4-3-1. 細胞毒性分析結果
基因載體除了須具備遞送核酸的能力外，亦要求不會對細胞造成 傷害，以免影響到細胞正常功能的表現或導致死亡。本研究用 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphe nyltetrazolium bromide) assay 來 試驗高分子材料所引發的細胞毒性，進而了解不同結構對細胞會造成 如何的影響。MTT Assay 或稱 Tetrazolium assay 是一般常用的細胞毒 性 試 驗 方 法 ，MTT 為 黃 色 水 溶 性 固 體 ， 可 被 細 胞 內 粒 腺 體 (mitochondria)中的去氫酵素(dehydrogenase)代謝，將 tetrazolium ring 切斷還原成紫色不溶性沈澱物formazan (3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyl-formazan)並堆積在細胞中，以 DMSO 溶解再測量 570 nm 吸光值 (O.D.) 可得到 formazan 產量的多寡。因活細胞才具有活性的 粒腺體酵素，故測得的吸光值會與活細胞數量成正比關係，因此利用 formazan 產量的多寡來評估細胞的存活率。活細胞代謝產生 formazan 之反應如圖4-23 所示：
MTT MTT formazan
Br
NAD
圖 4-23. 活細胞中 MTT 的代謝反應
圖 4-24 為 人 類 子 宮 頸 癌 細 胞 HeLa 在 分 別 含 有 B-PEI 與 P(EOz-co-EI)之培養基中培養 24 小時後得到的細胞存活率。結果顯示 B-PEI在濃度大於 0.1 mg/ml的存活率皆不超過 10 %，即使在 0.01 mg/ml的濃度之下，活細胞也僅有約 55 %，因此B-PEI具有相當高的 細胞毒性，其原因可能為B-PEI會造成細胞膜的破壞，使細胞死亡52。 P(EOz-co-EI)的細胞毒性明顯較B-PEI低，濃度在 0.1 mg/ml時四種高 分子的細胞存活率仍有 60 %以上。而細胞存活率與水解程度有密切 的相關性，水解比例較大則毒性也較高。可能由於所合成的分子量差 異不大，因此無法看出分子量對細胞存活率的影響。
將 P(EOz-co-EI)中毒性較低的 LI-76 與 PEOz-b-P(EOz-co-EI)對 HeLa 之細胞存活率作一比較，結果如圖 4-25。由圖中可看到在低濃 度下細胞皆有 90% 以上的存活率，但濃度高於 1mg/ml 時細胞存活 率明顯會受到雙團聯共聚物中 P(EOz-co-EI)鏈段之水解比例與分子 量的影響，水解率越高或分子量越大皆會使活細胞的數量減少。然而 雙團聯共聚物的細胞毒性不論是 4kI-76 或 4kII-88 皆低於 LI-76，其 中4kI-76 在 10 mg/ml 的濃度之下仍有 60 % 的細胞存活，相較於 LI-76 有兩倍的提升，顯示PEOz 可以有效降低 P(EOz-co-EI)之細胞毒性。
0.001 0.01 0.1 1 10 0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Cell Viability (%)
Polymer Concentration (mg/ml)
LI-76 LI-89 LII-76 LII-88 B -PEI
圖4-24. B-PEI 與 P(EOz-co-EI)在不同濃度下之 HeLa 細胞存活率 (n = 6)
LI-76 4kI-76 4kI-89 4kII-76 4kII-88 0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Cell Viability (%)
0.001 mg/ml 0.01 mg/ml 0.1 mg/ml 1 mg/ml 10 mg/ml
圖4-25. LI-76 與 PEOz-b-P(EOz-co-EI)在不同濃度下之 HeLa 細胞存 活率 (n = 6)
4-3-2. 轉染效率分析
螢火蟲的冷光基因被廣泛應用在基因載體的研究上，主要是由於 以下原因：
(1). 不需經轉譯後的修飾過程(post-translational processing)即可 直接被轉譯成具酵素活性的蛋白質，所以可立即得到報導基 因之活性。
(2). 在目前已知的化學發光(chemiluminescence)反應中，其可產 生最高量子效率的光產物，因此分析靈敏度非常高，並且在 宿主細胞中無背景冷光(background luminescence)的出現，不 會干擾定量分析的判讀。
(3). 此分析方法非常簡單、快速、省時，一個樣品僅需數秒就能 測量完成。
基於上述之優點，利用螢火蟲冷光基因來分析非病毒性載體的轉 染效率為目前在基因治療上最常用之方式。
通常轉染效率較高的基因載體會使細胞產生較多的蟲螢光酶，並 得到較大的冷光強度。冷光強度雖然與產生的蟲螢光酶數量成正比，
但於實驗的操作上並無法保證所有實驗細胞的數目完全相同，增生或 凋亡速率也一致，因此細胞產生的蛋白質總量可能也有所不同。為了 提供一個比較基準，冷光的強度必須除以總蛋白質的數量，才是真正 的轉染效率。
在轉染效率的測量上，冷光強度定量分析時依照市面上之蟲螢光 酶檢驗系統(Luciferase assay system)指示取轉染後之細胞萃取液作分 析，蛋白質的定量則以蛋白質染劑分析細胞萃取液中所含的蛋白質總 量。染劑的檢量線以胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)反應 10 分鐘測量波長 595 nm 的吸收度繪製，如圖 4-27 所示。
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
Absorbance at 595 nm
Concentration (mg/mL)
圖4-27. BSA 蛋白質濃度檢量線
本研究在轉染效率的分析上，DNA 的使用量固定為 5 μg，並分 別與 B-PEI、P(EOz-co-EI)及雙團聯共聚物混合配製成聚複合體，與 HeLa 共同培養 48 小時使細胞吞噬，再將細胞溶解並離心後取上清液 測量相對發光値(relative light unit, RLU)與蛋白質含量。圖 4-28 為 B-PEI 於不同 P/D 比之轉染效率以及細胞所產生的蛋白質含量，由圖
以線性聚乙烯亞胺 P(EOz-co-EI)和 PEOz-b-P(EOz-co-EI)分別對 HeLa 進行 Luciferase 基因的轉染，結果如圖 4-29 與圖 4-30 所示。由
圖4-29 中可看出 LI-76 和 LII-76 在 P/D 比為 12 倍時達到最高的轉染 效率，LI-89 與 LII-88 則為 10 倍，同時水解程度較大的 LI-89、LII-88 分別比 LI-76 及 LII-76 有較高的螢光產生量，但相對的蛋白質也較 少，然而不論水解的比例大小，蛋白質產量皆隨著高分子比例的增加 而有降低的趨勢。在雙團聯共聚物的部分從圖4-30 中可看到 4kI-76、
4kI-89、4kII-76、4kII-88 分別在 14X、12X、10X、8X 達到最大的螢 光量，同樣可看到水解程度對轉染效率有相關性，水解比例較大者皆 表現較強的轉染效率，在蛋白質產量方面，4kI-76 和 4kII-76 在任何 P/D 比中都差不多，4kI-89 和 4kII-88 雖然仍可見到下降的現象，但 比相對應的線性聚乙烯亞胺之降幅已較為緩和。
圖4-31 為將 DNA 直接對細胞進行轉染與各種高分子聚複合體的 最佳轉染效率與蛋白質產生量所作之比較，從圖中可看出DNA 的直 接轉染產生的效果相當低，與全部高分子有將近 1000 倍的差距，然 而卻有最高的蛋白質產量，顯示 DNA 對細胞所造成的影響不大。
B-PEI 的轉染效率最高，與高水解率的線性聚乙烯亞胺 LI-89 和 LII-88 都有相當高的基因轉染效率，也產生最少的蛋白質，對於線性聚乙烯 亞胺而言，在水解率相同的情況下，分子量對轉染效率沒有影響。雙 團聯共聚物 4kI-76 和 4kI-89 之最佳轉染效率分別與線性聚乙烯亞胺 LI-76 和 LI-89 相當，但 4kII-76 以及 4kII-88 則有降低的趨勢。因此 推測4kII-76 與 4kII-88 可能是由於外層的 PEOz 接近電中性或立體障 礙的關係，造成細胞吞噬的機率較低，而 4kI-76 與 4kI-89 則因為具 明顯的酸鹼應答性，使進入細胞的聚複合體能有效地將DNA 裸露出 來，進而提升了轉染效率。
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
0.5X 1X 2X 3X 4X 5X
100 1000 10000
Polymer/DNA (w/w)
RLU / ug Protein
RLU Protein
Protein (ug)
圖4-28. B-PEI 聚複合體之轉染效率及蛋白質產量 (n = 3)
0
RLU / ug Protein
Polymer/DNA (w/w) LI-76 (RLU)
LI-89 (RLU)
2X 4X 6X 8X 10X 12X 14X
LI-76 (Protein) LI-89 (Protein)
Protein (ug)
RLU / ug Protein
Polymer/DNA (w/w) LII-76 (RLU)
LII-88 (RLU)
2X 4X 6X 8X 10X 12X 14X
LII-76 (Protein) LII-88 (Protein)
Protein (ug)
圖4-29. P(EOz-co-EI)聚複合體之轉染效率及蛋白質產量(n = 3)
0
RLU / ug Protein
Polymer/DNA (w/w) 4kI-76 (RLU)
4kI-89 (RLU)
6X 8X 10X 12X 14X 16X 18X 4kI-76 (Protein) 4kI-89 (Protein)
Protein (ug)
RLU / ug Protein
Polymer/DNA (w/w) 4kII-76 (RLU)
4kII-88 (RLU)
2X 4X 6X 8X 10X 12X 14X
4kII-76 (Protein) 4kII-88 (Protein)
Protein (ug)
圖4-30. PEOz-b-P(EOz-co-EI)聚複合體之轉染效率及蛋白質產量(n = 3)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
DNA B-PEI LI-76 4kI-76 LI-89 4kI-89 LII-76 4kII-76 LII-88 4kII-88 1
10 1000 10000 100000
RLU / ug Protein Protein (ug)
圖4-31. DNA、P(EOz-co-EI) 及 PEOz-b-P(EOz-co-EI) 聚複合體最佳 轉染效率與蛋白質產量之比較 (n = 3)