雖病毒載體有優異的基因轉殖能力，但基於各種病毒自身的安全 及免疫問題，利用非病毒載體作為基因治療的工具有其必要性，因而 目前已發展出許多獨特的非病毒載體系統，其中以微脂粒與陽離子高 分子這兩種載體的研究最廣泛。在非病毒載體的研究中，所使用的核 酸 通 常 是 以 質 體DNA(plasmid DNA)為主，其上有一段報導基因 (reporter gene)，報導基因經轉錄及轉譯後所產生的蛋白質可透過簡易 的方式量側，因此可作為評估轉染效率的依據。微脂粒包覆DNA所 形成之複合物稱脂複合體(lipoplex)，陽離子高分子與DNA之複合物則 稱為聚複合體(polyplex)15。非病毒載體雖不如病毒的轉殖效率高，但 具有低毒性、低成本、穩定性佳、使用簡單、可大量製備、不會引起 免疫反應等諸多優勢，而透過利用病毒遞送基因的機制，改良非病毒 載體的結構以增加其轉染效果亦是可行的，因此在基因治療的應用上 具有無限的潛力。
2-2-1. 非病毒載體的轉染過程
非病毒載體要將基因自細胞外送至細胞核中進而表現出蛋白 質，牽涉到許多複雜的程序，包括：
1. 與細胞表面接觸
2. 內吞作用(internalization) 3. 進入核內體(endosome) 4. 自核內體脫離
5. 與載體分離 6. 進入細胞核
如圖 2-2 所示16，當脂複合體或聚複合體經由擴散作用至細胞 外，通常會與細胞表面的物質作用，以進入細胞內。細胞膜上有許多 的膜蛋白(membrane proteins)，包括醣蛋白(glycolproteins)和蛋白多醣 (proteoglycans)，這些帶負電的蛋白質可調控物質的進出。因此若複 合體帶有正電，與細胞膜接觸時會和這些蛋白質產生靜電作用，有利 於複合體進入細胞中。
圖2-2. 非病毒載體傳輸基因的過程16
複合體與細胞膜接觸後，會經內吞作用進入細胞，依不同的表面 性質，其作用的方式有液相胞飲(fluid phase endocytosis)及吸附胞飲 (adsorption endocytosis)。一般物質可透過液相胞飲進入細胞，因此不 論是不帶電或帶正電的複合體皆能以此方式到達細胞內，但帶正電的 複合體也可與膜蛋白產生作用，再以吸附胞飲的方式進入細胞中。
複合體藉由胞飲作用進入細胞後被包裹在核內體內，接著酸鹼值 會逐漸下降至pH 5.5 左右再與溶小體(lysosome)融合(fusion)，溶小體 內的酵素與酸性的環境會造成DNA 的分解，進而失去作用。因此複 合體要能成功的進行轉染，必須在核內體與溶小體融合前脫離，即使 非病毒載體具有保護DNA 不受外在環境影響的能力，還是需要逃出 溶小體才能達到轉染的目的。複合體進入細胞質後，要將所包覆的基 因釋出，被釋放的基因必須通過核孔(nuclear pore)進入細胞核中，經 過轉錄(transcription)與轉譯(translation)等程序最後產生標的蛋白質。
2-2-2. 微脂粒
微脂粒最初是在 1965 年，由 Bangham 等人將卵磷脂(lecithin)自 蛋黃中萃取出來，再使其分散於水中所發現。微脂粒為磷脂質分子所 組成的微小囊泡，此脂質為一兩性(amphiphiles)分子，即一端為親水 性的極性頭基，另一端為疏水性的長碳鏈，因此具有表面活性。兩性 脂質分子在水溶液中時，會因親疏水性產生規則排列，形成膠體粒 子，如微胞(micelle)，在不同的條件下(如濃度、溫度、分子構造等)，
其型態也各異。微脂粒具有中空的球型構造，是由一或數層脂質雙層 膜(lipid bilayer)所圍繞而成，此脂質雙層為兩磷脂質之疏水端向內聚 集，親水端裸露在外的層狀排列，與生物細胞膜類似，因此微脂粒可 作為細胞膜間作用與膜蛋白質的系統模式。
基於微脂粒的特殊結構，吸引科學家嘗試將其作為藥物載體，如 親水性藥物可被包覆在內部的水相環境中，油溶性藥物則負載於脂質 雙 層 中 ， 再 加 上 微 脂 粒 為 天 然 的 物 質 ， 具 有 良 好 的 生 物 相 容 性 (biocompatible)與生物可降解性(biodegradable)，所以被廣泛地運用於 藥 物 制 放 系 統 。 在 基 因 載 體 的 應 用 上 ，Loke利用陰離子微脂粒
(anionic liposome)來遞送反義寡核酸(antisense oligonucleotide)而得到 不錯的體外(in vitro)轉染效果，但陰離子微脂粒需要鈣離子的輔助以 增加包覆DNA的效率。另一方面，脂複合體進入細胞的主要途徑為 胞飲作用，由於溶小體內的酵素具有分解脂複合體的能力，因此複合 體 必 須 在 溶 小 體 融 合 前 脫 離 。Litzinger 等 人 以 DOPE(dioleoyl phosphatidylethanolamine)為基材形成酸鹼敏感性(pH sensitive)的微脂 粒來遞送基因17，DOPE在酸性環境下能和核內體的脂質雙層膜融 合，進而將DNA釋放至細胞質中，達到基因轉染的目的。然而，酸 鹼敏感型微脂粒在血漿或是血清中的安定性不佳，且能釋出的DNA 僅佔約10%，大部分的DNA仍會留在核內體中並遭到分解18。
在1987 年 Felgner 利用陽離子脂質 DOTMA(N-[1-(2,3-dioleoyl- oxy)propy1]-N,N,N-trimethyl ammonium chloride)所構成的微脂粒作為 基因載體，並對COS-7 等細胞株進行轉染，結果顯示陽離子微脂粒的 轉染能力優於其他的微脂粒19，因此目前微脂粒基因載體的研究皆以 陽離子微脂粒為基礎。陽離子脂質如DOTMA、DOTAP(1,2-dioleoyl- 3-trimethyl-ammonium propane) 、DOGS(diocta-decylamidoglycyl sper- 20
21、DOSPA(2,3-dioleyl-oxy-N-[2(spermine-carboxamido)ethyl]-N, mine)
N-di-methyl-1-propanaminium trifluoroacetate)等皆具有良好的基因傳 輸能力 (圖 2-3)，其中DPPE與DOSPA在單一分子上有多個胺基，因 而帶有較多的正電荷，對DNA的包覆力亦較好，對許多的哺乳動物 細胞有較高的轉染效率。但陽離子微脂粒在體外實驗中顯示出對細胞 有 很 強 的 毒 性 22 ， 容 易 與 血 液 中 的 白 蛋 白 (albumin) 、 GAG(glycosaminoglycan)產生凝集，以及抑制免疫反應的調節等，為 陽離子微脂粒在應用上必須謹慎面對的問題。
圖2-3. 各種脂質分子結構20
2-2-3. 陽離子高分子
陽離子高分子通常是聚胺(polyamine)或是單體含有胺基(amino group)的高分子，在特定的環境下，如pH値低於胺之pKa的水溶液中，
氮原子會因質子化(protonation)而帶有正電荷，能與DNA結構中帶負 電的磷酸根經靜電作用而形成聚複合體。圖 2-4 為各種常見的陽離子 高分子23，隨著結構以及分子量的不同，各種陽離子高分子有相異的 轉染能力。然而，即使是同一種高分子，在製備聚複合體的條件有所 改變，如高分子和DNA混合的順序、比例、均勻程度，高分子與DNA 溶液的濃度、離子強度，以及聚複合體的大小、電性、表面特性等，
皆會影響到最終的轉染效率。
圖2-4. 各種陽離子高分子結構23
DEAE-dextran(diethylaminoethyl-dextran)是最早用於基因治療上 的陽離子高分子。dextran是具水溶性的葡萄聚醣，其結構上有許多的 羥基(hydroxyl group)可供改質(見圖 2-4)。由於dextran分子不具任何胺 基提供帶正電的能力，因此必須將dextran上的羥基以化學反應取代為 DEAE(diethylaminoethyl) group，由於DEAE上的三級胺會帶正電，因 此可與DNA形成聚複合體。DEAE-dextran除了本身可當基因載體外，
有研究顯示在DEAE-dextran的幫助下，可提高腺病毒基因載體進入細 胞的效率約 45 倍24。Yamaoka等人發現帶電官能基DEAE與dextran的 比 例 會 影 響 聚 複 合 體 在 基 因 轉 染 上 的 表 現 ， 實 驗 結 果 顯 示 DEAE-dextran的細胞毒性隨著DEAE含量的減少而降低，轉染的效果 也跟著變差25。然而，DEAE-dextran的轉染效率低，細胞毒性高，以 及不具生物可分解性，使其在實際應用上倍受限制。
除了DEAE-dextran，另一種常用於基因載體的聚醣為chitosan。
chitosan是chitin去乙醯化(deacetylation)的產物，具有低毒性、良好的 生物相容性及生物可分解性，在食品及醫藥方面有廣泛的用途。
chitosan不同於dextran，其本身已具有一級胺的官能基(圖 2-5)26，因 此不需改質即可與DNA形成聚複合體。chitosan將DNA包覆住後，能 夠保護DNA不被核酸水解酵素(DNase)分解。文獻顯示27，chitosan的 分子量及帶正電的單體含量會影響聚複合體的性質。為了得到穩定的 聚複合體，帶電的單體必須佔有超過 65%的比率，而分子量在 30kDa 到170kDa之間，能得到最佳的轉染效果，若在 1.2kDa或分子量過大，
則 基 因 轉 染 表 現 不 佳 。 MacLaughlin 等 人 利 用 pH-sensitive endosomolytic peptide與聚複合體進行轉染，發現可增加基因的表現
28，顯示可能由於chitosan在pH5.5 下的緩衝能力(buffering capacity) 不 佳，使聚複合體要從核內體中釋放成為基因遞送上主要的限制。
圖2-5. Chitosan的化學結構26
PLL(poly(L-lysine))為目前運用最廣泛的一種陽離子高分子載 體，從結構上可視為氨基酸lysine的聚合物，因此具有良好的生物可 降解性(biodegradable)。在pH 7.4 下，PLL側鏈上的一級胺會帶正電，
提供充足的能力去包覆DNA，研究顯示在許多不同濃度的鹽溶液 中，PLL皆能與DNA形成聚複合體29。但PLL和DNA作用之後，可能 由於電性中和，使聚複合體變為疏水性，所以有凝集的傾向，且容易 吸附血液中的蛋白質，進而被免疫系統辨識並清除。除了會產生凝集 外，PLL本身具有相當的細胞毒性。PLL與DNA所形成的複合體經胞 飲作用後，會被侷限在核內體甚至溶小體內，因此通常會利用添加 chloroquine幫助聚複合體脫離核內體，來增加PLL聚複合體的轉染效 率30。雖然作用機制還不是很清楚，推測可能是因chloroquine具有在 核內體酸化的過程中，緩衝pH値下降的能力，同時也能幫助基因脫 離載體。