2.2、實驗方法
將細胞單層培養於 6- well plate 約 6-7 成滿，再共同轉染 pISRE-luc 及 pRunilla-luc 兩種報導基因質體。隔天以 trypsin 將細胞
重新懸浮，平均分於24- well plate。待細胞穩定貼附於 well 中，分別 加入干擾素(INF-α/β)，四小時後以 PBS 清洗三次，加入 Lysis buffer 100 μl (Sigma)反應 20 分鐘，吸取 lysis 後的細胞上清液 20 μl 加入96-well，再加入 luciferase substrate 100 μl (sigma) ，偵測冷光值。
之後加入stop solution100 μl (sigma)再次偵測冷光值。
2.2.18 噬菌體的生長與儲存（Growth and Storage of Bacteriophage T7 ）
先將BLT5403的大腸桿菌劃在含Ampcillin抗生素的培養基 中，隔夜，挑單一個菌落搖菌，37℃ 培養箱培養到OD600nm值到 0.6~1 後加入噬菌體，持續搖晃培養到有細菌溶解發生，就可以離心收集上 清液，分管儲存。每管加入1/10體積的80%glycerol在-80℃ 冰箱保存。
2.2.19 測定噬菌體的效價（phage titer determination）
將噬菌體做序列稀釋，取適當濃度噬菌體 100 μl 加到 250 μl
BLT5403 菌液混合均勻，再加上約 55℃的 Top agar 3ml 搖晃一下，
未凝固前迅速倒在 plate 中。37℃培養二到三小時後噬菌斑產生後計 數噬菌斑（plaque）的數目。(圖 2.1)
2.2.20 噬菌體篩選（bio-panning）
將欲實驗的日本腦炎病毒蛋白溶於 coating buffer，且蛋白質濃 度調整5μg/ml，分注各 100μl 於 30 孔的 96 well ELISA 測試盤中，三 種濃度各兩盤，於4℃靜置隔夜，未進行 bio-panning 的 plate 先置於 4℃ 備用，倒去孔內液體。分別在每個孔加入 100μl 的 5% 脫脂牛奶
在室溫中搖晃一個小時進行blocking。倒掉 blocking 的牛奶用 1 X TBST 200μl，清洗七分鐘各三次。在只有牛奶的 well 加入噬菌體在 室溫中搖晃三十分鐘。比例分三區（80μl phage / 40μl phage+ 40μl TBST / 20μl phage+ 60μl TBST）之後再將噬菌體加到相對的 well 在 室溫中搖晃三十分鐘。再用1X TBST 200μl，清洗七分鐘各五次。加 入濃度100μg/ml 的相同蛋白質溶液進行 elution 在室溫中搖晃三十分 鐘。將沖洗下來的噬菌體加到10ml BLT5403 E.coli / 50ml 離心管。
搖到有看到細菌溶解，就可以離心收上清液。其篩選流程如下頁圖示。
2.2.21 噬菌體酵素連結免疫吸附分析（phage enzyme-linked immunosorbent assay）
經過六次噬菌體篩選後，將最後一次噬菌體篩選的噬菌體進
行效價測定（phage plaque assay），從噬菌體溶菌班中挑選 50 管的噬 菌體，各以5mlM9TB 培養液， 37℃培養隔夜後，離心 8000rpm 15 分鐘收集上清液。將噬菌體coated 在 96 well 的 ELISA plate，4℃靜 置隔夜或37 ℃ 1 小時 (10μl/well 的 phage 加 90μl/well 的 coating buffer)。到掉上清液，加 5%脫脂牛奶，每一個 well 200μl，室溫中搖 晃一個小時。再以 1 X TBST 200μl，清洗七分鐘各三次。在每個孔
中加入蛋白質樣本濃度約20μg/ml，100μl，室溫中搖晃一個小時。之 後以1X TBST 100μl/well, 室溫中清洗七分鐘各三次。加第一次抗 體，anti-his Ab ( 1μl/ml TBST , 100μl / well ) 室溫中搖晃一個小時。
之後以1X TBST 100μl/well,室溫中清洗七分鐘各三次。加第二次抗 體anti-mouse Ab – peroxidase ( 1μl/ml TBST , 100μl / well ) 室溫中搖 晃一個小時。之後以1X TBST 100μl/well,室溫中清洗七分鐘各三次.
接著加入TMB solution（50μl / well）約四十分鐘。到顏色有改變，
加入stop solution（50μl / well ）立刻測 OD 450nm 吸光值不可超過三 十分鐘。
2.2.22 噬菌體 DNA 製備（ Rapid purification of phage sequencing templates）
經過噬菌體酵素連結免疫吸附分析，挑出十六個OD 450nm 吸光值 反應較高的噬菌體依上述方法進行增殖。第一次離心後取含噬菌體上 清液1ml到新的1.5ml離心管，加入200 μl (PEG2000/ 2.5M NaCl)混合 後，室溫中搖晃一小時。離心,10K rpm十分鐘，小心的完全去掉上清 液，將沈澱物溶於200 μl 二次水中，再加入200 μl phenol/ chloroform。
離心12,000 rpm 十五分鐘。取上清液 150μl 加入300μl ethanol。在室 溫中靜置十分鐘。離心,10,000 rpm 十 分鐘，小心的完全去掉上清液
用70% ethanol清洗沈澱物置於室溫中晾乾，再加入50 μl 二次水。之 後將噬菌體DNA進行PCR或是進行定序反應。
2.2.23 噬菌體蛋白質-酵素連結免疫吸附分析（phage protein- enzyme linked immunosorbent assay）
將噬菌體篩選出的所表現的胜肽序列接到 pET32a 載體上進行 蛋白質表現並純化。一組先將相對應的日本腦炎病毒蛋白coated 在 96 well 的 ELISA plate 的一半，另一半加入 BSA (濃度 20μg/ml, 100μl/well 的)，4℃靜置隔夜或 37 ℃ 1 小時。隔天，到掉上清液，加 5%脫脂牛奶，每一個 well 200μl，室溫中搖晃一個小時。再以 1 X TBST 200μl，清洗七分鐘各三次。之後，兩組各加入序列稀釋的噬菌 體胜肽蛋白( 100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、10-1μg/ml、10-2μg/ml、
10-3μg/ml , 100μl / well ) 室溫中搖晃一個小時。之後以 1X TBST 100μl/well,室溫中清洗七分鐘各三次。加第抗體 anti-S protein
Ab –HRP ( 1μl/ml TBST , 100μl / well ) 室溫中搖晃一個小時。之後以 1X TBST 100μl/well,室溫中清洗七分鐘各三次. 接著加入 TMB solution（50μl / well）約四十分鐘。到顏色有改變，加入 stop solution
（50μl / well ）立刻測 OD 450nm 吸光值不可超過三十分鐘。
2.2.24 共同免疫沉澱法（Co-immunoprecipitation）
在每組試管加入蛋白質，取其中一個蛋白質的專一性抗體 3 μg，加 TSET buffer 使總體積至 300 μl，在 4℃混合作用 4 小時，接 著加入 50 μl (5 mg)的 protein A-Sepharose beads 懸浮液。接著於 4℃
下旋轉作用1 小時，在 4℃10,000 rpm 離心 20 秒鐘，去上清液。以 TSET buffer 洗一次，NET buffer 洗三次，每次沖洗均以 10,000 rpm 離心20 秒，並去上清液。加入 2X sample loading buffer 50 μl，混勻 後在100 ℃加熱 5 分鐘後迅速置於冰上，離心 10,000 rpm，20 秒鐘，
取上清液進行SDS-PAGE 電泳。
2.2.25 共同轉染免疫螢光染色法(confocal immunofluorescence
assays)將細胞平均培養於有蓋玻片放置的 6-well plate 槽內，培養至隔 天，使細胞約六成滿。再把可以產生綠色或紅色螢光的質體，利用 AI Transfection Kit 共同轉染進入細胞內，其轉染技術與前述相同。
36-48 小時後，以 PBS 小心清洗，再以試鏡紙吸乾 PBS。再將蓋玻片 慢慢傾斜貼附於載玻片上，蓋玻片的四周圍以指甲油固定。指甲油乾 燥後再以共軛焦顯微鏡(Leisa TCS SP2)觀察之。