日本腦炎抵抗干擾素反應即訊息傳遞的機制

3.1.1 日本腦炎病毒感染後，可以抑制第一型干擾素反應 將 BHK-21 細胞單層平鋪培養在 6-well 盤中，再共同轉染 pISRE-luc 及 pRunilla-luc(9：1) ，以 Runilla 作為 internal control，，隔天分盤於 24-well 盤。將細胞分為先感染病毒後治療 干擾素，以及先治療干擾素後感染病毒兩組。先感染病毒：感染病毒 一小時後，再治療第一型干擾素四小時，再測冷光值。結果顯示，無 論是以α-干擾素或是β干擾素來治療 BHK-21 細胞，在先感染日本腦 炎病毒後治療干擾素的實驗中，可以明顯發現細胞受到日本腦炎病毒 的感染，可以抵抗第一型干擾素的治療。其 ISRE 活性所表現的冷光 值被抑制(Fig. 1B)；而在先治療第一型干擾素而後再感染病毒的實 驗中，可以發現第ㄧ型干擾素受到日本腦炎病毒感染，卻沒有十分明 顯的抑制現象(Fig. 1A)。

3.1.2 日本腦炎病毒 NS4a、NS4b DNA 重組的質體構築

第一步先將日本腦炎 T1P1 病毒株進行病毒增殖放大，再用病毒 蝕斑試驗測試病毒濃度效價(Fig.2)，從病毒液中抽取出日本腦炎病

毒的 RNA，進行反轉錄進而得到病毒的 cDNA。利用反轉錄所得的 cDNA 進行聚合酶連鎖反應(PCR)，用 NS4a-forward、NS4a-Reverse 及 NS4b-forward、NS4b-Reverse 的引子（primer）進行 PCR。將 PCR2 的產物進行 DNA 純化後，利用

EcoR

Xho

選殖到的質體轉型到大腸桿菌（Top 10）中，大量增殖細菌表現 DNA。

抽取大量細菌的質體，進行質體 DNA 的純化。

3.1.3 細胞內表現日本腦炎病毒 NS4a、NS4b 蛋白

將質體 DNA pcDNA3.1，pcDNA3.1-NS4a，pcDNA3.1-NS4b 分別轉 染近 BHK-21 細胞與 TE671 細胞。載體上有 neomycin resistance 基 因，因此可以利用 G418 加入細胞培養液中篩選細胞。經過約 20 天的 篩選，將細胞培養於含玻片的 6-well 盤，進行細胞免疫染色，以抗 日本腦炎的老鼠血清作為第一級抗體，所得細胞免疫染色法的結果 為，有轉染 pcDNA3.1-NS4a，pcDNA3.1-NS4b 的 BHK-21 與 TE671 細 胞經過免疫染色法後，於螢光顯微鏡下觀察可見到強烈的綠色螢光 (Fig. 3)。接下來再將細胞收取下來，進行免疫沉澱的實驗來濃縮細 胞中質體表現的蛋白。利用 cell lysis buffer(含蛋白酶抑制劑)溶 解細胞，加入 anti-Xpress(1:100)於 4^OC 隔夜，而以 protein A 作用

後的沉澱物進行西方墨點法檢測蛋白，可發現 BHK-21 細胞(Fig. 4A) 及 TE671 細胞(Fig. 4B)中日本腦炎病毒非結構蛋白 NS4A 及 NS4B 蛋 白的表現。

3.1.4 JEV-NS4A 與 JEV-NS4B 降低 ISRE 啟動子的活性

將穩定表現日本腦炎病毒非結構蛋白 NS4A 及 NS4B 的 BHK-21 及 TE671 細胞，培養於 6-well 盤中。將 pISRE-luc 及 pRunilla-luc 以 9：1 的比例轉染進入細胞中，而 Runilla 作為 internal control。

可以發現在 BHK-21 細胞中，穩定表現 NS4A 蛋白的細胞，加入 3000 U/ml 的α-干擾素後其 ISRE 啟動子的活性抑制的比例高達約 105%，

而加入 3000 U/mlβ-干擾素後其 ISRE 抑制比例約 60%；但穩定表現 NS4B 蛋白的細胞，再加入α/β-干擾素後，其 ISRE 活性抑制程度約 10~20%(Fig. 5A)。在 TE671 細胞中，穩定表現 NS4A 蛋白其抑制 ISRE 活性的程度約 30~40%；而 NS4B 蛋白抑制α-干擾素程度約 30%，β-干擾素受到的抑制程度大約 45%(Fig. 5B)。

利用 VSV 病毒可誘發細胞產生第一型干擾素的特性，將表現日本 腦炎病毒非結構蛋白 NS4A 及 NS4B 的 BHK-21 細胞以 pISRE-luc 及 pRunilla-luc 以 9：1 的比例轉染進入細胞中，而後再感染 VSV 病毒

(MOI=5)36 小時。可以發現在 BHK-21 細胞中，穩定表現 NS4A 及 NS4B 蛋白的細胞可以有效抑制 VSV 病毒感染時，所誘發的干擾素(Fig.

5C)。

3.1.5 JEV-NS4A 與 JEV-NS4B 藉由降低 STAT2 磷酸化來阻撓干擾素 的訊息傳遞

將穩定表現日本腦炎病毒非結構蛋白 NS4A 及 NS4B 的 TE671 細 胞培養於 75T-flask，培養至 7 分滿時再加入 3000 U/ml 的干擾素-α/β ，反應半小時後刮取細胞，離心後將沉殿的細胞加入 lysis buffer，再以西方墨點法檢測 stat2 磷酸化的情形。結果發現，TE671 細胞內穩定表現 NS4A 及 NS4B 蛋白，Stat2 磷酸化的程度明顯降低許 多(Fig. 6)。因此，日本腦炎病毒的 NS4A 及 NS4B 蛋白可以藉由降低 Stat2 的磷酸化，來阻饒第一型干擾素的訊息傳遞。