4-2-1 質體 DNA 複製與萃取
質體DNA是一種存在於細菌染色體外的獨立環狀DNA小分子，
可在宿主細胞中獨立進行複製(replication)，亦可以攜帶特定基因於宿 主細胞中表現。本研究採用蟲螢光酶(firefly luciferase)基因作為報導 基因，並鑲嵌在質體DNA pUHC-13-3 中，pUHC-13-3 大小為 5,160 個 鹼 基 對(base pair) (圖 4-9)。由於pUHC-13-3 具有抵抗抗生素 ampicillin的能力，以含有此質體DNA的大腸桿菌(E. coli)大量複製質 體DNA時，加入ampicillin可以殺死此菌株以外的細菌，確保萃取出 質體DNA的純度。菌株培養的時間控制在 16-18 小時，避免生長進入 平原期。質體DNA萃取出來以純水配成溶液後，測量OD260得到濃度 為0.174mg/ml，而OD260/OD280在 1.9-2 之間，顯示製備的質體DNA純 度很高。
圖4-9. 蟲螢光酶編碼質體(luciferase encoding plasmid) pUHC-13-3 之圖譜
4-2-2. 聚複合體膠體電泳分析
電泳(electrophoresis)技術是基於在電場作用下，帶電的顆粒會向 著其電性相反的電場方向移動，加以分離或區別不同的物質。帶電顆 粒可以經由解離作用或表面上吸附其他帶電質點所造成，諸如各種離 子，或是生物性大分子，如蛋白質、核酸、病毒顆粒、胞器等。電泳 分析則是利用被分析物處於電場環境中，所帶電荷多寡的不同，而使 得其在電場作用下具有不同的遷移速度來達到分析的目的。
電泳需有一介質，供作帶電顆粒泳動之場所，早期是在溶液中進 行，但溶液的擴散現象大，不利於結果的觀察。之後改用噴濕的濾紙，
但濾紙與分子間的吸引力大，導致摩擦力太大而發熱，會使分析物變 質。此外由於DNA 分子隨著鹼基對的增加，帶電量亦成比例增加，
使得DNA 分子不論長度均大約具相同的質量/電量比，因此並無法利 用帶電性的差異而將之分離。後來發展出膠體電泳法，其是以半固態 的膠体作為介質，不僅沒有在溶液下的擴散現象，產生的熱亦較少，
且隨膠體製作的濃度不同，會在膠體中產生不同的孔洞大小。在濃度 固定時，孔洞大小一致，則因大分子會移動的比小分子慢，所以可分 離不同大小的分析物。
因此利用膠體電泳可分析 DNA 的純度、型態及 DNA 與高分子 間包覆的緊密度，若DNA 因變性導致結構變化或聚複合體的形成都 可以由電泳結果來判斷。本研究使用洋菜膠(agarose gel)作為電泳的 介質，將洋菜膠體熱溶後再冷凝，洋菜膠會以氫鍵形成凝膠。DNA 在膠體中經ethidium bromide (EtBr)染色，EtBr 會嵌入 DNA 鹼基中，
以紫外線照射即放出螢光，可以肉眼觀察DNA 的位置。
聚複合體的特性會隨著高分子/基因混合時的重量比例不同而改 變，過少的高分子將無法中和DNA所具有的電荷，使整體偏向負電
性；反之聚複合體可能會因被未中和的高分子包覆在外層並帶有大量 的正電荷。因此本研究亦將高分子與DNA製備成多種不同高分子 /DNA重量比(P/D比)的聚複合體，並進行膠體電泳分析。在許多研究 中分子量 25kDa的B-PEI皆表現出較佳的轉染效率，且已經商品化而 容易取得，成為各種非病毒性基因載體在分析上的比較標準50，故本 研究亦以此高分子作為各項實驗中的參考對象。圖 4-10 為分枝聚乙 烯亞胺B-PEI與線性聚乙烯亞胺P(EOz-co-EI)聚複合體的電泳分析結 果。在B-PEI的電泳圖中上下分別為負極與正極，所以帶負電的DNA marker與質體DNA在電場作用下會從放置樣品的槽孔(slot)中往下方 跑。此外可看出質體DNA有 2 個帶狀條紋，分別是鬆弛 (relaxed)及 超螺旋(supercoiled)結構(圖 4-11)，質體DNA在細菌內多為超螺旋結 構，使佔有的體積較小，以節省空間，因此電泳時移動速度較快。與 DNA maker的位置比對後可知萃取出的質體DNA大約在 5,000 個鹼基 對左右，和所採用的種類pUHC-13-3 相符。
從圖 4-10，B-PEI 在 P/D 比為 0.5X 時仍有帶狀條紋，顯示可能 有尚未與 B-PEI 接觸的自由 DNA 分子存在，當 P/D 比為 1X 時沒有 任何的條紋產生，代表B-PEI 已將 DNA 完全包覆，使 EtBr 不能嵌入 DNA 鹼基中而無法觀察到螢光。LI-76 與 LI-89 分別需要 8X 和 6X 的高分子來達到包覆的效果，同樣 LII-76 和 LII-88 也是 P/D 比分別 在8X 和 6X 能將 DNA 完全包覆。B-PEI 在結構中有一級胺，在純水 中即質子化帶有大量正電荷，相較於 P(EOz-co-EI)有較高的電荷密 度，因此僅需少量的高分子就能與 DNA 作用。而 P(EOz-co-EI)在不 同水解比例下會帶有不同程度的正電荷，使基因包覆能力有所差異。
圖4-10. B-PEI 及 P(EOz-co-EI)聚複合體之膠體電泳分析 (圖中第一排 數字代表P/D 比)
圖4-11. 質體 DNA 的結構 (a) 鬆弛(relaxed) (b) 超螺旋 (supercoiled)
將雙團聯共聚物 PEOz-b-P(EOz-co-EI)聚複合體以電泳分析後結 果如圖4-12。從圖中可觀察到隨著高分子的量逐漸增加，聚複合體的 移動性慢慢降低，其原因可能是整體帶電性由負電漸漸轉為電中性所 致。結果顯示4kI-76、4kI-89、4kII-76、4k289 分別在 14X、12X、10X、
8X 時 能 完 全 包 住 質 體 DNA ， 因 此 對 於 雙 團 聯 共 聚 物 而 言 ， P(EOz-co-EI)鏈段的水解比例仍會影響到基因包覆能力。
圖4-12. PEOz-b-P(EOz-co-EI)聚複合體之膠體電泳分析 (圖中第一排 數字代表P/D 比)
4-2-3. 聚複合體粒徑與界面電位分析
為了能有效的進入細胞並進行轉染，聚複合體的結構要相當緊密 且粒徑需夠小，而當在生物體內遞送時，聚複合體的粒徑也會影響在 血液中的循環時間、於組織中的擴散、標的細胞的吞噬以及是否會被 肝臟或脾臟中內質網細胞所清除。此外在不同的環境中，聚複合體可 能會有不一樣的行為，導致粒徑的變化，進而造成在轉染效率上的各 種表現。聚複合體表面電荷對於與細胞之間的作用也有相當大的影 響；細胞膜上許多陰電性的蛋白質可以調控物質於細胞膜的進出，使 帶有正電荷的聚複合體能夠輕易的經由內吞作用進入細胞，反之則不 利於陰電性聚複合體的進入。但正電性的聚複合體有容易被蛋白質貼 附的缺點，因此電中性的聚複合體可能會具有較好的基因遞送效果。
本研究測試聚複合體在純水中以及與生理環境之鹽濃度相同的 0.15M NaCl水溶液中的粒徑大小和界面電位，以了解在不同溶液中聚 複合體的行為。圖4-13 為B-PEI聚複合體的分析結果，由圖中可以看 出隨著P/D比逐漸增加，在水中的聚複合體粒徑慢慢變小，當P/D為 2 時，聚複合體達到穩定的狀態且大小約 100 nm，與文獻所測量到的 大小相似51。界面電位亦隨P/D比的增加而越來越大，實驗結果顯示 帶有負電以及不帶電的聚複合體有較大的粒徑，可能是因為凝集的現 象所導致。但在0.15M NaCl溶液中，不論P/D比的大小，聚複合體的 粒徑皆大幅增加 2~3 倍，因此B-PEI聚複合體也會因溶液中的離子而 產生凝集。
同樣將 P(EOz-co-EI)分別以純水與 0.15M NaCl 溶液製備聚複合 體，並測量粒徑大小及界面電位隨 P/D 比的變化情況，結果如圖 4-14~4-17。從圖中可知所製備的聚複合體在純水中粒徑大約在 190 nm 左右，其中 LII-88 聚複合體具有較小的粒徑，大約為 170 nm。當
界面電位為負值或趨近於零時，聚複合體皆因凝集而有較大的粒徑，
但隨P/D 比的增加，界面電位在達到正值後，粒徑大小則變化不大，
顯示帶正電的聚複合體由於靜電排斥力的關係而形成穩定的狀態。於 0.15M NaCl 離子強度的溶液中，所有 P(EOz-co-EI)聚複合體皆有凝集 的現象，且不論 P/D 比的高低、水解程度與分子量，粒徑都約在