噬菌體呈現技術是利用噬菌體基因所呈現的蛋白質來跟目標蛋 白進行蛋白質之間的交互作用。隨著研究生命科學技術的層面進步與 噬菌體表現技術配合，對於分子生物的基礎研究、生物科技和臨床醫 學已經有廣泛的運用。噬菌體呈現技術可以用來進行尋找配位體、抗 原決定位（epitope）、單株抗體的 Fab 或是找出蛋白質功能性區域，
再生物藥學方面進一步可以開發藥物，或是製造疫苗、抗體等。
在本研究所要探討的是日本腦炎病毒蛋白，其在感染宿主細胞 時，其非結構蛋白 NS4A 與 NS4B 是否抑制第一型干擾素的反應。而其 NS4A 在感染宿主細胞時，是與哪個宿主細胞內的何種蛋白結合交互 作用來進行對宿主細胞下一個影響反應。
4.1 日本腦炎的抗干擾素作用
在先前的文獻報導(J.Viology 2004 Sep)指出，日本腦炎病毒可 以阻礙第一型干擾素的訊息傳遞，進而抑制干擾素反應，且主要抑制 現象，在於日本腦炎病毒可以阻撓細胞膜上的第一型干擾素接受器的 Tyk2磷酸激酶進行磷酸化的現象，進而使下游的stat無法磷酸化。而 再另外的文獻已經有發現，同屬黃病毒科內的西尼羅河病毒、黃熱病
毒、登革熱病毒的NS4B可以抑制訊息傳遞路徑的stat1磷酸化
(JOURNAL OF VIROLOGY, July 2005)。因此，本篇實驗第一部分主要 發現，日本腦炎病毒確實能夠抵抗第一型干擾素的反應。且在病毒先 感染細胞而後再進行干擾素的治療時，抑制的現象較為明顯。所以，
當已經確定日本腦炎病毒確實能夠抵抗第一型干擾素後，再構築能表 現日本腦炎非結構蛋白NS4A與NS4B的質體DNA，並穩定轉染進入細胞 (BHK-21與TE671)，使BHK-21及TE671細胞能夠穩定表現NS4A、NS4B，
再轉染ISRE啟動子的報導基因，進而藉由冷光值的高低來判別NS4A、
NS4B是否可以當作日本腦炎病毒對干擾素的抑制劑，我們發現在 BHK-21細胞中，病毒蛋白NS4A蛋白能夠非常明顯的抑制干擾素的反 應，而NS4B則較少；然而在TE671細胞中，病毒蛋白NS4A與NS4B其抑 制ISRE活性相差不多。
因此，當證明了 NS4A 可以抑制干擾素作用後，接下來研究的部 分主要是在於訊息傳遞的部份。主要在證明，穩定表現日本腦炎病毒 非結構蛋白 NS4A、NS4B 是否能夠藉由抑制干擾素接受器的磷酸激酶 磷酸化，來阻撓訊息傳遞，進而使 NS4A 及 NS4B，抗干擾素更加確定，
然而本篇實驗發現，病毒蛋白 NS4A 與 NS4B 可以降低細胞內 Stat2 的 磷酸化現象，藉以影響干擾素的訊息傳遞。所以，接下來的就是在病 毒感染細胞時，NS4A 與 NS4B 到底是與細胞內的何種蛋白質有交互作
用的現象。
4.2 NS4A 蛋白與細胞內蛋白的交互作用
經過六次不同日本腦炎病毒蛋白質濃度的噬菌體篩選，噬菌體已 有相當的篩選，但是還是進一步以 ELISA 實驗，所測的 OD 450nm 吸光 值高低來作為挑選噬菌體的依據。再將噬菌體 DNA 純化進行 PCR 後，
進行 PCR 產物的基因定序。將定序的結果從噬菌體開始表現人腦 cDNA 的位置開始進行轉譯，所得到氨基酸序列進行比對。所得大概為三種 蛋白，其一 100%序列相似者為所謂的 DEAD BOX43 蛋白，其主要功能 為類似 ATP 依賴的 RNA 的解旋酶；其二 100%相似者為 SNAP 蛋白，其 主要功能與蛋白質的運輸有關；其三為未知的蛋白(novel protein)。
本篇論文證明利用噬菌體表現找出的兩個蛋白質，是否與日本腦 炎病毒的 NS4A 有所交互作用。因此，將所挑選到的噬菌體表現在表 面蛋白基因序列接在 pET32a 載體上進行噬菌體蛋白質表現，再進行 純化。接著純化後的 NS4A 與純化後的 DDX 蛋白利用共同免疫沉澱-西 方墨點法來證明兩者之間確實有所交互結合作用的關係。進而構築噬 菌體表現在表面蛋白基因序列於 pDsRed 這個可以表現紅色螢光的載 體上；而 NS4a 則接在能表現綠色螢光蛋白(GFP)的載體
pcDNA3.1-EGFP 上。而這兩者以等量的核酸濃度，共同轉染進入細胞 內，於共軛焦顯微鏡下觀察是否兩者會座落於細胞同一個地方
(co-locolization)。而本論文也證明出，在 TE671 與 BHK-21 細胞中，
病毒蛋白 NS4A 與細胞蛋白 DDX43 在細胞內有 co-locolization 的現 象。
而未來研究計畫的部份：除了證明細胞內 DDX42 蛋白如果有過度 表現，若在病毒感染時，是否會影響病毒抵抗第一型干擾素反應，而 在 C 型肝炎病毒裡面已經被發現，C 型肝炎的 NS4A 蛋白可作為 NS3 蛋白的輔因子，而 NS3 蛋白裡有一段 Domain 亦為 DDX box，其中相 互關係也有待證明；還有日本腦炎病毒非結構蛋白 NS4B 與細胞因子 之交互作用的關係，藉由分子生物學及蛋白質體學的方法，證明病毒 蛋白 NS4A、NS4B 與細胞因子交互作用關係後，再探討這數種蛋白質 之間的關係。