Phage clone No

OD405nm

圖 11 利用 ELISA 偵測篩選後的噬菌體對日本腦炎 NS4A 蛋白質的親和性

NS4A 蛋白質經過六次噬菌體篩選後，隨意挑取 phage plaque assay 上的 47 個噬菌體蝕斑來放大，利用 anti-his taq 的抗體以 ELISA 實驗進行分析，利用吸光值(OD405)高低來檢測所挑選出所選取的單一嗜菌體與目標蛋白 NS4A 的親合性。

Fig. 12

M 11 16 19 23 37 39 42 43 44 45 M

圖.12 噬菌體表現人腦細胞蛋白之cDNA 進行序列分析

噬菌體與NS4A蛋白質進行ELISA後，挑選ELISA試驗中，十個OD450nm吸 光值較高的噬菌體，將噬菌體DNA抽出，利用T7 select primer進行PCR。

在DNA電泳後觀察到噬菌體載體所帶有的人類腦細胞cDNA片段大約從 300 bp到1000bp的大小。經過定序之後，將DNA序列在NCBI的資料庫中 比對，發現Sample 11.23 .37.39.43 為 Dead box protein，Sample 42.44.45 為 SNAP protein，Sample 16.19為novel protein。

Fig. 13 A.

圖 13A 用 IMAC(His-binding)經由 FPLC 純化 NS4A 蛋白

因所構築的 pET32a 質體 DNA 表現蛋白時，在蛋白的 C 端會帶有 Trx tag 及 His-tag，利用 His-binding 方法可以純化在大腸桿菌大量表現的 DDX protein。再利用 SDS-PAGE 約 38kDa 的 DDX43 結合 Trx 的蛋白

37kDa

16kDa

11kDa

Fig. 13 B.

圖.13B 以西方墨點法鑑定經FPLC純化後DDX蛋白。

將500ml加入IPTG的菌液於16℃培養五小時，經離心及超音波震盪後再 離心，將上清液通過含有鎳離子的親和性管柱。再用100mM imidazole、

400mM imidarzole沖洗管柱。得到大小約為37KDa的DDX43人腦細胞蛋 白。此圖為western-blot檢測純化後的蛋白

37kDa

Fig. 14

Lan 1 為 Marker；Lan 2 為 NS4A+Trx pellete， Lan 3 NS4A+Trx sup.；

Lan 4 NS4A+DDX pellete，Lan 5 為 NS4A +DDX sup.

10kDa

Fig. 15

圖 15 pEGFP-NS4a 轉型於大腸桿菌後質體之選殖

將 NS4a 與載體 pEGFP 接合後，利用熱休克(Heat shock)方法使大腸桿 菌因質體 DNA 轉型。將轉型後的大腸桿菌培養於培養基中，挑選 4 個菌 落進行 colony PCR，經由洋菜膠電泳，可以觀察到 398 base pair 的 NS4a 片段

398 bp

Fig. 16

圖 16 pDsRed-DDX 轉型於大腸桿菌後質體之選殖

將 DDX 與載體 pDsRed 接合後，利用熱休克(Heat shock)方法使大腸桿 菌因質體 DNA 轉型。將轉型後的大腸桿菌培養於培養基中，挑選 16 個 菌落進行 colony PCR，經由洋菜膠電泳，可以觀察到 432 base pair 的 DDX 片段

432 bp

Fig. 17 A. BHK-21

圖 17A 共軛焦顯微鏡觀察病毒蛋白 NS4A 與細胞蛋白於 BHK-21 胞內之交互作用關係

將可以表現綠色螢光的 NS4A 質體 pEGFP-NS4A 或是單獨質體 pEGFP，以 及可以表現紅色螢光的 DDX 質體 pDsRed-DDX，以相同比例共同轉染進入 BHK-21 細胞，在利用共軛焦顯微鏡觀察蛋白在細胞內分佈的情形。結果 發現，DDX 與 NS4A 在細胞內可以結合形成黃色光；而 DDX 與單獨質體表 現卻不能有融合現象，表示細胞蛋白 DDX 與病毒 NS4A 蛋白在細胞內有 co-locolization 的現象。

pEGFP-empty vector

pEGFP-NS4a

pDsRED-DDX

pDsRED-DDX

merge

merge

Fig. 17

B TE671

圖 17B 共軛焦顯微鏡觀察病毒蛋白 NS4A 與細胞蛋白於 TE671 胞內之交互作用關係

將可以表現綠色螢光的 NS4A 質體 pEGFP-NS4A 或是單獨質體 pEGFP，以 及可以表現紅色螢光的 DDX 質體 pDsRed-DDX，以相同比例共同轉染進入 TE671 細胞，在利用共軛焦顯微鏡觀察蛋白在細胞內分佈的情形。結果 發現，同 Fig 17B DDX 與 NS4A 在 TE671 細胞內亦可以結合；而 DDX 與 單獨質體表現也不能有融合現象，表示在 TE671 細胞蛋白 DDX 與病毒 NS4A 蛋白在細胞內有 co-locolization 的現象。

pEGFP-NS4a pDsRED-DDX merge

pEGFP-empty vector pDsRED-DDX merge

Fig. 17

A. B.

圖 17 過度表現 DDX42 蛋白的 BHK-21 細胞感染日本腦炎病毒 時，治療 α/β-干擾素，對 ISRE 活性的影響

先將 pDsRed-DDX、pISRE-luc 報導基因、 pRunilla-luc 共同轉染 進入 BHK-21 細胞，(A)先感染日本腦炎病毒而後治療干擾素四小時。可 以發現，細胞先受到日本腦炎病毒的感染，再治療干擾素時，可以使 β-干擾素誘發的 ISRE 啟動子活性明顯升高許多。而對照組 pDsRed-empty vector 則冷光值下降。(B) 先治療干擾素兩小時後再感染病毒兩小時，

Relative luciferase activity for pISRE-luc cis-acting system

0

Relative luciferase activity for pISRE-luc cis-acting system

DDX42

pDsRed-empty vector DDX42

pDsRed-empty vector