ppm處有吸收峰產生，此外在

7.094 ppm、7.601 ppm、8.41 ppm三處有pyridine環的吸收峰。

(4). P(EOz-co-EI)

將所合成之高分子PEOz經部分水解得到之P(EOz-co-EI)在純化後溶於D2O測定¹H-NMR，如圖 4-4。從圖中除了可看到PEOz結構上的三個吸收峰，水解後產生的ethylenimine則是在 2.768 ppm處有吸 收，此外利用 N-propionyl ethylenimine (a) 與 ethylenimine (d) 及 N-propionyl ethylenimine側鏈上甲基(c)的積分面積比值可以計算水解

比例，水解比例計算方式為：

1 c/3

(a+d)/4 _

(5). diblock copolymer PEOz-b-P(EOz-co-EI)

圖 4-5 為雙團聯共聚物經純化後溶於D₂O所測定的¹H-NMR圖譜。從圖中可發現ethylenimine所佔的比例已減少，而經由計算反應物PEOz與P(EOz-co-EI)之ethylenimine與N-propionyl ethylenimine重複單元的比値與圖中 2.707 ppm及 3.413 ppm的積分面積比對照可證實為雙團聯共聚物。

圖4-1. PEOz-SAc寡聚合物之 H-NMR光譜圖 1

圖4-2. PEOz-Py寡聚合物之 H-NMR光譜圖 1

圖4-3. P(EOz-co-EI)寡聚合物之¹H-NMR光譜圖

圖4-4. 高分子P(EOz-co-EI)之 H-NMR光譜圖 1

圖 4-5. 雙團聯共聚物PEOz-b-P(EOz-co-EI)之¹H-NMR光譜圖

4-1-2. 元素分析結果

將高分子以元素分析儀測量所含之碳、氫、氮、硫重量百分比，

並與理論值做一比較，結果如表4-1 所示。從表中可看出理論值與分析結果十分接近，因此證實各高分子已成功的合成出來。

表 4-1. 各種高分子之元素分析結果與理論值之比較

polymer

^{C H N S}

理論值 60.39 9.13 14.00 0.32 PEOz-Sac

分析結果 60.42 9.08 14.01 0.36 理論值 60.35 9.08 14.05 0.64 PEOz-Py

分析結果 60.36 9.01 14.09 0.68 理論值 57.47 10.46 24.35 1.10 P(EOz-co-EI)

分析結果 57.54 10.48 24.31 1.03 理論值 58.56 10.01 20.38 0.68 PEOz-b-

P(EOz-co-EI) 分析結果 58.51 10.11 20.31 0.73

4-1-3. UV 光譜分析結果

由於 pyridyl 雜環在 UV 光譜下會有特定的吸收峰，所以可用來鑑定高分子上是否具有 pyridyl 官能基。將 PEOz-SAc 與 PEOz-Py 分別溶於甲醇溶液中，以 UV/Vis 測量其吸收値，結果如圖 4-6 所示。

由圖中可看出PEOz-Py 在 360 nm 處有一強烈吸收峰，顯示 PEOz 之末端官能基已由thioacetate 轉變為 2-pyridyldithio。

將陽離子高分子P(EOz-co-EI)與雙團聯共聚物 PEOz-b-p(EOz-co- EI)以甲醇溶解後測量其 UV 吸收光譜，結果如圖 4-7 所示。由於 p(EOz- co-EI)為 PEOz-Py 水解產物，所以末端仍保有官能基 2-pyridyldithio，

在波長 360 nm 時有吸收値，反之雙團聯共聚物由於經過 disulfide exchange 已沒有 pyridine 官能基，因此沒有吸收峰產生。

300 320 340 360 380 400

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Absorbance

Wavelength(nm)

PEOz-Py

PEOz-SAc

圖4-6. PEOz-Sac 與 PEOz-Py 在甲醇溶液下之 UV 吸收光譜 (溶液濃度為 1 mM)

300 320 340 360 380 400

圖4-7. P(EOz-co-EI)與雙團聯共聚物 PEOz-b-P(EOz-co-EI)在甲醇溶液下之 UV 吸收光譜 (溶液濃度為 0.5 mM) (FW 99)及ethylenimine的分子量(FW 43)與水解比例經計算而得。以 LI-76 為例，水解前分子量為 10000，重複單元有 101 個，而水解比

例為 76 % ，因此有 77 個 N-propionyl ethylenimine 與 24 個 ethylenimine，將各重複單元的數目乘上分子量相加後為 5700。

表4-4 為將 PEOz 3 與上述四種 P(EOz-co-EI)經 coupling reaction 後得到之雙團聯共聚物的分子量及 ethylenimine(EI)單體含量，因 PEOz 3 的分子量約 4kDa，故雙團聯共聚物命名如表中所示。

表4-2. PEOz 之數量平均分子量及分子量分佈 Polymer Mn. P.D.I.

PEOz 1 10000 1.12 PEOz 2 17000 1.20 PEOz 3 3600 1.18

表4-3. P(EOz-co-EI)之水解率及分子量 polymer Hydrolysis (%) Mn.

LI-76 76 5700 LI-89 89 5000 LII-76 76 9700 LII-88 88 8600

表4-4. PEOz-b-P(EOz-co-EI)之組成與分子量

copolymer PEOz Mn. EI content (%) Copolymer Mn.

4kI-76 3600 56 9300

4kI-89 3600 66 8600

4kII-76 3600 63 13300

4kII-88 3600 73 12200

此外將線性聚乙烯亞胺 LI-76 與雙團聯共聚物 4kI-76 以 0.5M NaCl 水溶液溶解後，分別注入以純水為流動相之 GPC 進行分析，得到如圖4-8 之層析圖。從圖中可看出 4kI-76 在層析管柱中之滯留時間 (retention time)比 LI-76 來的短，顯示 4kI-76 之分子量確實大於 LI-76 之分子量。

10 11 12 13 14

-50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

Response (mV)

Retention time (min)

LI-76 4kI-76

圖4-8. LI-76 與 4kI-76 之凝膠滲透層析圖

在文檔中聚唑啉/線性聚乙烯亞胺雙團聯共聚物製備奈米基因載體之研究 (頁 50-62)