固定化技術

固定化的概念始於 1916 年，Nelson 和 Griffin 發現到一種萃取自酵 母的酵素，可被骨碳粉所吸附並仍保持其原有活性；此種現象引起了學 者們注意，並開始著手於固定化方法之研究。1960 年代以後，各國皆積 極 地 進 行 酵 素 固 定 化 的 研 究 ， 但 當 時 固 定 化 產 物 稱 為 不 溶 性 酵 素

（insoluble enzyme），直到 1971 年在美國舉行第一次酵素工程會議，才 正式將名稱統一為固定化酵素（immobilized enzyme）。

所 謂 固 定 化 技 術 就 是 利 用 物 理 或 化 學 方 法 將 酵 素 固 定 於 載 體

（carrier）或是擔體（support）之上；或是把酵素分子相互鍵結在一起 卻仍保有酵素活性的方法。透過此項技術製備出的固定化酵素，具以下 特點：

(1) 有效地提升酵素之安定性。

(2) 固定化酵素回收容易，並且可重複使用。

(3) 可連續式操作。

酵素固定化經化學方法的程序，可能會造成酵素部份活性損失，原 因為化學法之操作條件較為極端，當酵素固定於載體上，載體會產生位 阻現象導致質量傳送問題，為需克服與改進的要點。

2.3.1 固定化方法

固定化方法可依據固定化原理的不同來區分。圖 2-8 整理了目前已 發展的固定化方法，可分為以下三大類型：

(1) 擔體鍵結型（carrier-binding method）：

A. 物理吸附法（physical adsorption method）：

此原理為利用凡得瓦爾力、親疏水作用、氫鍵及偶極矩吸引等作用 力，將酵素吸附於載體之上。其優點為操作簡便且不會影響酵素構形，

但由於吸附鍵結力較弱，酵素容易在操作過程中而脫附。

B. 離子鍵結法（ionic binding method）：

離子鍵結法是藉由酵素與載體之間相反電荷所形成的靜電吸引力

（Electrostatic attraction），而達到固定化的作用。此方法程序簡易，且 比物理吸附更為牢固。但必須維持系統之離子強度、pH 值、溫度及適 當的緩衝液，以防止酵素自載體脫落。

C. 共價鍵結法（covalent binding method）：

目前發展共價鍵結合的方式有二種類型，一種為酵素與載體直接以 單一鍵結方式結合的型式；另一種為載體先接一個結合肢（spacer）再 與酵素進行鍵結的型式。共價鍵結法的優點為鍵結力強，酵素不易脫 落，然而固定化條件較為嚴苛且過程複雜，易造成酵素結構改變且損失

(2) 交聯法（cross-linking method）：

交聯法是透過雙或多官能基的反應劑與酵素相互交聯，聚合成不水 溶性之高分子。此方法的優勢為不需載體即可固定，操作簡便；由於交 聯過程會導致大量酵素損耗，且形成孔洞直徑極小導致質傳阻力的問 題，使得交聯法之應用並不廣泛。

(3) 包埋法（entrapping method）：

此技術的特點是將酵素包埋於具有網狀結構的膠體顆粒或是微膠 囊內。由於此種方法所形成的基材孔洞大小，通常會使反應基質受到限 制，產生質傳問題造成酵素與基質反應效果不佳。

以上所述之方法各有其特點，因此可根據酵素性質與載體特性，選 擇適合之固定化方法予以應用，比較此五種方法之優缺點如表2-6 所示。

圖2-8 固定化方法之一般分類法（陳國誠，2000）

表2-6 固定化方法之特性比較表（陳國誠，2000）

性質 物理吸付法 共價鍵結法 離子鍵結法 交聯法 包埋法

製備難度 易 難 易 難 易

失活可能 小 大 小 大 小

結合強度 弱 強 弱 強 強

再生可能 可 不可 可 不可 不可

對象範圍 中等 狹隘 中等 中等 廣

固定成本 低 高 低 低 中

2.3.2 固定化酵素之性質

當酵素經過固定化程序後，所製備出固定化酵素的性質相較於自由 酵素會產生活性可能降低與安定性提升的差異，其主要因素為酵素的構 形改變。由於酵素固定於載體之上，載體為酵素創造一種新的微環境

（microenvironment），但也對酵素產生之位阻現象（steric hindrance），

而影響酵素與基質間的界面作用。此種位阻現象使得基質不能自由的擴 散到所有的酵素分子內（呂鋒洲、林仁混，1991）；另一方面，酵素分

之改變。如果載體是陰電性的話，固定化酵素最適 pH 值可能會往鹼的 方向偏移；若是陽電性的話，則往酸的方面偏移（Goldstein et al., 1973）。

雖然固定化程序對酵素造成部份特性上的變化，固定化酵素安定性 往往優於自由酵素，主要原因在於酵素被固定後，受到蛋白質分解酵素

（protease）或是環境影響機會降低；同時位阻現象亦能保護固定化酵素 之構形，避免酵素失活。

2.3.3 固定化酵素之安定性

酵素經固定化程序後提升了其安定性為固定化酵素優勢之一，安定 性的提升可使固定化酵素操作於更嚴苛且複雜的反應條件，有助於提高 酵素製程的應用價值性。目前造成酵素失活絕大部份是溫度因素，通常 酵素於高溫下容易發生構形改變，即所謂的部份展開現象（partial unfolding）；若酵素分子鍵結於固體載體之上，其分子結構與游離酵素 相比較可更加牢固，使得固定化酵素較不易受到環境因素影響，而發生 失 活 現 象 如 圖 2-9 所示。有文獻指出將酵素多點連接（multipoint attachment）於載體之上，能增強酵素穩定性（Martinek et al., 1977）；其 中影響固定化之主要變因，有固定化的時間、pH 值、溫度、緩衝液種 類及抗化劑等，選擇最適條件下進行固定化有助於酵素結構之穩定性提 升（Mateo et al., 2007）。

對於共價鍵結類型的固定化酵素，造成酵素失活的變因除了熱之 外，還包括有機溶劑與嗜水性等。因此可透過固定化酵素的安定性來辨 別，是否適合此類型固定化方法，其中包含熱安定性、pH 安定性、保 存安定性和操作安定性等，這些都是在酵素經固定化程序後所需要被研 究的重要變因（邱少華，2003）。

圖 2-9 酵素熱展開失活之概念圖（Martinek et al., 1977）