2.2、實驗方法
將細胞平均培養於有蓋玻片放置的 6- well plate 槽內，隔天吸去 培養液，用 PBS 洗滌兩次去除殘留的培養液，以福馬林固定(fixing)，
3.2 鑑定與日本腦炎病毒非結構蛋白 NS4A 作用的細胞因子
3.2.1 日本腦炎病毒 NS4A 蛋白的質體構築
將 NS4a PCR 產物純化後，利用
EcoR
I 與Xho
I 的酵素作用切 位處理，再接到同樣切位的 pET24a 載體上，利用質體轉型進入大腸 桿菌(TOP 10)中進行質體選殖(fig 7)，抽取質體 DNA 後，經由限制酵素切割 DNA 反應 370C 3 小時，利用洋菜膠電泳，觀察切割之後的 DNA 片段(Fig. 8)。選殖到的質體轉型到能表現蛋白質的大腸桿菌
（BL21 DE3）中，進行大量蛋白表現。
3.2.2 日本腦炎病毒 NS4A 蛋白質大量表現及純化
能表現日本腦炎病毒 NS4A 蛋白的質體經由轉型到能表現蛋白 質的大腸桿菌（BL21 DE3）中，進行大量蛋白的過度表現，再經由 FPLC(IMAC,His-binding)將蛋白質純化回收。日本腦炎非結構蛋白 NS4A 為 92 個胺基酸所構成的蛋白質，經由西方墨點法（Western Blotting）確定得到約為 14 KDa 的 NS4A 蛋白質(Fig 9B)。亦可從 SDS-PAGE 利用考馬仕藍染劑染色，觀察 NS4A 蛋白質純化後的程度 (Fig 9A)。
3.2.3 以日本腦炎病毒 NS4A 重組蛋白進行噬菌體篩選
用 His-bind 的方法經由 FPLC 純化後所得的 NS4A 蛋白，coated 在 96 –well 上進行噬菌體的親和性篩選（affinity selection），
與 NS4A 蛋白具有高度結合力的噬菌體沖洗出來加到 BLT5403 細菌中 增殖放大再進行下一次的篩選(bio-panning)。經過至少六次（NS4A 蛋白濃度：20μg/ml）的噬菌體篩選，每次篩選過後都必須用噬菌體
蝕菌斑試驗(phage plaque assay)確定噬菌體的濃度是否足夠。而在 最後一次的噬菌體噬菌斑實驗中，選擇四十七個噬菌斑(Fig. 10)進 行噬菌體增值放大。隔天，離心取上清液的噬菌體做噬菌體酵素連結 免疫吸附分析(ELISA) (Fig. 11)，從 ELISA 試驗結果中挑選出 OD 450nm 吸光值較高十個噬菌體，將其所帶有人腦基因的片段經由 PCR 後，由 洋菜膠電泳觀察 PCR 片段大小(Fig. 12)。再將 PCR 產物定序，從噬 菌體開始表現人腦因子的位置轉譯成氨基酸序列，再將轉譯出的胜肽 序列在 NCBI 網站上進行比對，比對的結果可以分為兩群，結果得知 其中ㄧ群樣品 11. 23.37.39.43 為 DDX42(DEAD BOX)protein（表 1.1）
有高達 100%相似性，佔所挑選出的噬菌體中的十分之五，其序列主 要是在於 DDX42 蛋白的 C＇端的 Domain；另ㄧ群樣品 42.44.43 定序 為 SYNAPTOSOMAL-ASSOCIATED protein(SNAP25)有 91%相似性，佔所 挑選出的噬菌體中的十分之三；樣品 16.19 為未知的蛋白，帶有不同 人腦因子 cDNA 所表現的蛋白質序列。
3.2.4 Dead box42 蛋白的質體構築與純化
設計好帶有限制酶酵素切位的引子後，將噬菌體所帶有 DDX 基 因的片段經由 PCR 後(第 23 號樣品)，利用
BamH
I 和Hind
III 酵素 切割，再接合到同樣切位的 pET32a 載體上，，轉型進入大腸桿菌 BL21大量表現蛋白，其載體轉譯後所表現的蛋白會帶有約 20kDa 的 Tag fusion protein。而載體上帶有的 His tag 經由轉譯後，也可以利用 FPLC(IMAC,His-binding)將表現的蛋白質純化回收，利用 SDS-PAGE 考馬仕藍染色以及 western blotting 觀察 DDX42 蛋白純化的結果 (fig. 13A.B)。
3.2.6 人腦細胞蛋白 DDX42 protein 與病毒蛋白 NS4A 共同免疫沉澱
為了證明經由噬菌體表現所得的人腦細胞帶蛋白 DDX42，其是 否與日本腦炎病毒的非結構蛋白 NS4A 有所交互作用，因此利用共同 免疫沉澱法證明之。實驗分為實驗組與對照組，實驗組主要是觀察 DDX 是否與病毒蛋白 NS4A 有交互作用的情形；而對照組主要是排除 載體 pET32a 上帶有 Thioredoxin 的 fusion protein 會與病毒蛋白 NS4A 結合。在實驗中利用抗體(NS4A 蛋白上的 T7 tag)作用經過共同 免疫沉澱，再用西方墨點法觀察。結果顯示，從西方墨點法可以觀察 到在實驗組中的 pellete 裡含有 NS4A 蛋白和 DDX42 蛋白，則表示兩 蛋白質有交互作用的現象(fig.14 ,lan3 lan4 )；在對照組中可以明 顯觀察到，病毒蛋白與載體上的 fusion protein 與病毒蛋白 NS4A 分 別分布在 pellete 與上清液中，表示兩者彼此之間無交互作用
(fig.14 ,lan1 lan2 )。
3.2.7 共同轉染質體觀察細胞內蛋白質交互作用的關係
將日本腦炎病毒蛋白 NS4A 接合到可以產生綠色螢光蛋白的載 體 pcDNA3.1-EGFP，經過質體選殖(Fig.15)轉型進入大腸桿菌(TOP 10) 中；在將細胞蛋白 DDX42 接合到可以產生紅色螢光的 pDsRed 載體上，
經過質體選殖(Fig. 16)轉型進入大腸桿菌(Top 10)中。抽取兩種細 菌的質體後，以相同濃度共同轉染進入 BHK-21(Fig. 17A)和
TE671(Fig. 17B)細胞，利用共軛焦顯微鏡(confocol)觀察之。觀察 結果發現，在不同的兩種細胞中，紅色螢光的 DDX 蛋白與綠色螢光的 病毒蛋白 NS4A 會坐落在相同的位置，融合後產生明顯的黃色結果 (Fig. 17)。
3.2.8 過度表現 DDX42 的 BHK-21 細胞，抵抗日本腦炎病毒抑制第一 型干擾素反應
將 BHK-21 細胞單層平鋪培養在 6-well 盤中，再共同轉染
pDsRed-DDX，pISRE-luc 及 pRunilla-luc(5：5：1) ，以 Runilla 作 為 internal control，，隔天分盤於 24-well 盤。將細胞分為先感
染病毒後治療干擾素，以及先治療干擾素後感染病毒兩組。先感染病 毒：感染病毒一小時後，再治療第一型干擾素四小時，再測冷光值。
結果顯示，以β干擾素來治療有 DDX42 過度表現的 BHK-21 細胞，在 先感染日本腦炎病毒後治療干擾素的實驗中，可以明顯發現細胞受到 日本腦炎病毒的感染，其第一型干擾素反應沒有被抑制，反而因為病 毒感染而促進干擾素生成，其 ISRE 活性所表現的冷光值升高
(Fig.18A )；而在先治療第一型干擾素而後再感染病毒的實驗中，並 無發現沒有十分明顯的升高的現象(Fig. 18B)。